validasi metode analisis ampisilin dan sulbaktam...

VALIDASI METODE ANALISIS AMPISILIN DAN

SULBAKTAM DALAM SEDIAAN INJEKSI REKONSTITUSI

MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI (KCKT) HALAMAN JUDUL

KARYA TULIS ILMIAH

Diajukan sebagai salah satu syarat menyelesaikan Program Diploma III

Oleh:

Resti Wulan Dari

NIM. P17335113042

POLITEKNIK KESEHATAN BANDUNG

JURUSAN FARMASI

BANDUNG

2016

ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Karya Tulis Ilmiah ini adalah hasil karya saya sendiri,

Dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

Telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Resti Wulan Dari

NIM : P17335113042

Tanda Tangan :

Tanggal :

iii


JURUSAN FARMASI

HALAMAN PERSETUJUAN

KARYA TULIS ILMIAH

Yang bertanda tangan di bawah ini menyatakan bahwa :

Karya Tulis Ilmiah dengan judul




TINGGI (KCKT)

Disusun oleh :


NIM : P17335113042

Telah diperiksa dan disetujui untuk diujikan pada sidang

Karya Tulis Ilmiah

HALAMAN PERSETUJUAN

Pembimbing

Yayat Sudaryat, S.T, M.T

NIP. 195810051981021002

Mengetahui :

Ketua Jurusan Farmasi

Dra. Mimin Kusmiyati, M.Si

NIP. 196308111994032001

iv


JURUSAN FARMASI

LEMBAR PENGESAHAN

KARYA TULIS ILMIAH

LEMBAR PENGESAHAN

Karya Tulis Ilmiah ini telah diujikan pada sidang Karya Tulis Ilmiah

Program Pendidikan Diploma III Jurusan Farmasi

Politeknik Kesehatan Bandung

Tanggal : 14 Juni 2016




TINGGI (KCKT)

Disusun oleh :


NIM : P17335113042

Penguji :

Tanda Tangan

Ketua : Yayat Sudaryat, S.T, M.T.

NIP. 195810051981021002

( )

Anggota : Widyastiwi, Apt., M.Si

NIP. 199006052014022002

( )

Anggota : Dra. Sri Redjeki, M.Si

NIP. 195110301977112001

( )

v

KATA PENGANTAR

Puji dan Syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, berkat Rahmat

serta Karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah ini, tak lupa

shalawat serta salam semoga selamanya tercurahkan kepada Nabi Muhammad

SAW hingga akhir zaman.

Karya Tulis Ilmiah berjudul “Validasi Metode Analisis Ampisilin dan

Sulbaktam dalam Sediaan Injeksi Rekonstitusi Menggunakan Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi (KCKT)” disusun sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar

Ahli Madya Farmasi pada Program Diploma III Jurusan Farmasi Politeknik

Kesehatan Bandung.

Penyusunan Karya Tulis Ilmiah ini tidak lepas dari pihak-pihak yang telah

memberikan bantuan do’a, motivasi, bimbingan, dan saran, serta yang telah

meluangkan waktu, tenaga dan pikiran yang sangat berharga hingga Karya Tulis

Ilmiah ini dapat terselesaikan. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis

hendak menyampaikan rasa hormat dan terima kasih kepada :

1. Dra. Hj. Mimin Kusmiyati, M.Si. selaku Ketua Jurusan Farmasi Politeknik

Kesehatan Bandung.

2. Yayat Sudaryat, S.T., M.T selaku dosen pembimbing yang telah

mengarahkan, memberikan saran, serta meuluangkan waktu dalam

penyelesaian Karya Tulis Ilmiah ini.

3. Dra. Ganthina Sugihartina, Apt., M.Si selaku dosen pembimbing akademik

yang telah memberikan banyak bimbingan, semangat, nasehat, serta

dukungan.

4. Pihak PT.Meprofarm yang telah memberikan bantuan bahan baku kepada

penulis untuk keberlangsungan penulisan Karya Tulis Ilmiah ini.

5. Yusuf Eka Maulana, S.Si selaku laboran di Laboratorium Terpadu Politeknik

Kesehatan Bandung yang telah membantu selama proses penelitian hingga

proses penyusunan laporan.

vi

6. Segenap dosen, laboran serta karyawan Jurusan Farmasi Politeknik Kesehatan

Bandung yang telah memberikan ilmu, dukungan serta sarannya sehingga

mengantarkan penulis dalam menyelesaikan studi Diploma III di Jurusan

Farmasi Politeknik Kesehatan Bandung.

Semoga Allah SWT berkenan membalas segala kebaikan seluruh pihak

yang telah membantu. Penulis berharap semoga Karya Tulis Ilmiah ini dapat

bermanfaat bagi penulis dan yang membacanya. Penulis menyadari bahwa masih

terdapat banyak kekurangan dalam karya tulis ilmiah ini, oleh karena itu penulis

mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak untuk dapat

menjadi yang lebih baik lagi.

Bandung, Juni 2016

Penulis

vii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KTI UNTUK

KEPENTINGAN AKADEMIS

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

Sebagai civitas akademik Poltekkes Kemenkes Bandung, saya yang bertanda

tangan di bawah ini:


NIM : P17335113042

Jurusan : D-III FARMASI

Jenis karya : Karya Tulis Ilmiah

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepada

Politeknik Kesehatan Bandung Jurusan Farmasi Hak Bebas Royalti

Noneksklusif (Non-exclusive Royalty- Free Right) atas karya ilmiah saya yang

berjudul :

Validasi Metode Analisis Ampisilin Dan Sulbaktam Dalam Sediaan Injeksi

Rekonstitusi Menggunakan KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

Beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). Dengan Hak Bebas Royalti

Noneksklusif ini Poltekkes Kemenkes Bandung Jurusan Farmasi berhak

menyimpan, mengalihmedia/format-kan, mengelola dalam bentuk pangkalan data

(database), merawat, dan mempublikasikan tugas akhir saya selama tetap

mencantumkan nama saya sebagai penulis/pencipta dan sebagai pemilik Hak

Cipta.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Bandung

Pada tanggal :

Yang menyatakan

( )

viii

VALIDASI METODE ANALISIS AMPISILIN DAN SULBAKTAM

DALAM SEDIAAN INJEKSI REKONSTITUSI MENGGUNAKAN

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

Resti Wulan Dari

ABSTRAK

Ampisilin dan sulbaktam merupakan salah satu antibiotik yang bekerja saling

sinergis dalam menghambat bakteri, salah satu bentuk sediaan ampisilin dan

sulbaktam adalah injeksi rekonstitusi. Penetapan kadar sediaan injeksi ampisilin

dan sulbaktam dapat dilakukan secara simultan, menggunakan instrument KCKT.

Penelitian ini bertujuan untuk validasi metode analisis ampisilin dan sulbaktam

dalam sediaan injeksi rekonstitusi menggunakan Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi (KCKT). Pemisahan dilakukan didalam kolom Inertsil C18 (150 mm × 4.6

mm) menggunakan fase gerak air dan asetonitril (85:15) pada laju alir 0.5

mL/menit. Waktu retensi dari Ampisilin dan sulbaktam yaitu masing-masing ± 10

menit dan 21 menit. Parameter yang dilakukan dalam penelitian yaitu menentukan

nilai linieritas, LoD, LoQ, akurasi, presisi serta selektivitas. Nilai regresi linier

ampisilin dan sulbaktam yaitu 0.9982 dan 0.9991 dengan batas deteksi dan batas

kuantifikasi berturut-turut 3.7238 ppm dan 12.4127 ppm untuk ampisilin, 1,2832

ppm, dan 4.2773 ppm untuk sulbaktam. Uji akurasi dan preisisi menunjukan hasil

yang baik dimana % recovery ampisilin yaitu 99.45%, 100.62%, dan 100.78%,

dan sulbaktam 99.01%, 101.56%, dan 100.29%, dengan nilai RSD masing-masing

sebesar 1.01% untuk ampisilin dan 0.68% untuk sulbaktam, dan nilai selektivitas

yang memenuhi syarat sesuai dengan monografi. Hasil validasi dari analisis

ampisilin dan sulbaktam menggunakan KCKT memberikan hasil yang baik dan

dapat digunakan sebagai metode yang memenuhi persyaratan.

Kata kunci : ampisilin, sulbaktam, injeksi, validasi, KCKT

ix

VALIDATION ANALYSIS METHOD OF AMPICILLIN AND SULBACTAM

IN INJECTABLE RECONSTITUTION DOSAGE BY HIGH

PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

Resti Wulan Dari

ABSTRACT

Ampicillin and sulbactam is one antibiotic that works synergis with each other in

inhibiting bacteria, one of ampislin and sulbactam dosage form is an injectable

reconstitution. Assay of ampicillin and sulbactam injection dosage can be

performed simultaneously, using HPLC. This study aims to validate methods

analysis of ampicillin and sulbactam in injectable reconstitution dosage form by

High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The separation is carried

out in Inertsil C18 column (150 mm × 4.6 mm) using a mobile phase of water and

acetonitrile (85:15) at a flow rate 0.5 mL/mins. Retention time of ampicillin and

sulbactam are each ± 10 minutes and 21 minutes. Parameters in this research is

to determine the value of linearity, LOD, LOQ, accuracy, precision and

selectivity. Values linierity of ampislin and sulbaktam is 0.9982 and 0,9991 with a

limit of detection and quantification limits respectively 3.7238 and 12.4127 ppm

for ampicillin, 1.2832 ppm, and 4.2773 ppm for sulbactam. Test accuracy and

preicision shows good results, where the % recovery ampicillin ie 99.45%,

100.62%, and 100.78%, and sulbactam 99.01%, 101.56%, and 100.29%, with the

value of RSD respectively 1.01% for ampicillin and 0.68% for sulbactam, and

selectivity values are qualified according to the monograph. The results of the

validation of ampicillin and sulbactam analysis using HPLC give good results

and can be used as a method that meets the requirements.

Keywords : ampicillin, sulbactam, injection, validation, HPLC

x

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Tak peduli berapa kali kau terjatuh, tapi berapa banyak kau mencoba, dibalik setiap kegagalan dan usaha ada hal baik yang sedang Allah SWT rencanakan. Tetap semangat, taklukan tantangan dan selalu bersyukur”

Segala Puji dan Syukur Kepada Allah SWT, engkau yang Maha Pengasih Lagi Maha

Penyayang, memberikanku kekuatan, menolong dalam kesulitan, membekali ilmu

pengetahuan dan memperkenalkan ku orang-orang tersayang.

Bukan sesuatu yang sempurna namun cukup berharga, ku persembahkan karya

sederhana ini kepada orang yang kukasihi dan kusayangi

Mama dan Papa tercinta, sebagai bakti, rasa hormat dan terimakasih dari anakmu

atas kasih sayang, doa, dukungan serta kerja keras yang tidak mungkin dapat

terbalaskan. Semoga ini merupakan langkah awal untuk membuat mama dan papa

bahagia.

Untuk adik-adikku tersayang, tiada hal yang paling membahagiakan saat melihat

kalian, berkumpul bersama dan saling berbagi, walau selalu ada pertengkaran kecil

yang menyertai kita. Kakak akan selalu berusah untuk menjadi yang terbaik untuk

kalian.

Terimakasih kepada seluruh dosen dan sahabat-sahabat terbaik ku, kalian adalah

orang-orang terbaik yang mengajariku banyak hal yang tak ternilai harganya.

xi

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................................ i

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .................................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN ............................................................................... iii

LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................... iv

KATA PENGANTAR ............................................................................................. v

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................ vii

ABSTRAK ........................................................................................................... viii

HALAMAN PERSEMBAHAN .............................................................................. x

DAFTAR ISI .......................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ................................................................................................ xiv

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xv

DAFTAR RUMUS .............................................................................................. xvi

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xvii

DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG..................................................... xviii

BAB 1 PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ............................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah .......................................................................................... 2

1.3 Tujuan penelitian ........................................................................................... 2

1.3.1 Tujuan umum ....................................................................................... 2

1.3.2 Tujuan khusus ...................................................................................... 2

1.4 Manfaat penelitian ......................................................................................... 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 4

2.1 Antibiotik ....................................................................................................... 4

2.2 Ampisilin ....................................................................................................... 5

2.3 Sulbaktam ...................................................................................................... 7

2.4 Injeksi ............................................................................................................ 9

2.5 Injeksi rekonstitusi ......................................................................................... 9

2.6 Injeksi Rekonstitusi Ampisilin dan Sulbaktam............................................ 10

xiii

2.7 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ................................................ 10

2.8 Validasi ........................................................................................................ 15

2.9 Kerangka Konsep......................................................................................... 22

2.10 Definisi Operasional .................................................................................... 23

BAB III METODE PENELITIAN ..................................................................... 26

3.1 Jenis Penelitian ............................................................................................ 26

3.2 Populasi ....................................................................................................... 26

3.3 Sampel ......................................................................................................... 26

3.4 Lokasi dan Waktu Penelitian ....................................................................... 26

3.4.1 Lokasi ................................................................................................. 26

3.4.2 Waktu ................................................................................................. 26

3.5 Jenis Data ..................................................................................................... 26

3.5.1 Bahan .................................................................................................. 26

3.5.2 Alat ..................................................................................................... 27

3.6 Cara Kerja .................................................................................................... 27

3.6.1 Preparasi Larutan Standar .................................................................. 27

3.6.2 Optimasi Kondisi Analisis ................................................................. 27

3.6.3 Uji Kesesuaian Sistem ........................................................................ 27

3.6.4 Validasi metode Analisis .................................................................... 28

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN .................................... 32

4.1 Hasil Penelitian ............................................................................................ 32

4.1.1 Optimasi Kondisi Analisis ................................................................ 32

4.1.2 Uji Kesesuaian Sistem ........................................................................ 35

4.1.3 Validasi Metode Analisis ................................................................... 37

4.1.3.1 Uji Linieritas ........................................................................... 37

4.1.3.2 Uji Batas Deteksi (LoD) dan Batas Kuantifikasi (LoQ) ........ 38

4.1.3.3 Uji Akurasi ............................................................................. 39

4.1.3.4 Uji Presisi ............................................................................... 40

4.1.3.5 Uji Selektivitas ....................................................................... 41

4.2 Pembahasan ................................................................................................. 41

xiii

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 46

5.1 Kesimpulan .................................................................................................. 46

5.2 Saran ............................................................................................................ 47

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 48

LAMPIRAN .......................................................................................................... 50

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Monografi Ampisilin............................................................................. 6

Tabel 2.2 Monografi Sulbaktam ........................................................................... 8

Tabel 2.3 Definisi Operasional ............................................................................. 23

Tabel 4.1 Percobaan Komposisi Fase Gerak......................................................... 32

Tabel 4.2 Uji Kesesuaian Sistem Ampisilin ......................................................... 35

Tabel 4.3 Uji Kesesuaian Sistem Sulbaktam ........................................................ 36

Tabel 4.4 Data Linieritas Ampisilin dan Sulbaktam ............................................. 37

Tabel 4.5 Perhitungan Nilai LoD dan LoQ Ampisilin dan Sulbaktam ................. 39

Tabel 4.6 Hasil Uji Akurasi Ampisilin dan Sulbaktam......................................... 39

Tabel 4.7 Hasil Uji Presisi Ampisilin dan Sulbaktam .......................................... 40

Tabel 4.8 Data Selektivitas Ampisilin dan Sulbaktam.......................................... 41

xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Struktur Ampisilin Natrium .............................................................. 5

Gambar 2.2 Struktur Sulbaktam Natrium ............................................................. 7

Gambar 2.3 Diagram Blok Sistem KCKT Secara Umum..................................... 12

Gambar 2.4 Delapan Tahap Metode Validasi Menurut USP ................................ 17

Gambar 2.5 Skema Kerangka Konsep .................................................................. 22

Gambar 4.1 Kromtogram Ampisilin ..................................................................... 33

Gambar 4.2 Kromtogram Sulbaktam .................................................................... 34

Gambar 4.3 Kromatogram Ampisilin Dan Sulbaktam .......................................... 35

Gambar 4.4 Kurva Kalibrasi Ampisilin Dan Sulbaktam ...................................... 38

xvi

DAFTAR RUMUS

Rumus 3.1 Simpangan Baku Residual ............................................................... 28

Rumus 3.2 LoD (Limit of Detection) .................................................................. 28

Rumus 3,3 LoQ (Limit of Quantification) .......................................................... 29

Rumus 3.4 Akurasi (% Recovery) ...................................................................... 30

Rumus 3.5 SD (Simpangan Baku) ...................................................................... 30

Rumus 3.6 RSD (Simpangan Baku Relatif) ........................................................ 30

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Perhitungan LoD dan LoQ Ampisilin dan Sulbaktam...................... 51

Lampiran 2. Tabel Hasil Uji Akurasi Ampisilin dan Sulbaktam .......................... 54

Lampiran 3. Kromatogram Presisi ........................................................................ 55

Lampiran 4. Kromatogram Akurasi 80% .............................................................. 61

Lampiran 5. Kromatogram Akurasi 100% ............................................................ 64

Lampiran 6. Kromatogram Kurasi 120% .............................................................. 67

Lampiran 7. Grafik Uji Linieritas ......................................................................... 70

Lampiran 8 Alat yang Digunakan ......................................................................... 72

Lampiran 9. Dokumentasi Kegiatan ..................................................................... 75

xviii

DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG

SINGKATAN NAMA

Pemakaian

pertama kali

pada halaman

i.v Intra Vena 1

µg/mg Mikrogram per miligram 2

KCKT Kromatografi Cair Kinerja Tinggi 2

IUPAC International Union of Pure and Applied

Chemistry

6

i.m Intra Muskular 6

BPFI Baku Pembanding Farmakope Indonesia 6

G Gram 7

µg/ml Mikrogram per mililiter 7

ODS Oktadesil silica 14

Ppm Part permilion 14

UV Ultraviolet 15

VIS Visible 15

ICH International Conference on Harmonization 16

USP United States Pharmacopeia 16

LoD Limit of Detection 18

LoQ Limit of Quantification 18

SD Standard Deviation 18

S/N Signal to Noise 18

SRM Standard Reference Material 19

KV Koefisieen Variasi 20

RSD Relative Standard Deviation 20

WFI Water for Injection 26

M Molar 26

Mg Miligram 26

Ml Mililiter 27

Nm Nanometer 27

µl Mikroliter 27

Rs Resolusi 31

LAMBANG NAMA

Pemakaian

pertama kali

pada halaman

% Persen 2

: Banding 2

°C Derajat celcius 6

= Sama dengan 19

≥ Lebih dari sama dengan 20

± Kurang lebih 26

Ʃ Sigma 30

√ Akar 29

1

BAB 1 PENDAHULUAN

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penyakit infeksi masih merupakan salah satu masalah kesehatan masyarakat

yang penting, khususnya dinegara berkembang. Salah satu obat andalan untuk

mengatasi masalah tersebut adalah antimikroba antara lain antibakteri/antibiotik,

antijamur, antivirus, antiprotozoa. Antibiotik merupakan obat yang paling banyak

digunakan pada infeksi yang disebabkan oleh bakteri (Permenkes, 2011).

Antibiotik ialah zat yang dihasilkan oleh suatu mikroba, terutama fungi

yang dapat menghambat atau dapat membasmi jenis mikroba. Obat yang

digunakan untuk membasmi mikroba penyebab infeksi pada manusia, ditentukan

harus memiliki sifat toksisitas selektif setinggi mungkin. Artinya obat tersebut

harus bersifat sangat toksik untuk mikroba, tetapi relatif tidak toksik untuk hospes

lain (Departemen farmakologi dan terapi FKUI. 2007).

Ampisilin merupakan antibiotik golongan penisilin yang luas spektrum

kerjanya meliputi banyak kuman Gram-negatif yang hanya peka bagi penisilin G

dalam dosis i.v tinggi sekali. Obat ini banyak digunakan untuk mengatasi infeksi

antara lain saluran napas, saluran cerna dan saluran kemih, telinga, gonore, kulit

dan jaringan bagian lunak. Sedangkan sulbaktam merupakan suatu sulfon asam

penisilinat, merupakan derivat sintesis 6-aminopenisilinat. Sulbaktam merupakan

penghambat betalaktamase yang telah lama digunakan dalam pengobatan.

Penghambatan tersebut tidak memperlihatkan aktivitas antibakteri, sehingga tidak

dapat digunakan sebagai obat tunggal untuk menanggulangi penyakit infeksi

(Departemen farmakologi dan terapi FKUI. 2007).

Sediaan ampisilin dan sulbaktam untuk Injeksi adalah suatu campuran

ampisilin natrium dan sulbaktam natrium kering dan steril. Menurut Farmakope

Indonesia edisi V, Sediaan injeksi ampisilin dan sulbaktam mengandung

ampisilin, C16H19N3O4S, dan sulbaktam, C8H11NO5S, setara dengan tidak kurang

2

dari 90,0 % dan tidak lebih dari 115,0 % dari jumlah yang tertera pada etiket.

Perbandingan ampisilin dan sulbaktam pada etiket adalah 2:1. Mengandung

ampisilin dan sulbaktam, berturut-turut tidak kurang dari 563 dan 280 μg/mg,

dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan.

Dalam farmakope edisi V, penetapan kadar sediaan injeksi ampisilin dan

sulbaktam dapat dilakukan secara simultan. Penetapan kadar tersebut dapat

dilakukan menggunakan instrument KCKT. Dalam menentukan kadar dalam

suatu sediaan maka perlu dilakukan validasi metode terlebih dahulu untuk

memastikan bahwa metode tersebut mampu menghasilkan data yang valid dan

sesuai dengan tujuan. Setiap laboratorium harus memiliki metode yang baik dan

harus divalidasi ulang untuk memastikan bahwa metode tersebut bekerja sesuai

spesifikasi dan dapat dipertanggung jawabkan, oleh karena itu penulis melakukan

penelitian mengenai validasi metode analisis sediaan injeksi ampisilin dan

sulbaktam untuk mendapatkan metode analisis campuran secara optimal.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian diatas, rumusan masalah yang dapat diambil adalah

bagaimana data validasi penetapan kadar pada sediaan injeksi rekonstitusi

ampisilin dan sulbaktam menggunakan KCKT?

1.3 Tujuan penelitian

1.3.1 Tujuan umum

Penelitian ini bertujuan untuk menentukan validasi metode analisis

ampisilin dan sulbaktam dalam sediaan injeksi rekonstitusi.

1.3.2 Tujuan khusus

1. Menentukan nilai linearitas ampisilin dan sulbaktam dalam sediaan

injeksi rekonstitusi menggunakan KCKT.

2. Menentukan nilai batas deteksi ampisilin dan sulbaktam dalam

sediaan injeksi rekonstitusi menggunakan KCKT.

3. Menentukan nilai batas kuantifikasi ampisilin dan sulbaktam dalam

sediaan injeksi rekonstitusi menggunakan KCKT.

3

4. Menentukan nilai akurasi ampisilin dan sulbaktam dalam sediaan


5. Menentukan presisi ampisilin dan sulbaktam dalam sediaan injeksi

rekonstitusi menggunakan KCKT.

6. Menentukan selektivitas ampisilin dan sulbaktam dalam sediaan


1.4 Manfaat penelitian

1. Untuk penulis, sebagai data otentik hasil pengukuran telah

dilakukannya penelitian mengenai validasi metode analisis ampisilin

dan sulbaktam dalam sediaan injeksi rekontitusi menggunakan KCKT

(Kromtografi Cair Kinerja Tinggi).

2. Untuk institusi, dapat menanbah koleksi penelitian dan diharapkan

dengan adanya penelitian ini dapat digunakan sebagai acuan untuk

penelitian-penelitian selanjutnya.

4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Antibiotik

Secara etimologi, antibiotik berasal dari bahasa latin “anti” yang berarti

lawan, dan “bios” yang berarti hidup. Antibiotika adalah zat-zat yang didapatkan

dari mikroorganisme yang dapat menghambat pertumbuhan atau membunuh

mikroorganisme lain sedangkan toksisitas terhadap manusia relatif kecil (Tjay dan

Kirana, 2007).

Antibiotik ialah zat yang dihasilkan oleh suatu mikroba, terutama fungi

yang dapat menghambat atau dapat membasmi jenis mikroba. Obat yang

digunakan untuk membasmi mikroba penyebab infeksi pada manusia, ditentukan

harus memiliki sifat toksisitas selektif setinggi mungkin. Artinya obat tersebut

harus bersifat sangat toksik untuk mikroba, tetapi relatif tidak toksik untuk hospes

lain (Departemen Farmakologi dan Terapi FKUI, 2007).

Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antibiotik yang bersifat

mengambat pertumbuhan mikroba (bakteriostatik) dan ada yang bersifat

membunuh mikroba (bakterisid). Berdasarkan mekanisme kerjanya, antibiotik

dibagi dalam lima kelompok (Departemen Farmakologi dan Terapi FKUI, 2007) :

1) Yang mengganggu metabolisme sel mikroba

2) Yang menghambat sintesis dinding sel mikroba

3) Yang mengganggu permeabilitas membran sel mikroba

4) Yang menghambat sintesis atau merusak asam nukleat sel mikroba.

Antibiotik digunakan untuk mengobati berbagai jenis infeksi akibat kuman

atau juga untuk prevensi infeksi, misalnya pada pembedahan besar. Secara

profilaktis juga diberikan pada pasien dengan sendi dan kelp jantung buatan, juga

sebelum cabut gigi (Tjay dan Kirana, 2007).

Senyawa-senyawa penisilin merupakan salah satu kelompok antibiotik

penting. Meskipun banyak senyawa antimikroba lainnya telah dihasilkan sejak

5

pertama kali tersedianya penisilin, namun senyawa ini tetap merupakan antibiotik

utama digunakan secara luas, dan turunan-turunan terbaru dengan inti penisilin

dasar masih tetap diproduksi. Banyak diantaranya yang memiliki kelebihan unik,

sehingga anggota golongan antibiotik ini kini merupakan obat pilihan untuk

banyak penyakit infeksi (Goodman & Gilman, 2012).

Molekul-molekul tertentu dapat mengikat β-laktamase dan

menginaktivasinya, sehingga mencegah perusakan antibiotik β-laktam yang

merupakan substrat untuk enzim-enzim ini. Inhibitor β-laktamase bekerja paling

aktif terhadap β-laktamase yang dikodekan oleh plasmid, namun senyawa ini

tidak akitf pada konsentrasi yang dapat dicapai secara klinis terhadap β-laktamase

kromosomal tipe I yang diinduksi basil Gram-negatif pada pengobatan dengan

sefalosporin generasi kedua dan ketiga (Goodman & Gilman, 2012).

2.2 Ampisilin

Sumber : British Pharmacopoeia 2009

Gambar 2.1 Struktur Ampisilin Natrium

Ampisilin merupakan antibiotik golongan penisilin yang luas spektrum

kerjanya meliputi banyak kuman gram-negatif yang hanya peka bagi penisilin G

dalam dosis i.v tinggi sekali. Obat ini banyak digunakan untuk mengatasi infeksi

antara lain saluran napas, saluran cerna dan saluran kemih, telinga, gonore, kulit

dan jaringan bagian lunak (Tjay dan Kirana, 2007).

In-vitro ampisilin aktif terhadap berbagai kuman Gram-positif dan Gram-

negatif dan beberapa jenis kuman anaerob. Kombinasi dengan sulbaktam tidak

mengubah aktivitas ampisilin, tetapi memperluas spektrumnya mencakup kuman

penghasil β-laktamase intrinsik termasuk galur peka terhadap ampisilin dan

6

kuman anaerob temasuk B.fragilis (Departemen Farmakologi dan Terapi FKUI,

2007). Garam natrium ampisiln dan sulbaktam dapat diberikan secara i.m atau i.v

untuk pengobatan infeksi pada organisme yang memproduksi β-laktamase

(Sweetman, 2009).

Tabel 2.1 Monografi Ampisilin

Nama Senyawa Ampisilin Natrium

Nama IUPAC

Mononatrium D-(-)-6-(2-amino-2-fenilasetamido)-3,3-

dimetil-7-okso-4-tia-1-azabisiklo[3.2.0]heptan-2-

karboksilat

Berat Molekul C16H19N3NaO4S 371,39

Pemerian Serbuk putih atau hampir putih, higroskopis

Kelarutan

Mudah larut dalam air, sedikit larut dalam aseton,

praktis tidak larut dalam minyak lemak dan dalam

parafin liquid.

Stabilitas

Stabilitas larutan ampisilin natrium tergantung pada

banyak faktor termasuk konsentrasi, pH, suhu, dan

sifat pembawa. Stabilitas menurun di hadapan

glukosa, fruktosa, gula invert, dekstran, hetastarch,

natrium bikarbonat, dan laktat. Disarankan agar

larutan ampisilin untuk injeksi harus diberikan dalam

waktu 24 jam dari persiapan, dan harus disimpan pada

2°C sampai 8°C tetapi tidak harus dibekukan.

Identifikasi

Spektrum serapan inframerah zat yang telah

dikeringkan dan didispersikan dalam kalium bromida

P menunjukkan maksimum hanya pada bilangan

gelombang yang sama seperti pada ampisillin BPFI.

7

(Lanjutan)

pH Antara 3.5 sampai 5.5.

Wadah dan Penyimpanan Dalam wadah tertutup rapat.

Penetapan Kadar

Lakukan penetapan kadar dengan cara Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi (KCKT) seperti tertera pada

monografi.

Sumber : Farmakope Indonesia ed V, British Pharmacopoeia 2009 dan Martindale ed 36

Ampisilin stabil dalam suasana asam dan diabsorpsi dengan baik setelah

pemberian oral. Injeksi intramuskular 0,5 g natrium ampisilin menghasilkan

konsentrasi puncak dalam plasma sekitar 7 µg/ml, atau 1 g natrium ampisilin

menghasilkan konsenrasi puncak dalam plasma 10 µg/ml masing-masing dalam

waktu 1 jam dan akan menurun secara eksponensial dalam waktu paruh sekitar 80

menit. Penyesuaian dosis ampisilin diperlukan bila terdapat disfungsi ginjal

(Goodman & Gilman, 2012).

2.3 Sulbaktam

Sumber : British Pharmacopoeia 2009

Gambar 2.2 Struktur Sulbaktam Sodium

Sulbaktam, suatu sulfon asam penisilinat, merupakan derivat sintesis 6-

aminopenisilinat. Sulbaktam merupakan penghambat β-laktamase yang telah lama

digunakan dalam pengobatan. Penghambatan tersebut tidak memperlihatkan

aktivitas antibakteri, sehingga tidak dapat digunakan sebagai obat tunggal untuk

menanggulangi penyakit infeksi (Departemen Farmakologi dan Terapi FKUI,

2007).

8

Tabel 2.2 Monografi Sulbaktam

Nama Senyawa Sulbaktam Sodium.

Nama IUPAC

1,1-dioxide; (2S,5R)-3,3-Dimethyl-7-oxo-4-thia-1-

azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid 4,4-

dioxide.

Berat Molekul C8H10NNaO5S= 255.2ı

Pemerian Putih atau hampir putih, higroskopis, bubuk kristal

Kelarutan

Bebas larut dalam air, sedikit larut dalam etil asetat,

sangat sedikit larut dalam etanol (96%), bebas larut

dalam asam encer.

Identifikasi

Menentukan spektrum penyerapan inframerah dari

sulbaktam natrium seperti yang diarahkan pada

metode kalium bromida disk di bawah

spektrofotometri inframerah, dan membandingkan

spektrum dengan spektrum referensi; kedua spektra

menunjukkan intensitas yang sama dari serapan pada

bilangan gelombang yang sama.

pH 4,5-7,2; jika substansi yang steril: 5,2-7,2

Wadah dan Penyimpanan

Dalam wadah kedap udara. Jika substansi yang steril,

simpan di tempat steril, kedap udara, wadah tamper-

proof.

Penetapan Kadar

Lakukan penetapan kadar dengan cara Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi (KCKT) seperti tertera pada

monografi.

Sumber : Farmakope Indonesia ed V, British Pharmacopoeia 2009 dan Martindale ed 36

Sulbaktam merupakan inhibitor β-laktamase lainnya dengan struktur mirip

dengan asam klavulanat. Obat ini dapat diberikan secara oral atau parenteral

bersama antibiotik β-laktam. Tersedia untuk penggunaan intravena atau

intramuskular dalam bentuk kombinasi dengan ampisilin. Dosis harus disesuaikan

untuk pasien yang mengalami gangguan fungsi ginjal. Kombinasi tersebut

9

memiliki aktivitas yang baik terhadap galur S.aureus penghasil β-laktamase aerob

gram-negatif dan anaerob (Goodman & Gilman, 2012).

2.4 Injeksi

Injeksi adalah sediaan steril berupa larutan, emulsi, suspensi, atau serbuk

yang harus dilarutkan atau disuspensikan terlebih dahulu sebelum digunakan,

yang disuntikkan dengan cara merobek jaringan ke dalam kulit atau melalui kulit

atau selaput lendir (Syamsuni, 2006).

Obat suntik (injeksi) didefinisikan secara luas sebagai sediaan steril bebas

pirogen yang dimaksudkan untuk diberikan secara parenteral. Pada umumnya

pemberian dengan cara parenteral dilakukan bila diinginkan kerja obat cepat

seperti pada keadaan gawat, bila penderita tidak dapat diajak bekerja sama dengan

baik, tidak sadar, tidak dapat atau tidak tahan menerima pengobatan melalui mulut

(oral) atau bila obat itu sendiri tidak efektif dengan cara pemberian lain (Ansel,

1989).

2.5 Injeksi rekonstitusi

Injeksi rekonstitusi adalah campuran padat steril yang harus di

rekonstitusikan terlebih dahulu dengan sejumlah air untuk injeksi (Departemen

Kesehatan RI, 2014).

Bentuk suatu obat dibuat sebagai bentuk suntik tergantung pada sifat obat

itu sendiri dnegan memperhitungkan sifat kimia dan fisika dan juga pertimbangan

terapeutik tertentu. Umumnya, bila obat tidak stabil di dalam larutan, akan dibuat

sebagai sebuk kering yang dimaksudkan untuk atau dapat dibuat dalam bentuk

suspensi partikel obat dalam pembawa dimana obat tidak larut. Bila obat tidak

stabil dengan adanya air, maka pelarut dapat diganti sebagian atau seluruhnya

dengan pelarut yang tepat dimana obat dapat stabil. Bila obat tidak larut dalam air

maka obat suntik dapat dibuat sebagai suspensi air atau larutan obat dalam pelarut

bukan air seperti minyak nabati. Bila laruan air yang diinginkan, maka sering

dipakai garam yang dapat larut dari obat yang tidak larut untuk memenuhi sifat-

sifat kelarutan yang disyaratkan (Ansel, 1989).

10

2.6 Injeksi Rekonstitusi Ampisilin dan Sulbaktam

In-vitro ampisilin aktif terhadap berbagai kuman Gram-positif dan Gram-

negatif dan beberapa jenis kuman anaerob. Kombinasi dengan sulbaktam tidak

mengubah aktivitas ampisilin, tetapi memperluas spektrumnya mencakup kuman

penghasil betalakamase intrinsik termasuk galur peka terhadap ampisilin dan

kuman anaerob temasuk B.fragilis (Departemen Farmakologi dan Terapi FKUI,

2007). Garam natrium ampisiln dan sulbaktam dapat diberikan secara i.m atau i.v

untuk pengobatan infeksi pada organisme yang memproduksi betalaktamase

(Sweetman, 2009)

Ampisilin dan Sulbaktam untuk Injeksi adalah suatu campuran ampisilin

natrium dan sulbaktam natrium kering dan steril. Mengandung ampisilin,

C16H19N3O4S, dan sulbaktam, C8H11NO5S, setara dengan tidak kurang dari 90,0%

dan tidak lebih dari 115,0% dari jumlah yang tertera pada etiket. Perbandingan

ampisilin dan sulbaktam pada etiket adalah 2:1. Mengandung ampisilin dan

sulbaktam, berturut-turut tidak kurang dari 563 dan 280 μg/mg, dihitung terhadap

zat yang telah dikeringkan (Depkes RI, 2014).

2.7 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu metode

pemisahan canggih dalam analisis farrnasi yang dapat digunakan sebagai uji

identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis

senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi,

yang tidak bisa dianalisis dengan Kromatografi Gas. Banyak senyawa yang dapat

dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa

organik makromolekul (Putra, 2004).

Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa

organik, anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian

(impurities); analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non-volatil);

penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion; isolasi dan

pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama;

11

pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements), dalam

jumlah banyak, dan dalam skala proses industri (Gandjar, 2012).

KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi

dengan fase gerak cairan dan fase diam cairan atau padat. Banyak kelebihan

metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Putra, 2004). Kelebihan itu

antara lain:

a. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran.

b. Mudah melaksanakannya.

c. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi.

d. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis.

e. Resolusi yang baik.

f. Dapat digunakan bermacam-macam detektor.

g. Kolom dapat digunakan kembali.

h. Mudah melakukan "sample recovery".

KCKT merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik

untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif. Kromatografi merupakan teknik

dimana solut atau zat-zat terlarut terpiah oleh perbedaan kecepatan elusi,

dikarenakan solut-solut ini melewat suatu kolom kromatografi. Pemisaha solut-

solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam. Instrumen

KCKT pada dasarnya terdiri atas beberapa komponen pokok yaitu (Gandjar,

2012):

12

Sumber : Settle, 1997 dalam Gandjar, 2012

Gambar 2.3 Diagram blok sistem KCKT secara umum

1. Wadah fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong

ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Fase gerak

atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur secara

keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Fase gerak sebelum

digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase

gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di

pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat

pelarut untuk fase gerak maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut,

buffer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi (HPLC grade) (Gandjar,

2012).

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya

elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase

13

diam, dan sifat komponen sampel. Pada fase normal (fase diam lebih polar

daripada fase gerak), dimana kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya

polaritas pelarut. Fase gerak yang sering digunakan adalah campuran pelarut-

pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-

pelarut jenis alkohol. Fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),

dimana kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase

gerak yang umum digunakan adalah campuran larutan buffer dengan metanol atau

campuran air dengan asetonitril. Pemisahan menggunakan fase normal kurang

umum digunakan dibanding dengan fase terbalik. (Gandjar, 2012).

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap

selama elusi) atau dengan cara gradien (komposisi fase gerak berubah-ubah

selama elusi). Elusi gradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran

yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas

(Gandjar, 2012).

2. Sistem penghantar fase gerak (Pompa)

Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang inert

terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja

tahan karat, teflon, dan batu nilam. Tujuan penggunaan pompa atau sistem

penghantar fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantar fase gerak

berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan

(Gandjar, 2012).

3. Alat untuk memasukkan sampel (Injektor)

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase

gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat

penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi

dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal (Gandjar, 2012).

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan yaitu (Putra, 2004) :

a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,

sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan

karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

14

b. Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang

digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada

kinerja sampai 60-70 atmosfir, tetapi septum ini tidak tahan dengan

semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum

yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan

penyumbatan

c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi

volume lebih besar dari 10 μL dan dilakukan dengan cara automatis

(dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil

dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi

kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka

sampel akan masuk ke dalam kolom.

4. Kolom

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis

tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom

dapat dibagi menjadi dua kelompok :

a. Kolom analitik : Diameter dalam 2-6 mm. Panjang kolom tergantung

pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang

yang digunakan adalah 50-100 cm. Untuk kemasan poros

mikropartikulat, 10-30 cm.

b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar

dan panjang kolom 25 -100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada

temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama

untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi (Putra, 2004)

Oktadesil silica (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling

banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan

kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih

pendek lagi sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan

sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi.

15

Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi

disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan (Gandjar, 2012).

5. Detektor

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di

dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif).

Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang

rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe

senyawa (Putra, 2004).

Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu detektor

universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak berifat spesifik, dan

tidak bersifat selektif), dan detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit

secara spesifik dan selektif (Gandjar, 2012).

Suatu detektor harus mempunyai karkteristik respon cepat dan

reprodusibel, sensitifitas tinggi, stabil, sel volume kecil, sinyal yang dihasilkan

berbanding lurus dengan konsentrasi solut, tidak peka terhadap perubahan suhu

dan kecepatan alir fase gerak. Beberapa detektor yang sering digunakan yaitu

absorbsi UV-VIS, flouresensi, indeks bias, elektrokimia (Gandjar, 2012).

6. Komputer atau integrator atau perekam

Alat pengumpul data seperti komputer, integrator atau rekorder

dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang

dihasilkan oleh detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang

selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis.

2.8 Validasi

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan

bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita,

2004).

16

Validasi suatu metode menurut United State Pharmacopeia (USP)

dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis adalah akurat, spesifik,

reproducible, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Secara singkat,

validasi merupakan aksi konfirmasi bahwa metode analisis yang akan diigunakan

sesuai dengan tujuan yang diinginkan. Menurut International Conference on

Harmonization (ICH), suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan

verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi

problem analisis. Oleh karena itu suatu metode harus divalidasi ketika (Rohman,

2004). :

1. Metode harus dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu

2. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau

karena munculnya suatu masalah yang mengarah pada perevisian metode

baku.

3. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah

seiring dengan berjalannya waktu.

4. Metode baku digunakan dilaboratorium berbeda, dikerjakan oleh analis yang

berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda.

5. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antara dua metode, misalnya antara

merode baru dan metode baku

17

Menurut USP, ada 8 langkah dalam validasi metode analisis

Sumber : United States Pharmacopeia dalam Gandjar, 2012

Gambar 2.4 Delapan Tahap Metode Validasi Menurut USP

Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi

metode analisisi anatar lain:

1. Linieritas

Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-

hasil uji secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang

diberikan. Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva

kalibrasi yang menghubungkan respons (y) dengan konsentrasi (x). Linieritas

dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang

berbeda-beda. Data yang diperolah kemudian diproses dengan kuadrat terkecil,

untuk selanjutnya dapat di tentukan nilai kemiringan (slope), intersep, dan

koefesien korelasinya (Rohman, 2004).

Linieritas biasanya ditunjukan secara langsung dengan mengencerkan

larutan baku induk. Dianjurkan untuk melakukan pengenceran secara serial

terhadap larutan baku induk pada uji linieritas. Linieritas paling baik dievaluasi

Validasi metode

Presisi

Akurasi

Batas deteksi

Batas Kuantifikasi

Spesifitas

Linieritas dan rentang

Kekasaran (Ruggedness)

Ketahanan (Robutness)

18

dengan pengamatan visual terhadap suatu plot yang menyatakan hubungan antara

fungsi konsentrasi analit dengan sinyal yang diukur (adsorbansi, luas puncak,

tinggi puncak, luas dibawah kurva, dan sebagianya). Pada uji linieritas, paling

tidak 5 konsentrasi yang berbeda digunakan pada pengujian (Rohman, 2004).

2. Batas Deteksi (LoD)

Batas deteksi didefiniskan sebagai konsentrasi analit terendah dalam

sampel yang masih dapat dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi.

Batas deteksi yang paling umum digunakan dalam kimia analisis adalah bahwa

batas deteksi merupakan kadar analit yang memberikan respon sebesar blanko (yb)

ditambah tiga simpangan baku blanko (3Sb) (Rohman, 2004).

LoD sering kali diekspresikan sebagai suatu konsentrasi pada rasio sinyal

terhadap derau (signal to noise ratio, S/N) yang biasanya rasionya 2 atau 3

dibanding 1. ICH mengenalkan suatu konversi metode signal to noise ratio ini.

LoD juga dapat dihitung berdasarkan pada nilai simpanga baku (SD) respons dan

kemiringan (slope,S) kurva baku pada level yang mendekati LoD sesuai dengan

rumus, LoD = 3,3 (SD/S). Simpangan baku respons dapat ditentukan berdasarkan

simpangan baku blanko, simpangan baku residual dari garis regresi, atau

simpangan baku intersep y pada garis regresi (Rohman, 2004).

3. Batas Kuantifikasi (LoQ)

Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam

sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima

pada kondisi operasional metode yang digunakan. Kadang- kadang rasio signal to

niose 10:1 digunakan untuk menentukan LoQ. Perhitungan LoQ dengan signal to

noise 10:1 merupakan aturan umum. Meskipun demikian, perlu diingat bahwa

LoQ merupakan suatu kompromi antara konsentrasi dengan presisi dan akurasi

yang dipersyaratkan. Jadi, jika konsentrasi LoQ menurun, maka presisi juga

menurun (Rohman, 2004).

19

4. Akurasi

Akurasi merupakan kedekatan nilai terukur (measured value) dengan nilai

sebenarnya yang diterima (accepted true value), baik nilai konversi, nilai

sebenarnya, maupun nilai rujukan. Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang

diperoleh kembali pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu

sampel. Ada tiga pendekatan yang umum digunakan ketika melakukan uji akurasi

yaitu : (1) menggunakan SRM (Standard Reference Material), (2) melakukan

spiking terhadap plasebo, dan (3) menggunakan metode penambahan standar

(Standard Addition Method) (Rohman, 2004).

Akurasi dapat ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien

obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu

(biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian

dianalisis dengan metode yang akan divalidasi (Riyanto, 2014)

Pada senyawa obat, metode yang umum digunakan untuk menentukan

akurasi adalah dengan melakukan prosedur analisis terhadap senyawa obat

tersebut dan menganalisisnya secara kuantitatif, lalu membandingkan hasilnya

dengan senyawa standar rujukan dengan kemurnian yang sudah diketahui. Untuk

produk obat, akurasi biasanya dilakukan dengan mengaplikasikan prosedur

analisis terhadap campuran sintetik yang merupakan komponen-komponen

produk obat atau suatu plasebo yang ditambah dengan zat aktif senyawa obat

dengan tingkat kemurnian yang telah diketahui (Rohman, 2004).

Untuk mendokumetnasikan akurasi, ICH merekomendasikan pengumpulan

data dari 9 kali penetapan kadar dengan 3 konsentrasi yang berbeda, misalnya 3

konsentrasi berbeda dengan 3 kali replikasi. Data harus dilaporkan sebagai

presentase perolehan kembali. Akurasi yang diekspresikan dengan nilai perolehan

kembali yang umum untuk senyawa obat mayor dalam suatu campuran adalah

kurang lebih 98-102%. Jika nilai perolehan kembalinya diluar kisaran ini,

prosedur analisis harus diinvestigasi. Meskipun demikian, perlu dicatat bahwa

presentase perolehan kembali pada studi akurasi merupakan fungsi dari level

analit (Rohman, 2004).

20

5. Presisi

Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil

uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika

prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari

campuran yang homogen (Harmita, 2004).

Presisi mencerminkan kesalahan acak yang terjadi dalam sebuah metode.

Dua set diterima secara umum kondisi di mana presisi diukur adalah kondisi

berulang dan reprodusibilitas. Kondisi pengulangan terjadi ketika analis yang

sama analisis pada sampel yang sama, hari dan instrumen yang sama (misalnya

kromatografi gas) atau bahan (uji misalnya tempat reagen) di laboratorium yang

sama. Setiap variasi dari kondisi ini (misalnya berbeda analis, hari yang berbeda,

instrumen yang berbeda, laboratorium yang berbeda) merupakan reprodusibilitas

(Riyanto, 2014).

Presisi merupakan keterulangan metode analisis dan biasanya

diekspresikan sebagai simpangan baku relatif (Relative Standard Deviation,

RSD). Nilai RSD juga sering disebut koefisien variasi atau KV dari sejumlah

pengukuran sampel (Rohman, 2004).

Kriteria presisi diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif

(RSD) atau koefisien variasi (CV) 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat

fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan

kondisi laboratorium. Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasi meningkat

dengan menurunnya kadar analit yang dianalisis (Riyanto, 2014).

Percobaan keseksamaan dilakukan terhadap paling sedikit enam replika

sampel yang diambil dari campuran sampel dengan matriks yang homogen.

Sebaiknya keseksamaan ditentukan terhadap sampel sebenarnya yaitu berupa

campuran dengan bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) untuk melihat

pengaruh matriks pembawa terhadap keseksamaan ini (Riyanto, 2014).

21

6. Selektivitas

Selektivitas adalah kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur

analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen

lain dalam matriks sampel seperti pengotor (impurities), produk degradasi, dan

komponen matriks. Penentuan spesifitas metode dapat diperoleh dengan dua jalan.

Yang pertama (dan yang paling diharapkan) adalah dengan melakukan optimasi

sehingga diperoleh senyawa yang dituju terpisah secara sempurna dari senyawa-

senyawa lain (resolusi senyawa yang dituju dengan senyawa di sebelah kiri dan

kanan kromatogram ≥ 2) (Rohman, 2004).

Selektivitas suatu metode ditentukan dengan membandingkan hasil-hasil

uji dari suatu analisis sasmpel yang mengandung pengotor-pengotor, produk-

produk degradasi, atau komponen-komponen plasebo dengan hasil-hasil yang

diperoleh dari suatu komponen-komponen plasebo dengan hasil-hasil yang

diperoleh dari suatu analisis yang tidak mengandung pengotor-pengotor, produk-

produk degradasi, atau komponen-komponen plasebo (Rohman, 2004)

22

2.9 Kerangka Konsep

Gambar 2.5 Skema Kerangka Konsep

validasi

Linieritas

LoD

LoQ

Akurasi

Presisi

Selektivitas

23

2.10 Definisi Operasional

Tabel 2.3 Definisi Operasional

Variabel Definisi Cara Ukur Alat Ukur Hasil Ukur Skala Ukur

Linieritas

Kemampuan metode analisis yang

memberikan respon analisis yang

memberikan respon yang secara langsung

atau dengan bantuan transformasi

matematik yang baik, proporsional

terhadap konsentrasi analit dalam sampel

(Harmita, 2004).

Membuat seri

larutan dari laruan

baku yang

kemudian

diinjeksikan

kedalam KCKT

dan ditentukan

persamaan regersi

linier.

Kromatografi

Cair Kinerja

Tinggi

(KCKT)

Nilai koefisien

relasi r

mendekati

nilai 1 pada

analisis regresi

linier

y = a + bx

Rasio

LoD (Limit of

Detection)

Jumlah terkecil anlit yang dapat dideteksi

yang masih memberikan respon

signifikan dibandingkan dengan blangko

(Harmita, 2004).

Menghitung dari

nilai regresi linier

yang didapatkan

pada linieritas

Kromatografi

Cair Kinerja

Tinggi

(KCKT)

Nilai LoD

dalam satuan

ppm

Rasio

24

(Lanjutan)

LoQ (Limit of

Quantification)

Kuantias terkecil anali dalam sampel

yang masih dapat memenuhi kriterian

akurasi dan presisi (Harmita, 2004)

Menghitung dari

nilai regresi linier

yang didapatkan

pada linieritas

Kromatografi

Cair Kinerja

Tinggi

(KCKT)

Nilai LoQ

dalam satuan

ppm

Rasio

Akurasi

Ukuran yang menunjukkan derajat

kedekatan hasil analisis dengan kadar

analit yang sebenarnya (Harmita, 2004).

Sampel simulasi

dibuat mejadi tiga

konsentrasi yang

berbeda dan

diukur masing-

masing 3 kali

pengulangan.

Kromatografi

Cair Kinerja

Tinggi

(KCKT)

% perolehan

kembali dari

pengukuran

sampel yang

diuji.

Rasio

Presisi

Ukuran yang menunjukkan derajat

kesesuaian anatar hasil uji individual,

diukur melalui penyebaran hasil

individual dari rata-rata jika prosedur

diterapkan secara berulang pada sampel-

Sampel simulasi

dibuat dengan

konsetrasi 100

ppm dan

dilakukan

Kromatografi

Cair Kinerja

Tinggi

(KCKT)

% simpangan

baku relatif

(RSD) dari

sampel yang

diuji

Rasio

25

(Lanjutan)

sampel yang diambil dari campuran yang

homogen (Harmita, 2004).

pengukuran

sebanyak 6 kali

pengulangan.

Selektivitas

Kemampuan yang hanya mengukur zat

tertentu saja secara cermat dan seksama

dengan adanya komponen lain yang

mungkin ada dalam matriks sampel

(Harmita, 2004).

Membandingkan

hasil analisis

larutan sampel

simulasi dan

larutan baku yang

diinjeksikan

kedalam KCKT

dan diamati

waktu retensi

antara sampel dan

baku

Kromatografi

Cair Kinerja

Tinggi

(KCKT)

Puncak analit

harus

mempunyi

nilai Rs ≥ 2

Rasio

26

BAB III METODE PENELITIAN

METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian deskriptif.

3.2 Populasi

Populasi penelitian adalah sediaan kombinasi injeksi rekonstitusi ampisilin

dan sulbaktam.

3.3 Sampel

Sampel yang diuji adalah sampel simulasi sediaan kombinasi injeksi

rekonstitusi ampisilin dan sulbaktam dengan kadar 1000 mg untuk ampisilin dan

500 mg untuk sulbaktam.

3.4 Lokasi dan Waktu Penelitian

3.4.1 Lokasi

Pelaksanaan penelitian dilakukan di Laboratorium Terpadu Poltekkes

Bandung Jl.Babakan Loa

3.4.2 Waktu

Waktu pelaksanaan penelitian tanggal 2 Mei – 8 Juni 2016

3.5 Jenis Data

Data diperoleh dari hasil pengumpulan data primer yang didapatkan

dengan melakukan validasi metode analisis ampisilin dan sulbaktam dalam

sediaan injeksi rekonstitusi menggunakan KCKT yang dilakukan di Laboratorium

Terpadu Poltekkes Bandung.

3.5.1 Bahan

Bahan yang digunakan untuk penelitian ini antara lain : Ampisilin natrium,

Sulbaktam natrium, sediaan kombinasi injeksi rekonstitusi ampisilin dan

sulbaktam, Asetonitril, Akuabides, Natrium posfat dibasic, Narium posfat

monobasic, Water for Injection (WFI).

27

3.5.2 Alat

Peralatan yang diperlukan dalam penelitian ini meliputi : KCKT

(Shimadzu Priminance), pH meter, Syringe filter, Neraca analitik (Metler

Tolledo), Sonikator, Alat gelas lainnya yang biasa digunakan di laboratorium

kimia farmasi

3.6 Cara Kerja

3.6.1 Preparasi Larutan Standar

a. Penyiapan Fase Gerak

Fase gerak yang digunakan adalah campuran akuabides dan

asetonitril.

b. Pembuatan Larutan Induk Baku

Ampisilin natrium baku dan sulbaktam natrium baku ditimbang

secara tepat masing-masing sebanyak 10 mg dan 5 mg kemudian

dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml. Ditambahkan akuabides hingga

tanda batas, dikocok hingga homogen sehingga didapat larutan dengan

kadar 100 ppm untuk ampisilin dan 50 ppm untuk sulbaktam.

3.6.2 Optimasi Kondisi Analisis

Optimasi kondisi analisis dilakukan terhadap larutan standar ampisilin dan

sulbaktam dengan cara merubah fase gerak dan laju alir hingga didapatkan kondisi

analisis yang optimal dan menghasilkan kurva yang simetris dan terpisah.

3.6.3 Uji Kesesuaian Sistem

Uji kesesuaian sistem dilakukan dengan cara menyuntikaan campuran

ampisilin dan sulbaktam dengan konsentrasi masing-masing 30 ppm dan 15 ppm

menggunakan panjang gelombang 230 nm dengan fase gerak terdiri dari

akuabides : asetonitril kedalam sistem KCKT. Bandingkan efisiensi kolom, dan

tailing factor yang didapatkan dengan monografi. Pada farmakope edisi V

efisiensi kolom puncak sulbaktam tidak kurang dari 3500 lempeng teoritis, faktor

ikutan tidak lebih dari 1,5, dan simpangan baku relatif pada penyuntikan ulang

tidak lebih dari 2,0 %.

28

Volume injeksi adalah 20 µl untuk semua suntikan. Jenis elusi yang

digunakan adalah elusi isokratik. Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa

dijalankan dan fase gerak dibiarkan mengalir selama ± 15 menit sampai diperoleh

base line yang menandakan alat KCKT telah stabil.

3.6.4 Validasi metode Analisis

a. Linearitas

Larutan baku ampisilin dan sulbaktam dipipet sebanyak 100 µl,

200 µl, 300 μl, 400 μl, 500 μl, dan 600 µl, lalu dimasukkan ke dalam labu

ukur 10 ml. Di encerkan dengan akuabides sampai tanda batas dan dikocok

sampai homogen hingga didapat larutan dengan konsentrasi 10 ppm, 20

ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, dan 60 ppm untuk ampisilin dan

konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm, 25 ppm, dan 30 ppm untuk

sulbaktam.

Masing-masing larutan disonikasi selama 10 menit dan disaring

menggunakan membran filter 0.45 μm, kemudian disuntikkan ke dalam

KCKT melalui injektor sebanyak 20µl. Deteksi menggunakan detektor UV

dengan panjang gelombang 230 nm menggunakan kombinasi fase gerak

larutan akuabides dan asetonitril dengan perbandingan 85:15.

Kromatogram hasil pembacaan dibuat kurva kalibrasi dari luas area

puncak, lalu dibuat persamaan regresi dan koefisien korelasinya.

b. Batas Deteksi (LoD)

Batas deteksi dihitung secara statistik melalui garis regresi linier

dari kurva kalibrasi yang telah dibuat, pengukuran dilakukan dengan

menghitung nilai slope (b) dari persamaan garis linier y = a + bx dan nilai

respon simpangan baku residual s(y/x). Rumus simpangan baku residual

yaitu :

S(y.x) = √∑ ........................................................... (3.1)

Nilai s(y/x) kemudian dimasukkan kedalam rumus batas deteksi berikut :

.................................................................................... (3.2)

29

c. Batas Kuantifikasi (LoQ)

Batas kuantifikasi dihitung secara statistik melalui garis regresi

linier dari kurva kalibrasi yang telah dibuat, pengukuran dilakukan dengan

menghitung nilai slope (b) dari persamaan garis linier y = a + bx dan nilai

respon simpangan baku residual s(y/x).

Nilai s(y/x) kemudian dimasukkan kedalam rumus batas deteksi berikut :

.................................................................................. (3.3)

d. Akurasi

Akurasi dilakukan dengan metode simulasi (spiked-placebo

recovery), yaitu sampel sediaan injeksi ampisilin dan sulbaktam yang

mengandung ampisilin 1000 mg dan sulbaktam 500 mg. ditimbang

sebanyak 15 mg sampel sediaan injeksi kemuian dimasukkan kedalam

labu ukur 10 ml, ditambahkan akuabides hingga tanda batas dan dikocok

hingga larut. Larutan yang telah dibuat tersebut kemudian disebut larutan

stok dengan kandungan 1000 ppm ampisilin dan 500 ppm sulbaktam.

Larutan stok yang mengandung 1000 ppm ampisilin dan 500 ppm

sulbaktam tersebut dibuat menjadi tiga konsentrasi yaitu 80%, 100%, dan

120%. Untuk akurasi 80% dipipet larutan stok sebanyak 240 µl, di

masukkan kedalam labu ukur 10 ml dan ditambahkan akuabides hingga

tanda batas lalu dikocok hingga homogen, untuk akurasi 100% dipipet

larutan stok sebanyak 300 µl, dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml dan

ditambahkan akuabides hingga tanda batas lalu dikocok hingga homogen,

untuk akurasi 120% dipipet larutan stok sebanyak 360 µl, dimasukkan

kedalam labu ukur 10 ml dan ditambahkan akuabides hingga tanda batas

lalu dikocok hingga homogen. Larutan tersebut kemudian disonikasi

selama 10 menit dan di saring menggunakan membran filter 0,45 µm

kemudian disuntikkan sebanyak 20 µl ke dalam KCKT, pengukuran

dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan untuk masing-masing konsentrasi.

30

Dilakukan analisis, kemudian dihitung % recovery dari analit tersebut.

Rumus untuk menghitung perolehan kembali adalah :

x 100 % ............................................................ (3.4)

Keterangan :

CF = konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran

CA = konsentrasi sampel simulasi

C*A = konsentrasi analit yang di tambahkan

Analisis dinyatakan akurasi apabila tidak melebihi dari rentang

kesalahan yang di izinkan (Harmita, 2004).

e. Presisi

Pengukuran presisi dilakukan dengan cara memipet 300 µl larutan

stok, kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml dan ditambahkan

akubides hingga tanda batas, dikocok hingga homogen. Larutan kemudian

disonikasi selama 10 menit dan disaring dengan membram filter 0,45 µm

dan diinjeksikan ke dalam KCKT. Pengukuran dilakukan sebanyak 6 kali

pengulangan. Analisis Standar Deviasi Relatif (RSD) dari hasil

pengukuran untuk menentukan presisi dari sampel dengan rumus :

SD = √∑

........................................................................................ (3.5)

x 100 % ................................................................................. (3.6)

Keterangan : X = nilai dari masing-masing pengukuran

= rata-rata (mean) dari pengukuran

frekuensi penetapan

N – 1 = derajat kebebasan

f. Selektivitas

Larutan stok dipipet sebanyak 300 µl, kemudian dimasukkan

kedalam labu ukur 10 ml dan ditambahkan akubides hingga tanda batas,

dikocok hingga homogen. Disonikasi selama 10 menit dan disaring dengan

kertas saring 0,45 µm kemudian disuntikkan sebanyak 20 µl HPLC dan

31

diamati puncaknya pada kromatogram. Larutan baku ampisilin dan

sulbaktam dipipet masing-masing sebanyak 500 µl kemudian dimasukkan

ke dalam labu ukur 5 ml dan ditambahkan akubides hingga tanda batas,

dikocok hingga homogen Larutan kemudian disonikasi selama 10 menit

dan disaring dengan membram filter 0,45 µm dan diinjeksikan ke dalam

KCKT.

Hasil kromatogram antara larutan baku dan larutan uji ampislin

sulbaktam harus menunjukkan waktu retensi pada daerah sekitar waktu

retensi yang sama dan pada daerah sekitar waktu retensi tidak boleh ada

gangguan yang dapat dilihat dari kromatogram larutan blanko. Semua

senyawa yang dipisahkan dari puncak analit harus mempunyai resolusi

(RS) ≥ 2.

32

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

Penelitian validasi metode analisis ampislin dan sulbaktam menggunakan

KCKT Shimadzu LC 20-AT terdiri dari beberapa rangkaian proses yaitu optimasi

kondisi analisis, uji kesesuaian sistem, pembuatan larutan standar dan kurva

kalibrasi serta uji validasi yang meliputi linieritas, limit deteksi, limit kuantisasi,

akurasi, presisi, dan selektivitas. Dari hasil penelitian validasi ampisilin dan

sulbaktam, didapatkan data-data tahapan sebagai berikut.

4.1.1 Optimasi Kondisi Analisis

Optimasi kondisi analisis pada sistem KCKT Shimadzu Prominance

dilakukan untuk mendapatkan kondisi optimum untuk analisis ampisilin dan

sulbaktam. Parameter yang dioptimasi meliputi fase gerak dan waktu pembacaan.

Untuk menentukan komposisi fase gerak yang memberikan hasil optimum dalam

analisis senyawa ampisilin dan sulbaktam, dilakukan percobaan optimasi

komposisi fase gerak seperti yang ditunjukkan pada tabel 4.1.

Tabel 4.1 Percobaan Komposisi Fase Gerak

Fase Gerak Percobaan

1 2 3 4 5

Akuabides 50 60 70 80 85

Asetonitril 50 40 30 20 15

Dari percobaan komposisi fase gerak yang telah dilakukan untuk optimasi

kondisi analisis, didapatkan komposisi fase gerak pada percobaan ke-5

merupakan komposisi yang memberikan kondisi yang optimum untuk analisis

33

ampisilin dan sulbaktam. Hasil optimasi kondisi analisis ampisilin dan sulbaktam

adalah sebagai berikut.

1. KCKT : Shimadzu Prominance LC-20AT

2. Kolom : GL-Science Japan, inert shield ODS 3 C18

diameter 4,6 mm dan panjang 150 mm

3. Elusi : Isokratik

4. Volume Injeksi : 20 µL

5. Fase gerak : Aqua Pro Injeksi dan Asetonitril (85 : 15)

6. Laju alir : 0,500 mL/menit

7. Detektor : UV-Vis

8. Panjang gelombang : 230 nm

9. Waktu Retensi : Ampisilin ± 21 menit

Sulbaktam ± 10 menit

10. Waktu pembacaan : 30 menit

Hasil optimasi kondisi analisis senyawa ampisilin dapat dilihat pada

gambar kromatogram berikut.

Gambar 4.1 Kromtogram Standar Ampisilin Menggunakan Fase Gerak

Akuabides : Asetonitril (85:15).

34

Gambar 4.1 menunjukkan kromatogaram ampisilin dari optimasi kondisi

menggunakan fase gerak akuabides dan asetonitril dengan perbandingan 85:15

yang menunjukkan puncak yang simetris dan terpisah dari pelarutnya.

Kromatogram sulbaktam dapat dilihat pada gambar berikut ini

Gambar 4.2 Kromtogram Sulbaktam Menggunakan Fase Gerak Akuabides :

Asetonitril (85:15).

Gambar 4.2 menunjukkan kromatogaram sulbaktam dari optimasi kondisi

menggunakan fase gerak akuabides dan asetonitril dengan perbandingan 85:15

yang menunjukkan puncak yang simetris dan terpisah dari pelarutnya. Pada

kondisi tersebut didapatkan nilai lempeng teoritis ampisilin sebesar 976.660 dan

sulbaktam 2228.616 serta nilai tailing factor ampisilin dan sulbaktam masing-

masing sebesar 1.722 dan1.221. Grafik kromatogram lebih lengkap dapat dilihat

pada lampiran.

Hasil kromatogram ampisilin dan sulbaktam yang dianalisis secara

simultan dapat dilihat pada gambar dibawah ini.

35

Gambar 4.3 Kromatogram Ampisilin dan Sulbaktam yang Diuji Secara Simultan

Menggunakan Fase Gerak Akuabides:Asetonitril (85:15)

4.1.2 Uji Kesesuaian Sistem

Sebelum dilakukan validasi metode analisis, terlebih dahulu dilakukan uji

kesesuaian sistem untuk membandingkan parameter hasil analisis sesuai dengan

dengan persyaratan yang ditetapkan pada monografi zat aktif dalam Farmakope

Indonesia edisi V. Hasil perbandingan dapat dilihat pada tabel berikut.

Tabel 4.2 Uji Kesesuaian Sistem Ampisilin

Replikasi Luas

Area

Teoritical

Plate Resolusi

Tailing

Factor k

Ampisilin

1 615267 553.177 4.072 0.869 1.929

2 616270 658.817 5.556 0.874 2.164

3 615570 553.192 4.072 0.868 1.929

4 630674 286.016 3.939 0.000 2.288

5 621053 548.294 5.385 0.882 1.929

6 614386 660.613 5.563 0.863 2.164

Rata-Rata 618870 543.3515 4.765 0.726 2.067

SD 6242.400

%RSD 1.009

36

Pada tabel 4.2 didapatkan data bahwa nilai RSD luas area dari ampisilin

adalah 1.009%, dengan rata-rata teroritical plate 543.3515 dan tailing factor

sebesar 0,726, uji kesesuaian sistem untuk ampislin telah memenuhi persyaratan

pada farmakope edisi V.

Tabel 4.3 Uji Kesesuaian Sistem Sulbaktam

Replikasi Luas Area Teoritical

Plate Resolusi

Tailing

Factor k

Sulbaktam

1 1033357 4243.538 5.909 1.369 0.357

2 1054084 4370.064 7.357 1.326 0.536

3 1046059 4229.908 5.972 1.386 0.357

4 1049679 3823.759 5.245 1.469 0.558

5 1045213 4231.005 5.898 1.386 0.357

6 1047241 4379.355 6.977 1.318 0.536

Rata-Rata 1045938.833 4212.938 6.226 1.376 0.450

SD 6940.778

%RSD 0.664

Pada tabel 4.2 didapatkan data bahwa nilai RSD luas area dari sulbaktam

adalah 0.664%, dengan rata-rata teroritical plate 4212.938 dan tailing factor

sebesar 1.376, nilai tailing factor dan teoritical plate untuk sulbaktam telah

memenuhi persyaratan pada farmakope edisi V yaitu efisiensi kolom puncak

sulbaktam tidak kurang dari 3500 lempeng teoritis dengan faktor ikutan tidak

lebih dari 1,5.

37

4.1.3 Validasi Metode Analisis

4.1.3.1 Uji Linieritas

Pembutan kurva kalibrasi diawali dengan melakukan pengenceran pada

larutan induk campuran ampisilin dan sulbaktam 1000 ppm, pengenceran

dilakukan dengan hati-hati untuk menghindari kesalahan dalam pengenceran.

Kurva Kalibrasi ampisilin dan sulbaktam dibuat menggunakan 6 variasi

konsentrasi, yaitu konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, dan 60

ppm untuk ampisilin, dan 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm, 25 ppm, dan 30 ppm

untuk sulbaktam. Keenam konsentrasi tersebut diinjeksikan kedalam KCKT

kemudian dihitung nilai regresi dan persamaan garisnya. Dari hasil validasi

linieritas, didapatkan data kurva kalibrasi sebagai berikut :

Tabel 4.4 Data Linieritas Ampisilin dan Sulbaktam

No

Kadar Sulbaktam

(x) Luas Area

(y)

Kadar Ampisilin

(x) Luas Area

(y) (mg/L) (mg/L)

1 5.0 367625 10.0 197382

2 10.0 713820 20.0 424698

3 15.0 1045213 30.0 637969

4 20.0 1331269 40.0 786903

5 25.0 1740688 50.0 1044165

6 30.0 2023862 60.0 1209656

Intersep (a) 66559.1 9925.0

20196.3

0.9965

0.9982

Y = 9925 + 20196,3x

Slope (b) 38961.7

R2

0.9983

R 0.9991

Y = a + bx Y = 66559,1 + 38961,7x

Dari tabel 4.4 di dapatkan data nilai regresi linier (R) sulbaktam yaitu

0,9991, dengan nilai intersep (a) yaitu 38961,7 dan nilai slope (b) yaitu 66559,1.

sehingga didapatkan persamaan garis Y=a+bx yaitu Y=38961,7+66559,1x.

Sedangkan nilai regresi linier (R) ampisilin yaitu 0,9982, dengan nilai intersep (a)

38

yaitu 9925 dan nilai slope (b) yaitu 20196,3. Sehingga didapatkan persamaan

garis Y=a+bx yaitu Y=9925+20196,3x.

Gambar 4.4 Kurva Kalibrasi Ampisilin dan Sulbaktam Menggunakan Fase Gerak

Akuabides : Asetonitril (85:15)

4.1.3.2 Uji Batas Deteksi (LoD) dan Batas Kuantifikasi (LoQ)

Batas deteksi (LoD) dan batas kuantifikasi (LoQ) dihitung secara statistik

melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi yang telah dibuat. Nilai LoD dan

LoQ dihitung dari nilai slope (b) yang didapat dari persamaan regresi linier Y = a

+ bx dan simpangan baku residual S(y/x), nilai tersebut dimasukkan kedalam

rumus LoD dan LoQ pada lampiran 1. Nilai LoD dan LoQ yang didapatkan dari

masing-masing senyawa sebagai berikut.

y = 66559x + 38962 R² = 0.9983

y = 40393x + 9925 R² = 0.9965

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

0 10 20 30 40

Luas

Are

a

Konsentrasi

KURVA KALIBRASI

Sulbaktam

Ampisilin

Linear (Sulbaktam)

Linear (Ampisilin)

39

Tabel 4.5 Perhitungan Nilai LoD dan LoQ Ampisilin dan Sulbaktam

LoD (ppm) LoQ (ppm)

Ampisilin 3.7238 12.4127

Sulbaktam 1.2832 4.2773

Dari tabel 4.5 didapatkan data bahwa batas deteksi untuk ampisilin adalah

3.7238 ppm dan batas kuantifikasinya adalah 12.4127 ppm. Sedangkan untuk

sulbktam didapatkan data bahwa batas deteksi sulbaktam yaitu 1,2832 ppm, dan

batas kuantifikasi 4.2773 ppm.

4.1.3.3 Uji Akurasi

Akurasi diuji menggunakan metode simulasi (spike placebo recovery),

dengan dibuat tiga rentang konsentrasi yaitu 80%, 100%, dan 120% masing-

masing dari kadar yang tertera pada etiket dan dilakukan tiga kali pengukuran

untuk masing-masing konsentrasi. Hasil uji akurasi dapat dilihat pada tabel

berikut.

Tabel 4.6 Hasil Uji akurasi Ampisilin dan Sulbaktam Dengan Rentang

Konsentrasi 80%, 100%, dan 120%.

Rentang (%) Rata-rata % Recovery

Ampisilin (%) Sulbaktam (%)

80 99.45 99.01

100 100.62 101.56

120 100.78 100.29

Pada tabel 4.6 didapatkan data nilai rata-rata perhitungan perolehan

kembali (% Recovery) ampisilin pada konsentrasi 80%, 100%, dan 120% masing-

masing yaitu 99.45%, 100.62%, dan 100.78%, perolehan kembali (% Recovery)

sulbaktam yaitu 99.01%, 101.56%, dan 100.29%.

40

4.1.3.4 Uji Presisi

Uji presisi dilakukan secara simultan dengan cara menginjeksi campuran

ampisilin dan sulbaktam dengan kadar masing-masing 30 ppm dan 15 ppm

sebanyak 6 kali pengulangan, luas area yang didapatkan dari hasil injeksi dihitung

rata-rata serta nilai %RSD.

Tabel 4.7 Hasil Uji Presisi Ampisilin dan Sulbaktam

Pengulangan Ke- Luas Area

Ampisilin Sulbaktam

1 615267 1033357

2 616270 1054804

3 615570 1046059

4 630674 1049679

5 621053 1045213

6 614386 1047241

Rata-rata 618870 1046059

SD 6242.40 7113.83

% RSD 1.01 0.68

Dari tabel 4.7 didapatkan %RSD dari pengukuran presisi sebesar 1,01%

untuk ampisilin dan 0,68% untuk sulbaktam.

41

4.1.3.5 Uji Selektivitas

Uji selektivitas dilakukan dengan membandingkan resolusi antara larutan

uji yang mengandung bahan-bahan tambahan lain dengan dengan larutan baku.

Data hasi uji selektivitas adalah sebagai berikut.

Tabel 4.8 Data Selektivitas Ampisilin dan Sulbaktam

Resolusi Ampisilin Resolusi

Sulbaktam

Syarat

Monografi Keterangan

Sampel Standar Sampel Standar >4 Sesuai

5.541 4.142 6.825 5.245

Dari tabel 4.8 didapatkan data nilai resolusi pada sampel dan standar

ampsilin sebesar 5.541 dan 4.142, sedangkan nilai resolusi pada sampel dan

standar untuk sulbaktam adalah 6.825 dan 5.245. Nilai resolusi tersebut telah

memenuhi persyaratan pada monografi.

4.2 Pembahasan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan instrumen dalam

analisis farrnasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan

penetapan kadar. Prinsip dalam penggunaan instrument KCKT adalah pemisahan

senyawa berdasarkan kepolarannya. Penelitian ini bertujuan untuk validasi metode

analisis ampislin dan sulbaktam dalam sediaan injeksi rekonstitusi menggunakan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) yang dilaksanakan di Laboratorium

Terpadu Politeknik Kesehatan Bandung. Validasi metode ini dilakukan untuk

menjamin bahwa metode analisis yang digunakan dengan metode KCKT adalah

akurat, spesifik, reproducible, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis.

Tahap dalam pelaksanaan validasi ini dimulai dengan tahap optimasi

kondisi analisis, salah satu parameter yang harus di optimasi adalah fase gerak,

baik jenis fase gerak maupun komposisi dari fase gerak yang digunakan.

Berdasarkan penelitian Badgujar (2011). salah satu alternatif fase gerak yang

42

digunakan untuk analisis ampisilin dan sulbaktam adalah campuran dapar posfat

pH 5,00 dan asetonitril dengan perbandingan 83 :17 yang dapat memberikan hasil

yang baik, namun dalam praktiknya fase gerak yang digunakan adalah akuabides

dan asetonitril. Penggunaan dapar pada sistem KCKT dihindari karena dapar

dapat lebih cepat merusak kolom, dimana garam dari dapar mudah mengkristal

sehingga dapat menyumbat kolom. Karena kombinasi fase gerak yang digunakan

berbeda dengan literatur dan penelitian sebelumnya, maka perlu dilakukan

validasi metode agar didapatkan kondisi yang optimal.

Percobaan beberapa komposisi fase gerak pada tabel 4.1 didapatkan hasil

percobaan pertama kedua dan ketiga menggunakan komposisi akuabides dan

asetoniril dengan perbandingan 50:50, 60:40, dan 70:30 dengan laju alir 0,500

mL/menit, didapatkan waktu retensi senyawa yang cepat, namun gambar kromatogram

yang dihasilkan menunjukkan pemisahan yang kurang baik pada senyawa, dimana

masih terdapat fronting dan banyaknya pelarut yang terbaca. Sehingga dilakukan

percobaan optimasi fase gerak keempat menggunakan komposisi akuabides dan

asetoniril dengan perbandingan 80:20 dengan laju alir 0,500 mL/menit, waktu

retensi senyawa pada komposisi ini lebih lambat dibandigkan dengan komposisi

fase gerak sebelumnya tetapi kromatogram yang dihasilkan telah menunjukkan

pemisahan yang baik, namun puncak yang dihasilkan belum optimal, tidak

simetris dan masih melebar, kemudian dilakukan percobaan optimasi kembali yaitu

yang kelima menggunakan campuran akuabides dan asetonitril dengan

perbandingan 85:15 dengan laju alir 0,500 mL/menit, pada optimasi kondisi ini

waktu retensi yang didapatkan jauh lebih lama dibandingkan dengan optimasi

yang sebelumnya, namun didapatkan hasil pemisahan yang baik serta puncak

yang simetris pada masing-masing senyawa, sehingga kondisi optimum yang

digunakan untuk penelitian ini adalah fase gerak campuran akuabides dan

asetonitril dengan perbandingan 85:15, pada panjang gelombang 230 nm

menggunakan KCKT Shimadzu LC-20AT dan jenis kolom GL-Science Japan,

inertsil ODS 3 C18 diameter 4,6 mm dan panjang 150 mm dengan laju alir 0,500

mL/menit, detektor UV-Vis, serta waktu pembacaan selama 30 menit.

43

Ampisilin dan sulbaktam dianalisis secara simultan yaitu dengan cara

menganalisis campuran kedua senyawa tersebut secara bersamaan menggunakan

sistem KCKT. Analisis secara simultan ampisilin dan sulbaktam akan

menghasilkan dua kurva pada waktu retensi yang berbeda berdasarkan tingkat

kepolaran dari dua senyawa tersebut. Pada penelitian ini, sulbaktam terelusi lebih

dahulu dibandingkan ampisilin, hal ini dikarenakan sulbaktam memiliki tingkat

kepolaran lebih tinggi dibandingkan ampisilin dimana afinitas sulbaktam terhadap

fase gerak yang polar lebih tinggi dibandingkan ampisilin sehingga sulbaktam

dapat terelusi terlebih dahulu.

Sebelum dilakukan validasi metode analisis, terlebih dahulu dilakukan uji

kesesuaian sistem sesuai dengan persyaratan pada monografi bahan aktif. Pada

farmakope edisi V diketahui kesesuaian sistem ampislin dan sulbaktam untuk

injeksi yaitu resolusi R, antara ampisilin dan sulbaktam tidak kurang dari 4,0,

efisiensi kolom puncak sulbaktam tidak kurang dari 3500 lempeng teoritis, faktor

ikutan (tailing factor) tidak lebih dari 1,5 dan simpangan baku relatif (RSD) pada

penyuntikan ulang tidak lebih dari 2,0%. Uji kesesuaian sistem pada tabel 4.2 dan

4.3 didapatkan data bahwa resolusi dan nilai RSD luas area dari ampisilin masing-

masing adalah 4.765 dan 1.009% sedangkan untuk sulbaktam yaitu 6.226 dan

0.664%, dengan rata-rata teroritical plate 543.3515 dan tailing factor sebesar

0,726, nilai tailing factor untuk ampislin dan rata-rata teroritical plate 4212.938

dan tailing factor sebesar 1.376 untuk sulbaktam. Uji kesesuaian sistem ampislin

dan sulbaktam tersebut telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan pada

monografi.

Validasi metode analisis merupakan suatu metode analisis dengan sampel

berupa sediaan farmasi sekurang-kurangnya harus memenuhi syarat ketepatan,

ketelitian, dan selektifitas. Pada penelitian ini, parameter validasi metode yang

dilakukan adalah linearitas, LoD dan LoQ, akurasi, presisi, dan selektivitas.

Parameter validasi pertama adalah linieritas yang dilakukan dengan

membuat kurva kalibrasi. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa

baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi

(x) dengan persamaan y = a + bx. Dari tabel 4.4 di dapatkan data nilai regresi

44

linier (R) sulbaktam yaitu 0,9991, dengan persamaan garis Y=a+bx yaitu

Y=38961,7+66559,1x dan (R) ampisilin yaitu 0,9982, dengan persamaan garis

Y=a+bx yaitu Y=9925+20196,3x. Hasil koefisien relasi (R) yang diperoleh

dari kurva kalibrasi menunjukkan bahwa memenuhi syarat kelinieran tampak

dari pengamatan visual dari grafik kurva kalibrasi terlihat lurus dan nilai R yang

diperoleh mendekati 1 (satu) dan lebih besar dari nilai koefisien relasi yang

disyaratkan yaitu lebih besar dari 0,98 (BPOM, 2013). Sehingga dapat

diartikan bahwa terdapat hubungan yang linier antara luas area dan konsentrasi,

semakin tinggi konsentrasi maka semakin besar pula luas area yang terbentuk.

Validasi Limit of Detection (LoD) dan Limit of Quantification (LoQ)

merupakan tahap validasi untuk mengetahui sensitivitas analit yang diuji

menggunakan KCKT. LoD dan LoQ dihitung untuk menetapkan bahwa zat aktif

yang dianalisis telah melewati batas minimal yang dapat dideteksi dan

dikuantisasi sehingga hasil analisis dapat dipertanggungjawabkan. Pada penelitian

ini batas deteksi (LoD) dan batas kuantifikasi (LoQ) dihitung secara statistik

melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi yang telah dibuat. Nilai batas

deteksi untuk ampisilin dan sulbaktam yang didapatkan masing-masing yaitu

3.7238 ppm dan 1,2832 ppm, sedangkan batas kuantifikasinya adalah 12.4127

ppm utnuk ampisilin dan 4.2773 ppm untuk sulbaktam.

Uji akurasi dinyatakan dengan persen perolehan kembali (% recovery) dari

analit yang diukur. Dalam penelitian ini pengukuran akurasi dilakukan dengam

metode simulasi spike placebo recovery, dengan cara menambahkan sejumlah

tertentu zat aktif kedalam plasebo. Akurasi dibuat dengan tiga rentang konsentrasi

yaitu 80%, 100%, dan 120% masing-masing dilakukan tiga kali pengukuran.

Masing-masing konsentrasi dibuat dengan memipet dari larutan stok sediaan

ampisilin dan sulbaktam 1000 ppm, konsentrasi 80%, 100% dan 120% masing-

masing dipipet sebanyak 240 µL, 300 µL, dan 360 µL yang dimasukkan kedalam

labu ukur 10 ml dan disonikasi selama 15 menit. Larutan kemudian disaring

dengan membran filter 0,45 µm dan diinjeksikan kedalam sistem KCKT sebanyak

20 µL dengan dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali untuk masing-masing

konsentrasi.

45

Nilai rata-rata perhitungan perolehan kembali (% Recovery) ampisilin

pada konsentrasi 80%, 100%, dan 120% masing-masing yaitu 99,45%, 100,62%,

dan 100,78, perolehan kembali (% Recovery) sulbaktam yaitu 99,01%, 101,56%,

dan 100,29%. Syarat dari nilai peroleh kembali untuk analit pada matrik sampel

yang diizinkan yaitu 98-102% (Harmita,2004), sehingga nilai rata-rata perolehan

kembali untuk ampisilin maupun sulbaktam pada masing-masing konsentrasi

memenuhi syarat dari rentang perolehan kembali yang diizinkan.

Uji presisi merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara

hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika

prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari

campuran homogen. Uji presisi dilakukan secara simultan dengan cara

menginjeksi campuran ampisilin dan sulbaktam dengan kadar masing-masing 30

ppm dan 15 ppm sebanyak 6 kali pengulangan, luas area yang didapatkan dari

hasil injeksi dihitung rata-rata serta nilai RSD. % RSD dari pengukuran presisi

ampislin dan sulbaktam yaitu 1,01% untuk ampisilin dan 0,68% untuk sulbaktam

nilai presisi tersebut memenuhi syarat presisi yang baik, dimana presisi

dinyatakan baik apabila nilai RSD < 2% (Harmita, 2004).

Validasi terakhir yaitu validasi selektivitas, yang dilakukan dengan

melakukan potimasi pemisahan antara dua senyawa sehingga terpisah dengan

sempurna dan mendapatkan nilai resolusi sesuai dengan persyaratan pada

monografi. Pada farmakope edisi V, di tentukan bahwa nilai resolusi untuk

ampisilin dan sulbaktam yaitu tidak kurang dari 4, sedangkan pada pengujian

didapatkan nilai resolusi pada sampel dan standar ampsilin sebesar 5.541 dan

4.142, sedangkan nilai resolusi pada sampel dan standar untuk sulbaktam adalah

6.825 dan 5.245. Nilai resolusi tersebut telah memenuhi persyaratan pada

monografi. Dari data tersebut diketahui bahwa dengan adanya penambahan

plasebo pada analit akan berpengaruh terhadap resolusi ampisilin dan sulbaktam,

kedua zat menjadi lebih terpisah dengan nilai resolusi menjadi lebih besar.

46

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Validasi sediaan injeksi rekonstitusi ampisilin dan sulbaktam dapat diuji

secara simultan dengan metode KCKT menggunakan fase gerak campuran

akuabides dan asetonitril dengan perbandingan 85:15, panjang gelombang 230 nm

dengan kolom inertsil ODS 3 C18 (4,6 mm x 150 mm) dengan laju alir 0,500

mL/menit, detektor Uv-Vis. Dari hasil validasi tersebut didapatkan data :

1 Nilai regresi linier (R) sulbaktam yaitu 0,9991, persamaan garis Y=a+bx

yaitu Y=38961,7+66559,1x dan (R) ampisilin yaitu 0,9982, persamaan

garis Y=a+bx yaitu Y=9925+20196,3x.

2 Nilai batas deteksi untuk ampisilin dan sulbaktam masing-masing yaitu

3.7238 ppm dan 1,2832 ppm.

3 Nilai batas kuantifikasi ampisilin dan sulbaktam masing-masing 12.4127

ppm dan 4.2773 ppm.

4 Nilai rata-rata perhitungan perolehan kembali (% Recovery) ampisilin pada

konsentrasi 80%, 100%, dan 120% masing-masing yaitu 99,45%,

100,62%, dan 100,78%, sedangkan untuk sulbaktam yaitu 99,01%,

101,56%, dan 100,29%.

5 % RSD dari pengukuran presisi yaitu 1,01% untuk ampisilin dan 0,68%

untuk sulbaktam.

6 Uji selektivitas didapatkan nilai resolusi pada sampel dan standar ampisilin

sebesar 5.541 dan 4.142, sedangkan nilai resolusi pada sampel dan standar

untuk sulbaktam adalah 6.825 dan 5.245.

47

5.2 Saran

Saran untuk penelitian berikutnya yaitu :

1 Perlu dilakukannya penelitian lanjutan mengenai kondisi optimasi

analisis agar didapatkan gambar kromatogram yang lebih simetris

dengan waktu retensi yang cepat dan memenuhi uji kesesuaian sistem

2 Perlu dilakukan penambahan parameter validasi.

3. Dilakukan penetapan kadar sediaan injeksi rekonstitusi ampisilin dan

sulbaktam menggunakan beberapa macam merk yang beredar di

pasaran.

48

DAFTAR PUSTAKA

Agoes, Goeswin. 2013. Seri Farmasi Industri 4: Sediaan Farmasi Steril.

Bandung: Penerbit ITB.

Ansel, Howard C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi edisi 4. Jakarta : UI

Press.

Anusha, N dn B. Uday Kamath. 2012. “Simultaneous Estimation of Amoxycillin

and Sulbactam in a parenteral Formulation by Reverse Phase HPLC

Method”. Dalam International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical

Sciences. Vol 4 Suppl 4. 27 May. Karnataka.

Badgujar, Madhukar A dan Kiran V. Mangaonkar. 2011. “Simultaneous

Estimation of Ampicillin Sodium and Sulbactam Sodium in Injectable

Dosage Form by High Performance Liquid Chromatography”. Dalam

Oriental Journal of Chemistry. Volume 27 No 4. 22 October. Mumbai

BPOM, 2013. Petunjuk Operasional Penerapan Pedoman Cara Pembuatan

Obat yang Baik (Jilid 1). Jakarta: Badan POM RI.

Departemen Farmakologi dan Terapi FKUI. 2007. Farmakologi dan Terapi. Edisi

5 Cetak ulang. Jakarta : Balai Penerbit FKUI.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2014. Farmakope Indonesia,. edisi V.

Jakarta : Departemen Kesehatan.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2011. Peraturan Menteri Kesehatan

Republik Indonesia No 2406/MENKES/PER/XII/2011 tentang Pedoman

Umum Penggunaan Antibiotik. Jakarta : Departemen Kesehatan.

Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman. 2012. Kimia farmasi Analisi. Cetakan

X. Yogyakarta : Pustaka Pelajar

Gilman, Alfred Goodman. 2012. Goodman & Gilman Dasar Farmakologi Terapi

volume 3. Jakarta : EGC

Harmita. 2004. “Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara

Perhitungannya”. Dalam Majalah Ilmu Kefarmasian. Volume 1 No 3.

Desember. Jakarta.

Lachman, Leon, Patrick Deluca, dan michael J.Akers. 1994. Teori dan Praktek

Farmasi Industri edisi Ketiga. Jakarta : UI Press

Putra, Effendy De Lux. 2004. “Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang

Farmasi”. Dalam USU Digital Library. Sumatera Utara

Riyanto. 2014. Validasi & Verifikasi Metode Uji: Sesuai dengan ISO/IEC 17025 Laboratorium Pengujian dan Kalibrasi. Edisi 1. Cetakan 1. Yogyakarta :

Deepublish.

49

Rohman, Abdul. 2014. Validasi dan Penjaminan Mutu Metode Analisis Kimia.

Cetakan Pertama. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press.

Sweetman, Sean C. 2002. Martindale The Complete Drug Reference Thirty-sixth

edition. London : The Pharmaceutical Press.

Syamsuni, H.A.2006. Ilmu Resep. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.

The Department of Health, Social Services and Pubkic Safety. 2009. British

Pharmacopeia 6th

ed. London : The Stationery Office

Tjay, Tan Hoan dan Kirana Rahardja. 2008. Obat-Obat Penting. Edisi ke-VI.

Jakarta : PT. Elex Media Komputindo.

USP 32 – NF 27 (2009). United States Pharmacopeia and The National

Formulary. Rockville (MD): The United States Pharmacopeial

Convention.

Venkatashamappa, Chikkanna, Prabhakara Somanna, dan ahajanda H. 2014. “A

New Metho For Simultaneous Estimation of Ampicillin Sodium and

Sulbactam Sodium In Injectable Dosage Form By Reverse Phase High

Performance Liquid Chomatography”. Dalam International Journal of

Science Innovations and Discoveries. 14 Maret. Karnataka.

50

LAMPIRAN

51

Lampiran 1. Perhitungan LoD dan LoQ Ampisilin dan Sulbaktam

Ampislin Sulbaktam

Konsentrasi

(X)

Luas Area

(Y) Yi (Y-Yi)

2 S(y/x)

Konsentrasi

(X)

Luas

Area (Y) Yi (Y-Yi)

2 S(y/x)

10 197382 211888 210424036

25069.1

5.0 367625 371757 17075077

28469.2

20 424698 413851 117657409 10.0 713820 704552 85882849

30 637969 615814 490844025 15.0 1045213 1037348 61855079

40 786903 817777 953203876 20.0 1331269 1370143 1511242300

50 1044165 1019740 596580625 25.0 1740688 1702939 1424971901

60 1209656 1221703 145130209 30.0 2023862 2035734 140961005

Ʃ(Y-Yi)2 2513840180 Ʃ(xi-x)

2 3241988211.99

LOD 3.7238 LOD 1.2832

4.2773 LOQ 12.4127 LOQ

52

Lampiran 1 (Lanjutan)

Ampisilin

1. Perhitungan simpangan baku

resdual :

S(y.x) = √∑

S(y/x) = √

S(y/x) = 25069.1

2. Perhitungan limit deteksi (LoD)

3. Perhitungan limit kuantifikasi

(LoQ)

53


Sulbaktam

1. Perhitungan simpangan baku resdual :

S(y.x) = √∑

S(y/x) = √

S(y/x) = 28469.2

2. Perhitungan limit deteksi (LoD)

3. Perhitungan limit kuantifikasi (LoQ)

54

Lampiran 2. Tabel hasil uji akurasi ampisilin dan sulbaktam

Rentang (%) Replikasi Konsentrasi Ampisilin (ppm)

% Recovery Konsentrasi Sulbaktam (ppm)

% Recovery Teoritis Pengukuran Teoritis Pengukuran

80

1 24 23.584 98.27 12 11,772 98.10

2 24 24.306 101.28 12 12,065 100.54

3 24 23.713 98.80 12 11,806 98.38

Rata-rata 99.45 Rata-rata 99.45

100

1 30 30.089 100.30 15 15,227 101.51

2 30 30.447 101.49 15 15,195 101.30

3 30 30.023 100.08 15 15,282 101.88


120

1 36 36.412 101.14 18 18,032 100.18

2 36 36.112 100.31 18 17,994 99.97

3 36 36.315 100.88 18 18,129 100.72


55

Lampiran 3. Kromatogram Presisi 5/26/2016 11:42:34 1 / 1

==== POLITEKNIK KESEHATAN BANDUNG ====

D:\DATA FILE HPLC\TAHUN 2016\Ampisilin-sulbaktam resti farmasi\Presisi\Presisi-1.lcd Acquired by : Resti Wulan Dari Sample Type : Presisi Sample Name : Presisi Standar-1 Sample ID : Pres Amp/Sbt Data File Name : Presisi-1.lcd Method File Name : ok10052016sulbaktam.lcm Batch File Name : 26052016.lcb Report File Name : Default.lcr Data Acquired : 5/26/2016 7:31:34 AM Data Processed : 5/26/2016 7:31:34 AM <Chromatogram>

Chromatogram

Unknown Sample D:\DATA FILE HPLC\TAHUN 2016\Ampisilin-sulbaktam resti farmasi\Presisi\Presisi-1.lcd

uV

30000 20000 10000

1Det.A Ch1

D:\DATA FILE HPLC\TAHUN 2016\Ampisilin-sulbaktam resti farmasi\Presisi\Presisi-1.lcd Detector A

Name Ret. Time Area Conc. Theoretical Plate# Resolution Tailing Factor HETP k' Sulbaktam 10.454 1033357 14.940 4243.538 5.909 1.369 35.348 0.357 Ampisilin 22.563 615267 29.973 553.177 4.072 0.869 271.161 1.929

D:\DATA FILE HPLC\TAHUN 2016\Ampisilin-sulbaktam resti farmasi\Presisi\Presisi-1.lcd

56

Lampiran 3 (Lanjutan) 5/26/2016 11:42:57 1 / 1


D:\DATA FILE HPLC\TAHUN 2016\Ampisilin-sulbaktam resti farmasi\Presisi\Presisi-2.lcd Acquired by : Resti Wulan Dari Sample Type : Presisi Sample Name : Presisi Standar-2 Sample ID : Pres Amp/Sbt Data File Name : Presisi-2.lcd Method File Name : ok10052016sulbaktam.lcm Batch File Name : 26052016.lcb Report File Name : Default.lcr Data Acquired : 5/26/2016 8:07:41 PM Data Processed : 5/26/2016 8:07:41 PM

<Chromatogram>

Chromatogram


uV

40000

S u l b a k t a m

30000

20000

10000

pis

ilin

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm


Detector A Name Ret. Time Area Conc. Theoretical Plate# Resolution Tailing Factor HETP k'

Sulbaktam 10.380 1054804 15.262 4370.064 7.357 1.326 34.324 0.536 Ampisilin 21.383 616270 30.023 658.817 5.556 0.874 227.681 2.164


57


5/26/2016 11:43:32 1 / 1



<Chromatogram>

Chromatogram


uV

30000 S u l b a k t a m

20000

10000

Am

pis

il

in

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm





58


5/26/2016 11:44:05 1 / 1



<Chromatogram>

Chromatogram

Unknown Sample D:\DATA FILE HPLC\TAHUN 2016\Ampisilin-sulbaktam resti farmasi\Presisi\Presisi.-4.lcd

uV

30000 S u l b a k t a m

20000

10000

Am

pis

il

in

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm





59


5/26/2016 11:50:07 1 / 1



<Chromatogram>

Chromatogram


uV

30000 S u l b a k t a m

20000

10000

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm





60


5/26/2016 11:00:08 1 / 1



<Chromatogram>

Chromatogram


uV

40000

S u l b a k t a m

30000

20000

10000

Am

pis

ilin

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm





61

Lampiran 4. Kromatogram akurasi 80% 6/1/2016 04:57:20 1 / 1


D:\DATA FILE HPLC\TAHUN 2016\Ampisilin-sulbaktam resti farmasi\Akurasi\akurasi 80-1.lcd

Acquired by : Resti Wulan Dari Sample Type : Sampel Placebo Sample Name : Akurasi 80-1 Sample ID : AMP/SBT Data File Name : akurasi 80-1.lcd Method File Name : ok10052016sulbaktam.lcm Batch File Name : 01062016.lcb Report File Name : Default.lcr Data Acquired : 6/1/2016 12:28:19 PM Data Processed : 6/1/2016 12:28:19 PM

<Chromatogram>

Chromatogram

Unknown Sample D:\DATA FILE HPLC\TAHUN 2016\Ampisilin-sulbaktam resti farmasi\Akurasi\akurasi 80-1.lcd uV

30000

S u l b a k t a m

20000

10000

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm

D:\DATA FILE HPLC\TAHUN 2016\Ampisilin-sulbaktam resti farmasi\Akurasi\akurasi 80-1.lcd Detector A ID# Name Area Conc. Theoretical Plate# Resolution Tailing Factor HETP k' 1 Sulbaktam 822499 11.772 4227.272 11.428 1.305 35.484 3.031 2 Ampisilin 486233 23.584 526.468 5.015 0.772 284.917 7.266


Lampiran 4 (Lanjutan) 6/1/2016 04:57:43 1 / 1




<Chromatogram>

Chromatogram


30000

S u l b a k t a m

20000

10000

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm



62


6/1/2016 04:57:59 1 / 1




<Chromatogram>

Chromatogram


30000

S u l b a k t a m

20000

10000

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm



63

Lampiran 5. Kromatogram Akurasi 100%

6/1/2016 05:00:28 1 / 1




<Chromatogram>

Chromatogram

Unknown Sample D:\DATA FILE HPLC\TAHUN 2016\Ampisilin-sulbaktam resti farmasi\Akurasi\akurasi 100-1.lcd

uV

40000

30000

20000

10000

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm



64


6/1/2016 05:05:35 1 / 1




<Chromatogram>

Chromatogram


uV

40000

30000

20000

10000

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm


Detector A ID# Name Area Conc. Theoretical Plate# Resolution Tailing Factor HETP k' 1 Sulbaktam 1055775 15.277 4369.136 14.774 1.328 34.332 2.942 2 Ampisilin 617610 30.089 658.040 5.553 0.869 227.950 7.121


65


6/1/2016 05:05:52 1 / 1




<Chromatogram>

Chromatogram


uV

40000

30000

20000

10000

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm




66

Lampiran 6. Kromatogram Kurasi 120%

6/1/2016 05:06:09 1 / 1




<Chromatogram>

Chromatogram


uV

40000

30000

20000

10000

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm




67


6/1/2016 05:06:25 1 / 1




<Chromatogram>

Chromatogram


uV

40000

30000

20000

10000

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm




68


6/1/2016 05:06:39 1 / 1




<Chromatogram>

Chromatogram


uV

40000

30000

20000

10000

0 1Det.A Ch1

0 5 10 15 20 25 30

min

1 Det.A Ch1 / 230nm



D:\DATA FILE HPLC\TAHUN 2016\Ampisilin-sulbaktam resti farmasi\Akurasi\akurasi 120-3.lc

69

70

Lampiran 7. Grafik Uji Linieritas

LABORATORIUM PUSAT POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES BANDUNG

Jl. Babakan Loa, Gunung Batu – Cimahi Utara 40514 Telp./Fax. (022) 2004085, e-mail : [email protected]

ANALYSIS REPORT LC-20 Prominance - SHIMADZU

Calibration Curve

ID# : 1

Name : Sulbaktam

Quantitative Method : External Standard

Function : f(x)=66559.1*x+38961.7

Rr1=0.9991647 Rr2=0.9983301

MeanRF:69706.8 RFSD:2542.09 RFRSD:3.64684

FitType : Linear

ZeroThrough : Not Through

Weighted Regression : None

Detector Name : Detector A

Area

[*10^6]

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

Conc. [*10^1]

# Conc. () MeanArea Area 1 5.000 367624.9 367625 2 10.000 713820.2 713820 3 15.000 1045213.3 1045213 4 20.000 1331268.8 1331269 5 25.000 1740687.6 1740688 6 30.000 2023862.4 2023862

71


ID# : 2

Name : Ampisilin

Quantitative Method : External Standard

Function : f(x)=20196.3*x+9925.21

Rr1=0.9982438 Rr2=0.9964907

MeanRF:20492.6 RFSD:728.387 RFRSD:3.55439

FitType : Linear

ZeroThrough : Not Through

Weighted Regression : None

Detector Name : Detector A

Area

[*10^6]

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

Conc. [

# Conc. () MeanArea Area 1 10.000 197382.4 197382 2 20.000 424698.0 424698 3 30.000 637968.7 637969 4 40.000 786902.8 786903 5 50.000 1044164.6 1044165 6 60.000 1209656.0 1209656

72

Lampiran 8 Alat Yang Digunakan

Jarum Suntik HPLC Mikro Pipet

KCKT Shimadzu Prominance L20 Detektor UV

73


Sonikator Alat Gelas

Neraca Analitik

74


Labu Ukur dan Vial Syringe dan membran filter 0,45µm

Sampel Standar

75

Lampiran 9. Dokumentasi Kegiatan

validasi metode analisis ampisilin dan sulbaktam...

Documents