III. UJI TETRAZOLIUM

A. Pendahuluan

1. Latar Belakang

Benih yang diharapkan petani adalah benih yang memiliki viabilitas

benih dan vigor yang tinggi. Viabilitas dan vigor benih merupakan salah

satu parameter yang perlu dipertimbangkan sebelum benih disimpan,

didistribusikan dan ditanam. Uji viabilitas benih memberikan informasi

kemampuan berkecambah suatu benih pada suatu kondisi tertentu. Uji

viabilitas dapat dilakukan dengan pengecambahan benih dan mengamati

daya kecambah dan kecepatan kecambahnya.

Salah satu metode yang digunakan untuk menduga kualitas benih

adalah uji tetrazolium (TZ). Uji tetrazolium bertujuan dalam mengaktifkan

sel/jaringan benih dan membedakan antara sel atau jaringan yang hidup

atau mati. Uji tersebut sangat cepat dan tepat apabila diaplikasikan pada

benih yang yang mengalami dormansi dan mengalami pemasakan lanjutan

(after ripening).

Pengujian tetrazolium merupakan cara pengujian viabilitas benih

secara cepat dan bersifat tidak langsung (Quick Test). Zat kimia yang

digunakan adalah 2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Kloride (garam

tetrazolium), zat ini dapat diserap oleh benih. Jaringan benih yang hidup,

garam tetrazolium akan mengalami reduksi secara enzimatik sehingga

timbul senyawa formazan yang berwarna merah cerah sehingga dengan

adanya praktikum ini kita dapat menguji viabilitas benih secara tepat dan

tidak langsung serta benih hidup atau benih mati.

2. Tujuan Praktikum

Tujuan dari praktikum acara III Uji Tetrazolium adalah untuk

menguji viabilitas benih secara tepat dan tidak langsung.

28

29

B. Tinjauan Pustaka

Uji tetrazolium disebut juga uji biokhemis benih dan uji cepat viabilitas.

Uji biokhemis dikarenakan uji tetrazolium mendeteksi adanya proses biokimia

yang berlangsung di dalam sel-sel benih khususnya sel-sel embrio. Uji cepat

viabilitas dikarenakan indikasi yang diperoleh dari pengujian tetrazolium

bukan berupa perwujudan kecambah, melainkan pola-pola pewarnaan pada

embrio, sehingga waktu yang diperlukan untuk pengujian tetrazolium tidak

sepanjang waktu yang diperlukan untuk pengujian yang indikasinya berupa

kecambah. Kegunaan uji tetrazolium antara lain untuk mengetahui viabilitas

benih yang segera akan ditanam, viabilitas benih dorman, hidup atau matinya

benih segar tidak tumbuh dalam pengujian daya berkecambah benih

(Vega 2011).

Metode pendugaan mutu fisiologis benih dapat dilakukan melalui

metode langsung dan tidak langsung. Metode langsung menggunakan

indikator pertumbuhan kecambah, benih dikecambahkan pada kondisi ideal,

dilakukan di germinator, rumah kaca atau areal persemaian selama jangka

waktu tertentu (uji resmi). Metode tidak langsung didasarkan pada proses

metabolisme serta kondisi fisik yang merupakan indikasi tidak langsung,

disebut juga uji cepat viabilitas (Zanzibar 2009).

Metode uji cepat berkorelasi tinggi terhadap uji langsung. Uji cepat atau

uji tetrazolium umumnya diaplikasikan pada beberapa kondisi seperti benih

yang harus segera ditabur atau ditanam, benih dengan dormansi kuat dan

lambat berkecambah, keterbatasan jumlah benih serta permintaan konsumen.

Apabila benih harus menggunakan uji resmi atau tidak langsung (melalui

proses perkecambahan) maka benih akan cepat mengalami kerusakan

(Bonner 2006).

Prinsip metode tetrazolium adalah setiap sel hidup akan berwarna merah

oleh reduksi dari suatu pewarnaan garam tetrazolium dan membentuk endapan

formazan merah, sedangkan sel-sel mati akan berwarna putih. Enzim yang

mendorong terjadinya proses ini adalah dehidrogenase yang berkaitan dengan

respirasi. Kelebihan metode tetrazolium meliputi waktu pengujian yang

30

singkat, sangat tepat diaplikasikan pada benih yang mengalami dormansi serta

benih yang mengalami pemasakan lanjutan (after ripening), tingkat ketelitian

tinggi, sedangkan kelemahannya memerlukan keahlian dan pelatihan yang

intensif, bersifat laboratoris, tidak dapat mendeteksi kerusakan akibat fungi

atau mikroba lainnya dan bersifat merusak (Byrd 2005).

Salah satu faktor yang sangat berpengaruh dalam uji tetrazolium adalah

evaluasi pola topografi perwarnaan untuk menentukan benih viable dan

non-viable. ISTA sebagai organisasi pengujian benih internasional yang diakui

kredibilitas dan metodenya digunakan di seluruh dunia mendefinisikan benih

viable adalah benih yang memperlihatkan potensi untuk menjadi kecambah

normal, sedangkan benih non-viable adalah terdiri dari benih yang

berkembang secara abnormal baik pada embrio maupun pada struktur penting

lainnya dan menunjukkan jaringan yang mati (Kartasapoetra 2005).

C. Metodologi Praktikum

1. Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum acara III Uji Tetrazolium dilaksanakan pada hari Kamis,

17 Oktober 2013 pukul 13.00 - 15.00 WIB bertempat di Laboratorium

Ekologi dan Manajemen Produksi Tanaman, Fakultas Pertanian,

Universitas Sebelas Maret Surakarta.

2. Alat dan Bahan

a. Alat

1. Kertas pH meter

2. Gelas piala

3. Petridish

4. Oven

b. Bahan

1. Benih jagung (Zea mays)

2. Benih kacang tanah (Arachis hypogaea)

3. Garam tetrazolium

4. KH2PO4 dan Na2HPO4.2H2O

31

3. Cara Kerja

a. Merendam benih padi dalam larutan KNO3 1%, 2%, 3%, 4% dan

HNO3

b. Membuat larutan penyangga dengan cara melarutkan 9,078 g KH2PO4

dan 11,876 g Na2HPO4.2H2O (masing-masing dalam 1000 ml air)

c. Mencampurkan 400 ml larutan pertama dan 600 ml larutan kedua

d. Melakukan test pH larutan dengan pH meter

e. Melarutkan 10 g garam tetrazolium dalam larutan penyangga

f. Membelah benih yang telah direndam melalui embryonic axis dan

kemudian merendam dalam larutan garam tetrazolium tersebut sampai

0,5 atau 1 jam dalam temperatur 400°C dalam oven

g. Mencuci benih dan melakukan pengamatan, menghitung benih yang

viabel maupun yang non viabel dengan pewarnaan dari lembaga

h. Menggambar struktur benih beserta bagian-bagiannya.

4. Pengamatan yang Dilakukan

a. Warna embrio setelah direndam dalam larutan garam tetrazolium

b. Benih yang hidup dan mati.

32

D. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

1. Hasil Pengamatan

Tabel 3.1 Hasil Pengamatan Uji Tetrazolium pada Benih Jagung (Zea mays) dan Kacang Tanah (Arachis hypogaea)

Benih Ulangan Gambar Warna Keterangan

Jagung (Zea mays)

1 Merah Cerah Viable

2 Merah Cerah Viable

3 Merah Cerah Viable

Kacang Tanah (Arachis hypogaea)

1Merah Jambu

Viabilitas Lemah

2Merah Jambu

Viabilitas Lemah

3Merah Jambu

Viabilitas Lemah

Sumber: Laporan Sementara

2. Pembahasan

Tetrazolium merupakan uji biokimiawi yang membedakan jaringan

hidup dari jaringan mati embrio biji dengan dasar aktivitas enzim

dehidrogenase (enzim respirasi). Saat perlakuan hidrasi biji, efektivitas

enzim dehidrogenase meningkat yang menyebabkan pelepasan ion

hidrogen, yang menurunkan larutan garam tetrazolium tak berwarna

(2,3,5-trifenil tetrazolium klorida) menjadi senyawa kimia warna merah

yang disebut formazan. Formazan menunjukkan sel-sel yang hidup dengan

33

warna merah, sementara yang mati tidak berwarna. Uji tetrazolium

memungkinkan untuk dapat membedakan bagian sel hidup yang berwarna

merah dan bagian sel mati yang tidak berwarna. Posisi dan ukuran daerah

yang berwarna dan tidak berwarna pada embrio atau endosperm dapat

ditentukan apakah benih tersebut digolongkan sebagai viable atau non-

viable (Kuswanto 2009).

Struktur benih jagung ialah kulit biji, endosperm, embrio dan

radikula, sedangkan struktur benih kacang tanah ialah kulit biji, hipokotil,

epikotil, kotiledon, hilum, plumula dan radikula serta jaringan-jaringan

penghubungnya. Berdasarkan struktur benih tersebut, maka uji pewarnaan

tidak hanya dilakukan pada bagian luar benih tetapi juga pada bagian

dalam kotiledon. Benih yang viabel yaitu benih yang ujung radikula,

bagian penghubung antara radikula dan kotiledon, bagian penghubung

antara radikula dan hilum serta bagian dalam kotiledon tidak membentuk

spot berwarna merah muda.

Viabilitas benih merupakan kemampuan benih yang mampu

berkecambah dalam kondisi normal. Viabilitas benih dapat dilakukan

dengan melakukan uji tetrazolium. Uji tetrazolium memiliki fungsi sebagai

uji viabilitas benih yang dapat dilakukan cepat dan tidak langsung. Uji ini

dikatakan cepat karena uji ini menggunakan indikator warna dalam

mengetahui viabilitas benih. Namun dikatakan tidak langsung karena pada

uji viabilitas tidak diketahui apakah benih ini tumbuh normal atau

abnormal. Larutan tetrazolium (2,3,5 – triphenyl tetrazolium klorida atau

bromida) digunakan sebagai indikator untuk menunjukkan proses biologis

yang terjadi di dalam sel hidup (McDonald 2006).

Prinsip metode tetrazolium adalah setiap sel hidup akan bewarna

merah oleh reduksi dari suatu pewarnaan garam tetrazolium dan

membentuk endapan formazan merah, sedangkan sel-sel mati akan

berwarna putih. Enzim yang mendorong terjadinya proses ini adalah

dehidrogenase yang berkaitan dengan respirasi. Kelebihan metode

tetrazolium meliputi waktu pengujian yang singkat, sangat tepat

34

diaplikasikan pada benih yang mengalami dormansi serta benih yang

mengalami pemasakan lanjutan, tingkat ketelitian tinggi, sedangkan

kelemahannya memerlukan keahlian dan pelatihan yang intensif, bersifat

laboratoris, tidak dapat mendeteksi kerusakan akibat fungi atau mikroba

lainnya dan bersifat merusak.

Berdasarkan hasil pengamatan tabel 3.1 hasil pengamatan uji

tetrazolium pada benih jagung (Zea mays) dan kacang tanah

(Arachis hypogaea) menunjukkan bahwa benih jagung pada ulangan

pertama sampai ulangan ketiga memiliki warna merah cerah yang berarti

benih tersebut viabel. Benih kacang tanah pada ulangan pertama sampai

ketiga memiliki warna merah jambu yang berarti benih tersebut

viabilitasnya lemah atau rendah. Kandungan asam lemak tidak jenuh pada

benih kacang tanah cukup tinggi, yaitu terdiri atas 6% asam palmitat, 2%

stearat, 44% asam oleat, dan 48% asam linoleat. Kedua asam lemak tidak

jenuh (oleat dan linoleat) ini mudah teroksidasi, baik secara spontan

maupun enzimatis, yang dapat menurunkan viabilitas benih. Berdasarkan

hasil pengamatan tersebut dapat disimpulkan bahwa benih jagung lebih

viabel daripada benih kacang tanah.

Indikator warna pada benih pada uji tetrazolium memungkinkan kita

untuk membedakan antara jaringan hidup yang berwarna merah dengan

jaringan mati yang tidak berwarna. Membedakan antara benih merah tua

dan tidak berwarna yaitu benih rusak dan benih mati. Hal yang dapat

membedakan antar benih rusak dan benih mati adalah saat benih ini

dikecambahkan. Benih yang rusak akan berkecambah namun abnormal,

dan benih mati adalah bila dikecambahkan tidak dapat tumbuh, sedangkan

benih normal adalah benih yang berkecambah secara normal.

E. Kesimpulan dan Saran

1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan dapat diperoleh

kesimpulan sebagai berikut:

35

a. Uji tetrazolium merupakan cara pengujian viabilitas benih secara

cepat dan bersifat tidak langsung (Quick Test)

b. Uji tetrazolium meningkatkan aktivitas enzim dehidrogenase dan

melepaskan ion H+ yang dilepaskan pada proses respirasi agar dapat

mereduksi garam tetrazolium yang tidak berwarna dan terjadi reaksi

yang membentuk endapan formazan yang berwarna merah

c. Benih jagung pada ulangan pertama sampai ulangan ketiga memiliki

warna merah cerah yang berarti benih tersebut viabel

d. Benih kacang tanah pada ulangan pertama sampai ketiga memiliki

warna merah jambu yang berarti benih tersebut viabilitasnya lemah

atau rendah

e. Benih jagung lebih viabel daripada benih kacang tanah

2. Saran

Saran yang dapat diberikan pada praktikum acara ini adalah alat dan

bahan yang digunakan sebaiknya ditambah agar pengamatan dapat

dilakukan oleh tiap kelompok.

36

DAFTAR PUSTAKA

Bonner 2006. Tree Seed Technology Training Course, Instructors Manual, General Technical Report SO 106. US Department of Agriculture. New Orland: Southern Forest Experiment Station.

Byrd HW 2005. Pedoman Teknologi Benih (Terjemahan). Mississipi: State College.

Kartasapoetra AG 2005. Teknologi Benih (Pengolahan Benih dan Tuntunan Praktikum). Jakarta: PT. Raja Grafindo Persada.

Kuswanto 2009. Principles of Seed Science and Tecnology. Minnesota: Burgess Publ. Co.

McDonald 2006. Seed Moisture and the Equilibrium Seed Moisture Content Curve. J. Seed Technology 1(29): 7.

Vega 2011. Struktur dan Tipe Perkecambahan. http://veganojustice.wordpress.com. Diakses pada tanggal 28 Oktober 2013.

Zanzibar M 2009. Kajian Metode Uji Cepat Sebagai Metode Resmi Pengujian Kualitas Benih Tanaman Hutan di Indonesia. J. Standardisasi Badan Standarsasi Nasional 11(1): 38-45.