Prinsip Dasar Uji Widal:

Uji aglutinasi

Antigen adalah suspensi kuman Salmonella (tidak larut) yang direaksikan dengan antibodi spesifik terhadap kuman tersebut yang ada di dalam serum penderita.

Cara mempersiapkan Antigen

• Identifikasi kuman:

Identifikasi morfologi kuman: media SS (Salmonella Shigella agar): halus, opaque, transparan dan tidak berwarna.

Pengecatan Gram: batang Gram negatif.

Uji Biokimia pada media:TSI (Triple Sugar Iron), LIM (Lysine Indole Moltility) dan SC (Simmons Citrate),

inkubasi suhu 37C; 18-24 jam.

Uji serologis: antisera O dan H (S. typhi), antisera H (S. paratyphi A dan B)

Spesies

TSI

SC L I MSlant Butt Gas H

2S

S. typhi Alk Acid - + - + - +

S. Paratyphi A Alk Acid + - - - - +

S. Paratyphi B Alk Acid + + - + - +

Antigen H (Bailey/Scott)

Pilih strain kuman Salmonella yang motil, dan halus. Motilitas: dikultur pada agar 0,3-0,4%.

Inokulasi pada infusion broth atau trypticase soy broth, inkubasi pada suhu ruangan 24-48 jam.

Tambahkan formalin (40% formaldehyde) konsentrasi menjadi 0,3%, letakkan pada lemari es 48 jam.

Encerkan suspensi stok dengan larutan bufer fosfat (pH 6,8–7) yang berisi 0,3% formalin hingga kepadatan sel setara dengan standar 3 Mc Farland.

Biarkan stabil dalam lemari es 2 minggu sebelum digunakan.

Antigen H (Mikrobiologi PK)

Pilih strain kuman Salmonella yang motil, dan halus. Inokulasi pada agar Mueller Hinton, inkubasi 37C, 24 jam.Kerok dengan ose, masukkan pada TSB atau TPB, aduk, inkubasi 37C, 24 jam.Tambahkan formalin (40% formaldehyde) hingga konsentrasi menjadi 0,3%, letakkan dalam lemari es 3-4 hari, sentrifus dan cuci dengan salin hingga jernih.Encerkan dengan bufer fosfat hingga 3 Mc Farland. Simpan dalam lemari es.

Antigen O (Bailey/Scott)

Tanamkan koloni kuman yang halus dari agar pada botol Roux yang mengandung 2% kaldu atau pada trypticase soy agar. Inkubasikan suhu 36C; 18-24 jam.

Panen kuman dan letakkan pada botol sentifus dengan sejumlah salin.

Tambahkan 95% alkohol dengan rasio 4:1 (Alkohol:suspensi kuman). Kocok 30 menit, letakkan pada suhu kamar, dalam gelap selama 48 jam.

Sentrifus, buang supernatan, cuci 2 kali dengan salin 0,85%.

Resuspensi dengan bufer fosfat pH 6,8-7 yang berisi 0,3% formalin.

Encerkan dengan salin hingga kepadatan sel setara dengan standar 3 Mc Farland.

Antigen O (Mikrobiologi PK)

Tanamkan koloni kuman yang halus pada Mueller Hinton agar. Inkubasikan suhu 37C; 18-24 jam.

Panen kuman dan letakkan pada botol sentifus dengan sejumlah salin.

Tambahkan 95% alkohol dengan rasio 4:1 (Alkohol:suspensi kuman). Kocok 30 menit, letakkan dalam lemari es 3-4 hari.

Sentrifus, buang supernatan, cuci 2 kali dengan salin 0,85%.

Resuspensi dengan bufer fosfat pH 6,8-7 yang berisi 0,3% formalin.

Encerkan dengan salin hingga kepadatan sel setara dengan standar 3 Mc Farland. Simpan dalam lemari es.

Cara Uji Widal

• Ada dua cara:• 1. Tes slide• 2. Tes Tabung

Tes Slide

• Uji penyaring:Pada gelas objek:2 tts serum penderita + 2 tts suspensi antigen, campur dengan gelas pengaduk, gerakkan gelas objek dengan gerakan memutar perlahan 5 menit, suhu kamar, aglutinasi dilihat dengan bantuan lampu neon atau cahaya matahari dekat jendela kaca.

Uji titrasi:Serum penderita diencerkan serial

Titer

Perbandingan

Serum (l) Pengencer serum (l)

Antigen (l)

1:20 10 30 40

1:40 7 34 40

1:80 5 35 40

1:160 4 36 40

1:320 3 38 40

Contoh pengenceran serial (dari kit reagensia lokal)

Tes Tabung

Bahan : Serum penderita

Alat : 1. Rak kecil berlubang 24 dan tabung venoject 3 ml.

2. Pipet serologi 1 ml dengan skala 0,01 ml.

3. Mikropipet 50μL. 4. Inkubator.

Reagen : Antigen Widal O = antigen Salmonella typhi (somatik) H = antigen Salmonella typhi

(flagelar) A = antigen Salmonella paratyphi

A (flagelar) B = antigen Salmonella paratyphi

B (flagelar)

Cara kerja

Lakukan pengenceran serum (lihat diagram berikut)Tambahkan antigen 0,25 ml pada tiap tabungCampur dengan cara menggoyang rak 3-4xInkubasi pada suhu 37C selama 24 jamLihat adanya aglutinasi pada dasar tabung dengan bantuan cermin (Widal reader)

Cara membaca aglutinasi

• Pola sedimen di dasar tabung, lihat diatas cermin cekung.

• Negatif: sedimen bulat, tepi halus.• Positif: sedimen melebar ke tepi dengan pola

ireguler.• Setelah dilihat, goyangkan tabung:

aglutinin H : agregat flokuler, mudah pecahaglutinin O : agregat granuler dan halus

Diagram cara pengenceran sebelum diencerkan dengan

penambahan antigen 0,25 ml (2x pengenceran)

1:6401:3201:1601:40 1:801:20

0,25 ml

0,25 ml

0,25 ml

-100μl PZ

2ml PZ 1ml PZ 1ml PZ 1ml PZ 1ml PZ 1ml PZ

+100μl serum 1 ml

Buang

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

B

A

H

O

1 ml

Kontrol

Kontrol Positif• Uji Widal dilakukan terhadap serum yang

mengandung aglutinin dengan titer >1:160• Dalam 1 rak, dikerjakan bersama beberapa rak

yang berisi serum penderita

• Kontrol Negatif• 4 tabung berisi 0,25 ml PZ dan 0,25 ml antigen

(O, H, A dan B)

Interpretasi

• Kriteria diagnostik untuk demam tifoid:bila titer dari aglutinin O saja atau dan H 2 kali batas atas titer normalnya, Aglutinin O: 1:80 Aglutinin H: 1:40Aglutinin A: 1:40 Aglutinin B: 1:80

ataubila dalam jangka waktu 5-7 hari terjadi kenaikan titer aglutinin sebesar 4 kali.

Laboratorium Mikrobiologi Patologi Klinik

• Cut off: anak-anak (1-13 th) : 1:80• dewasa : 1:160• Contoh cara penulisan:• Titer 1:160 kemungkinan demam tifoid,

paratifoid tidak dapat disingkirkan.• Titer >1:160 hasil titer O, H lebih tinggi dari

batas normal di laboratorium kami.

Hasil Negatif

Tidak ada infeksi S. typhiDalam status carrierAntigen bakteri belum adekuat merangsang pembentukan antibodiKesulitan teknis atau kesalahan dalam melakukan uji WidalPengobatan dengan antibiotika sebelumnyaVariasi dalam persiapan antigen

Hasil Positif

Menderita demam tifoidImunisasi dengan antigen SalmonellaReaksi silang dengan Salmonella non-tifoidVariasi dan standarisasi yang kurang, dalam persiapan antigenInfeksi dengan malaria atau enterobacter lainPenyakit lain, seperti dengue

Kelemahan Uji Widal

Antigen: strain bukan dari daerah yang bersangkutan, kekeruhan suspensi yang kurang standarisasi.Kadar aglutinin terlalu tinggi: fenomena prozone negatif semuCara pembacaan: subjektifAglutinat tidak berwarna: menyulitkan pembacaan

Salmonella-Shigella (SS) agar

• Media agar selektif untuk subkultur kuman Salmonella dan Shigella.

• Buatan OXOID: Lab-Lemco 5g, Pepton 5g, Laktose 5g, garam empedu 8,5g, natrium sitrat 10g, natrium tiosulfat 8,5g, ferri sitrat 1g, brilliant green 0,000333g, neutral red 0,025g, agar 12g, ditambah air suling sampai 1 liter. pH media 7,3.

Media Triple Sugar Iron (TSI)

• Untuk identifikasi kuman patogen enterik Gram negatif berdasarkan kemampuan kuman:– meragi laktosa, glukosa dan sukrosa

dengan pembentukan asam dan gas, – memproduksi hidrogen sulfida.

Media Lysine Indole Motility (LIM)

• Media untuk reaksi biokimia, untuk melihat:– Dekarboksilasi lysine – Motilitas kuman– Melakukan tes Indol dengan reagen Kovac

Reagen Kovac diteteskan pada media LIM setelah inkubasi 24 jam.

Media Simmons Citrate (SC)

• Menentukan karakteristik Enterobacteriaceae dengan cara mendeteksi pemakaian sitrat.

Mueller Hinton agar

• Beef, infusion from 300g• Peptone 17,5g• Starch 1,5g• Agar 17gpH = 7,4

Untuk Tes Kepekaan Antibiotika

Pewarnaan Gram (Bailey/Scott)

• Hapusan kuman difiksasi di atas api• Banjiri gelas objek dengan cat kristal violet, 10 detik.• Buang cat, bersihkan dengan larutan iodine.• Banjiri dengan larutan iodine 10 detik.• Cuci dengan air mengalir.• Hilangkan warna dengan larutan alkohol-aseton 10-

20 detik.• Counterstain dengan safranin 10 detik.• Cuci dengan air, keringkan diantara dua kertas

bersih.

Standar Nefelometer Mc Farland

No tab 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Barium Klorida (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Asam sulfur (ml)

9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9

Densitas (x108 /ml)

3 6 9 12 15 18 21 24 27 30