ZIMOGRAFI

(UJI AKTIVITAS ENZIM SELULASE, AMILASE, XYLANASE, LACCASE)

DISUSUN OLEH:

SITTA NOOR FATMAWATI 24030110120019

SISKA WURI SUNDARI 24030110141017

NYKEN HERLYNA 24030110141032

RESTI PUTERI UTAMI 24030110141018

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS DIPONEGORO

SEMARANG

2013

I. PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang

Zimografi adalah teknik elektroforesis untuk menetapkan aktivitas enzim secara

insitu. Berbeda dengan SDS-PAGE, gel pemisah zimografi mengandung substrat enzim yang

akan dihidrolisis oleh enzim selama masa inkubasi. Enzim dipisahkan dalam gel denaturasi

(SDS), namun dalam kondisi tidak tereduksi. Penambahan detergen Triton X-100 akan

melepaskan SDS sehingga protein kembali melipat (renaturasi). Cara ini hampir sama

dengan teknik silver staining, yaitu menggunakan gel poliakrilamida yang dikombinasikan

dengan SDS. Perbedaannya terletak pada penambahan substrat pada gel elektroforesis. Pada

pembuatan gel untuk zimogram, komposisi gel ditambahkan dengan 1% substrat bircwood

xylan dengan tujuan protein yang mengandung enzim xylanase akan mendegradasi substrat

xylan yang ditambahkan sehingga molekul protein yang memiliki aktivitas tampak sebagai

pita bening. Metode zimografi bersifat mudah, sensitif, dan kualitatif dalam menganalisis

aktivitas enzim (Leber & Balkwill 1997).

Hingga saat ini, analisis zimografi keratinase masih menggunakan gelatin sebagai

substrat. Gelatin adalah protein yang diturunkan dari kolagen. Keratin, elastin, dan kolagen

adalah protein fibrosa/serat yang banyak terdapat di alam. Keratin dan gelatin keduanya

mengandung banyak residu glisin namun gelatin larut dalam air. Penggunaan gelatin sebagai

substrat dalam teknik zimografi cukup bervariasi, pada bakteri termofilik L-23 (Lintang

2003) dan S. albidoflavus (Bressolier 1999) digunakan 2% gelatin sedangkan pada F.

Pennavorans 0.1% (Friedrich & Antranikian 1996).

I.2. Tinjauan Pustaka

I.2.1. Degradasi Keratin

Laju dan kesempurnaan degradasi keratin oleh mikroorganisme sangat bergantung

pada jenis substratnya, dan hal ini erat berkaitan dengan kandungan sistin. Substrat yang

sering digunakan untuk mempelajari aktivitas hidrolisis keratinase adalah bulu ayam (Riffel

et al. 2003a, Thys et al. 2004, Toni et al. 2002, Werlang & Brandelli 2005, Zerdani et al.

2004), rambut manusia (Takami et al. 1992, Macedo et al. 2005), bulu sapi (Riffel et al.

2003b) dan wool (Ignatova et al. 1999, Huang et al. 2003).

Pada fungi keratinolitik, konsentrasi rendah glukosa (0.1%) dan sedikit suplementasi

asam amino, pepton atau ekstrak kamir mungkin akan memacu pertumbuhan saat fase awal.

Namun nutrisi terlarut dengan konsentrasi tinggi akan menghambat hidrolisis substrat keratin.

Degradasi keratin dalam medium cair ditandai dengan dilepaskannya produk-produk

hidrolisis ke dalam medium. Produk utama adalah peptida berberat molekul satu hingga dua

kilodalton, akan tetapi ditemukan juga asam-asam amino bebas dan protein berberat molekul

tinggi. Indikator terbaik terjadinya keratinolisis adalah peningkatan pH medium (sedikitnya

mencapai pH 8.0) yang menggambarkan penggunaan protein keratin, deaminasi, dan

produksi amonia (Kunert 2000). Akumulasi produk metabolit yang mengandung sulfur juga

ditemukan dalam medium cair.

I.2.2. Enzim

Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai biokatalis dalam sel hidup. Enzim

telah banyak digunakan dalam bidang industri pangan, farmasi dan industri kimia lainnya.

Dalam bidang pangan misalnya amilase, glukosa-isomerase, papain, dan bromelin, sedangkan

dalam bidang kesehatan contohnya amilase, lipase, dan protease. Enzim dapat diisolasi dari

hewan, tumbuhan dan mikroorganisme. Kelebihan enzim dibandingkan katalis biasa adalah :

dapat meningkatkan produk beribu kali lebih tinggi; bekerja pada pH yang relatif netral dan

suhu yang relatif rendah; dan bersifat spesifik dan selektif terhadap subtrat tertentu.

K1K2

K3Enzim + substrat Kompleks Enzim + Produk

Kesetimbangan untuk pembentuk adalah :

Km = [ ][ ]

[ ]

Dengan Es adalah kompleks enzim substrat, E adalah enzim, S adalah substrat , dan Km

adalah tetapan kesetimbangan (Azmi, 2006).

II. METODOLOGI

Gel elektroforesis dan zymogram xilanase mentah Poliakrilamida gel elektroforesis

(SDS-PAGE) dilakukan pada 12,5% denaturing gel poliakrilamida dengan metode Laemmli

(1970). Modifikasi adalah inkubasi sampel protein dengan buffer sampel pada 50C selama

10 menit, bukan 100 C selama 2-5 menit (Blanco et al., 1997). Sampel dielektroforesis pada

gel menggunakan mini protean II (BioRad) sistem, Sebuah protein berbagai penanda

(Promega) digunakan untuk penentuan berat molekul. Protein diwarnai dengan 0,1% (b / v)

Coomassie biru R (Fluka) di 50% (v / v) metanol, 10% (v / v) asam asetat.

Untuk analisis zymogram, sampel enzim kasar yang dielektroforesis seperti di atas

pada SDS-PAGE mengandung xilan (0,1%). Setelah berjalan, gel dicuci empat kali selama

30 menit dalam 100 mM dapar fosfat (pH 7,0), dua yang pertama mencuci mengandung 25%

(v / v) isopropil alkohol, untuk menghapus SDS dan protein renature dalam gel. Gel

kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu 37C sebelum berendam dalam Kongo Red

solusi untuk 5 menit pada suhu kamar dan mencuci dengan 1 M NaCl sampai pewarna

berlebih telah dihapus dari band yang aktif. Zymogram disiapkan setelah merendam gel di

asetat 0,5% larutan asam. Latar belakang berubah biru tua, dan zona yang bening diamati di

daerah yang terkena aktivitas xylanase (Nakamura et al., 1993).

II.1. Analisis SDS-PAGE dan zimografi

Kombinasi antara elektroforesis gel poli-akrilamida dengan detergen SDS digunakan

untuk memisahkan dan meneliti jumlah dan ukuran bobot molekul rantai protein dan rantai

subunit protein. Sementara itu, elektroforesis dengan teknik zimografi juga merupakan

bertujuan mendeteksi aktivitas enzim proteolitik secara langsung.

Tahapan kerja pada analisis SDS-PAGE dan zimografi meliputi: penyiapan gel pemisah

dan penahan, penyiapan sampel dan pemuatan, kondisi running, pewarnaan gel, dan

pelunturan warna.

II.1.1 Penyiapan gel pemisah dan penahan

Metode zimografi, sampel dilarutkan ke dalam bufer yang tidak mengandung isomer-

kaptoetanol dan tidak memerlukan pemanasan. Tiap sampel dimuat ke dalam sumur gel

dengan kisaran volume 1020 L, sedang-kan volume LMW yang digunakan sebanyak 5 L,

dengan menggunakan plasmin sebagai standar.

Pada zimografi, setelah elektroforesis, gel didenaturasi terlebih dahulu dalam larutan

Triton X-100 2.5% (v/v) sambil digoyang selama 1 jam. Kemudian gel ditempatkan dalam

bufer fosfat 50 mM pH optimum selama 30 menit. Gel diwarnai dengan larutan pewarna

commassie brilliant blue R-250) selama 15 menit. Pelunturan warna gel dilakukan dengan

peluntur berulang kali sampai diperoleh pita enzim proteolitik putih dengan latar gel biru.

Pembuatan gel pemisah 12% dan gel penahan 4% untuk zimografi dilakukan dengan

komposisi yang tertera pada Tabel 1.

Tabel 1 Komposisi gel pemisah dan gel penahan

untuk SDSPAGE dan zimografi Pereaksi

Gel pemisah 10 %

(ml)

Gel

penahan

4%

SDSPAGE Zimografi

Larutan A 1670 1670 0.67

Larutan B 1250 1250

Larutan C 1.25

Kasein 5% 1.00

Fibrinogen 1% 1.00

Trombin 0.10

Albumin 0.1% 1.00

Gelatin 0.1% 1.00

Akuades 2080 2080 3.00

Amonium persulfat 100 100 0.05

TEMED* 10 10 0.005

Total 5.00 5.00 5.00

Alat dan Bahan

Alat

- Kamar elektroforesis

- Glass plate

- Klem bingkai

- Sisir penanda

Bahan

- Gelatin

- Larutan Akrilamida

- Tris

- SDS 10%

- Distilled water

- Buffer

- Triton X 100

- Trikloro asetat

- Buffer Kolagenase

- Larutan pewarnaan

Cara kerja

- penambahan gelatin pada 1,5 M Tris pH 8,8

- penambahan akrilamida 30%

- Penambahan SDS 10%

- Penambahan gliserol 50%

- Penambahan amonium per sulfat 10%

- Penambahan TEMED

- Pencampuran

- Penambahan distilled water

- Penambahan akrilamid 30%

- Penambahan Tris 1M pH 6,8

- Penambahan SDS 10%

- Penambahan amonium per sulfat 10%

- Penambahan TEMED

- Pencampuran

Larutan Pemisah

Gelas beker

Hasil

Gel Penahan

Gelas beker

Hasil

Penuangan Gel

(1) Pembersihan glass plate

(2) Pemasangan pada klem

(3) Penandaan pada glass plate

(1) (2)

(3)

(4) Tuangkan gel pemisah hingga batas tanda.

(5) Tambahkan sedikit distilled water

(6) Biarkan selama 20-30 menit agar gel terpolimerisasi

(7) Keringkan distilled water dengan kertas saring

(7)

(8) Tambahkan gel penahan di atas gel pemisah pada glass plate

(9) Pemasangan sisir penanda dalam gel penahan dan biarkan selama 20 menit

(9)

Preparasi Sampel

- Pencampuran sampel protein dengan gel loading buffer

Prosedur zimografi

1. Leppaskan gel dari klem dan pasangkan pada perlengkapan gel

2. Masukan dalam kaset dan kunci

3. Letakkan kaset dalam tank

4. Masukkan buffer pada tank

5. Lepaskan sisir dengan hati-hati

6. Masukan sampel pada lubang dalam gel

7. Nyalakan listrik dan atur voltase pada 150 mV dan biarkan selama 1 jam.

8. Buka gel dan masukan dalam 50 ml triton x 100 dan diinkubasi selama 5 menit pada

shaker

9. Buang larutan triton x 100 dan masukan 100 ml buffer kolagenase, shaker selama 5

menit

10. Buang buffer kolagenase dan tuangkan asam trikloroasetat pada gel inkubasi selama

30 menit pada shaker

11. Buang asam trikloroasetat dan tambahkan zat warna, biarkan selama 30 menit

12. Tuangkan larutan destaining dan biarkan sampai terbentuk pita bening.

1. Zimografi pada Xilanase

Xilanase merupakan kelompok enzim yang memiliki kemampuan menghidrolisis

hemiselulosa dalam hal ini ialah xilan atau polimer dari xilosa dan xilooligosakarida.

Xilanase dapat diklasifikasikan berdasarkan substrat yang dihidrolisis, yaitu xilosidase,

eksoxilanase, dan endoxilanase (Subramaniyan & Prema 2002; Richana 2002).

Pemecahan sempurna xilan memerlukan aktivitas sinergis beberapa enzim hidrolitik

(hemiselulase), yaitu endo1,4xilanase, xilosidase, glukuronidase, L

arabinofuranosidase dan asetilesterase. Endo1,4xilanase dapat memecah kerangka dasar

struktur xilan, sehingga merupakan enzim kunci dalam proses depolimerisasi xilan

(Subramaniyan & Prema 2002).

Selama dekade terakhir ini, potensi bioteknologi dari aplikasi xilan dan xilanase telah

menjadi perhatian utama dari para peneliti karena aplikasinya yang praktis dalam bidang

industri seperti : memproduksi dan mendaur ulang kertas, meningkatkan digestibilitas

makanan ternak, industri makanan dan minuman, meningkatkan kualitas roti, industri tekstil,

produksi biopharmaceutika (Beq et al. 2001; Richana 2002).

Data pemurnian enzim yang diperoleh melalui elektroforesis tidak selalu

menunjukkan daya katalitik enzim sebenarnya karena adanya kontaminan, isoenzim, atau

enzim lain dari kelas yang sama. Kekurangan ini dapat diatasi dengan meneliti aktivitas

enzim sesudah elektroforesis gel. Zimogram merupakan cara menganalisa aktivitas kitinolitik

yang sederhana, sensitif, dapat dikuantisasi dan fungsional (Leber dan Balkwil, 1997). Pada

dasarnya terdapat 2 model teknik zimogram. Model pertama menggunakan substrat yang

terikat pada bahan penahan berupa gel, kertas saring, lembaran plastik, atau lapisan substrat

langsung. Pada model kedua, indikator diikatkan secara kuat pada gel pemisah dimana enzim

subjek dibuat inaktif selama elektroforesis dan diaktifkan kembali setelah elektroforesis.

Substrat yang digunakan untuk zimogram harus bersifat kromogenik,kromoforik, atau hasil

reaksi enzim dengannya dapat diwarnai (Peach et al., 1993).

Zimogram adalah salah satu teknik elektroforesis yang digunakan untuk

mengidentifikasi aktivitas enzim yang dipisahkan dalam gel poliakrilamida. Secara

keseluruhan, prinsip teknik zimogram yang dilakukan sama, yaitu penggunaan substrat

kitinase yaitu glikol kitin yang disertakan dalam gel pemisah poliakrilamid, penggunaan

buffer renaturasi agar protein melipat kembali dan diberi kesempatan untuk menghidrolisis

substrat pada kondisi yang tepat, inkubasi gel dalam buffer dengan pH optimum enzim. Gel

divisualisasi dengan congo red dan adanya aktivitas enzim ditunjukkan oleh daerah bening

dimana substrat telah didegradasi (Kleiner dan Stevenson, 1994).

Fermentasi dilakukan dengan mengambil beberapa cockborer kultur mikroorganisme

pada media padat. Kultur tersebut diinokulasikan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 ml

media cair yang mengandung 0.5 g xilan, 10.3 g sukrosa dan 1.0 g ekstrak yeast. Kultur

fermentasi diinkubasikan pada suhu kamar selama 5 hari untuk isolate 234 P16 dan 8 hari

untuk isolate 45 I3 dengan penggoyangan pada kecepatan 150 rpm. Hasil fermentasi dipanen

pada hari ke 5 dan ke 8 karena pada hari tersebut diketahui bahwa merupakan hari dimana

produksi enzim xylanase mencapai aktivitas tertingginya dari kedua isolat tersebut. Setelah

waktu yang ditetapkan, kultur media di sentrifugasi untuk diambil larutan supernatannya

yang merupakan ekstrak enzim kasar.

Pemekatan larutan ekstrak enzim kasar yang diperoleh dipekatkan dengan metode

pengendapan menggunakan larutan aseton pada konsentrasi aseton tertentu. Untuk

memperoleh konsentrasi ekstrak enzim kasar yang optimal, jumlah aseton yang ditambahkan

pada 20 ml enzim ekstrak kasar isolat 45 I3 80 ml agar diperoleh konsentrasi aseton 80%

(v/v) sedangkan untuk isolat 234 P16, ditambahkan aseton sebanyak 90 ml pada 10 ml

ekstrak enzim kasar agar diperoleh konsentrasi aseton sebesar 90% (v/v). Campuran tersebut

kemudian disimpan dalam lemari pendingin selama semalam. Setelah itu, larutan

disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm suhu 4 0C selama 15 menit. Endapan protein yang

terbentuk diambil dan dilarutkan dalam 0,02 M bufer fosfat pH 7,0, dengan volume 1 atau 2

ml.

Larutan A dibuat dengan mencampurkan 75 g acrylamide ditambah 2 g bisacrylamide lalu

tambahkan air hingga 250 ml. tempatkan dalam wadah gelap di suhu 4C.

Ammonium Per Sulfate (APS) 10%

Larutan B atau Gel pemisah protein (1.4 M tris HCl pH 8.8) dibuat dengan melarutkan 45.5

g tris ke dalam 200 ml H2O dan dibuat menjadi pH 8.8 lalu ditambah dengan 1 g SDS lalu

volume dibuat tepat menjadi 250 ml.

Larutan C atau gel pengumpul (1 M tris HCL pH 6.8) dibuat dengan cara melarutkan 15.1 g

tris dengan 200 ml H2O lalu larutan dibuat menjadi pH 6.8 kemudian larutan ditambah

dengan 1 g SDS baru ditambahkan H2)O hingga tepat menjadi 250 ml.

Buffer Reservoir (buffer elektroda) dibuat dengan melarutkan 28.8 g glysine ditambahkan

dengan 6 g tris dan disesuaikan pada pH 8.3. kemudian ditambahkan 2 g SDS dan larutan

ditepatkan menjadi 2 l.

Loading buffer sampel dibuat dengan mencampur 2 ml mercaptoetanol dengan 4 ml gliserol,

kemudian ditambah dengan 0.3 g tris dan 2 ml bromofenol blue (0.1% b/v) dalam 20 ml H2O

pH dibuat menjadi 6.8. setelah itu ditambah dengan 0.92 g SDS.

Preparasi sampel dilakukan sebelum sampel di elektroforesis. Preparasi dilakukan dengan

memanaskan campuran larutan sampel dengan larutan loading buffer selama 5 menit pada

suhu 100C.

Elektroforesis dilakukan dengan menempatkan larutan sampel yang sudah dipreparasi dan

juga marker ke dalam sumur SDS PAGE. Elektroforsis dilakukan selama pada kurang lebih 4

jam dengan tegangan konstan sebesar 60 volt. Migrasi diamati dengan pewarna biru

bromofenol sebagai tanda.

Silver staining dilakukan dengan cara merendam gel ke dalam larutan fiksasi 50% asam

asetat selama 2 jam hingga semalaman dengan penggoyangan pelan. Setelah difiksasi, gel

dibilas dengan dd H2O selama 10 menit lalu dicuci dengan larutan etanol 20% selama 3 x 20

menit. Gel dibilas kembali dengan dd H2O selama 10 menit. Kemudian gel di sensitize

dengan menggunakan 0.05 g/200 ml Na2S2O3 selama 1 menit. Gel kembali dibilas dengan

dd H2O selama 3 x 20 menit. Kemudian gel diwarnai dengan 0.1% perak nitrat selama 20

menit, disimpan pada suhu 4C. gel dibilas lagi dengan dd H2O selama 2 x 20 menit. Gel

kemudian direndam pada larutan pengembang yang terdiri dari 5% Na2CO3 + 0.05%

formalin + 0.0004% Na2S2O3. Ketika pewarnaan dengan larutan pengembang dirasa cukup,

gel yang direndam diberi larutan stop solution yang berisi 6 ml asam asetat dan 440 ml dd

H2O selama 5 menit. Gel dicuci dengan dd h2O selama 5 menit. Gel di foto untuk

didokumentasi dan di ukur jarak pengembangan pita protein sampel maupun marker.