TEST SEROLOGI :DEMAM TIFOID & DEMAM DENGUEE. M. Hidayat, SpPKDep. Patologi Klinik FKUPNVJ

DEMAM TIFOIDPendahuluanDemam tifoid : demam yang ditimbulkan oleh infeksi beberapa Salmonella (S. para-typhi A, S. paratyphi B, S. paratyphi C), khususnya Salmonella typhi (S.typhi).

Pendahuluan (lanjutan) Gejala demam tifoid Biasanya mengenai di saluran cerna Gejala demam > satu minggu, Gangguan pencernaan (seperti konstipasi). Gangguan kesadaran (pada penderita sakit berat).

Pendahuluan (lanjutan)Masa inkubasi 10 14 hari, disertai gejala sakit kepala, lemah, konstipasi, bradikardia dan mialgia. Hallmark : demam berlangsung lama (prolonged and persistent fever) selama 4 8 minggu pada penderita yang tidak diobati.

Pendahuluan (lanjutan)Di Indonesia : penyakit endemik, berhubungan dengan : tingkat kesehatan, tingkat pengetahuan tentang kesehatan sanitasi yang buruk. Penyulit pemberantasan penyakit ini : adanya pembawa kuman yang sehat (carrier), dimana fecal-carrier paling penting.

Pendahuluan (lanjutan)Diperkirakan 10% penderita yang sudah sembuh, dalam 3 bulan pertama selalu mengeluarkan kuman melalui tinja dan urin 2 5% penderita yang sembuh akan menjadi permanent-carrier.

Etiologi Salmonella typhi : basil Gram (-) bersifat aerobik, tidak berspora, bergerak dengan rambut getar. Memiliki 3 macam antigen Antigen O (somatik), sering disebut endotoksin. Antigen H (flagela) Antigen Vi (antigen permukaan)

PatogenesisSalmonella typhi masuk melalui mulut bersama makanan atau minuman yang tercemar. kuman menembus mukosa usus, masuk aliran limfe usus, berbiak dan akhirnya masuk peredaran darah melalui ductus thoracicus.

Patogenesis (lanjutan)Bakteriemia I terjadi 24 72 jam setelah kuman masuk. mencapai organ-organ seperti hati, empedu, limpa, sumsum tulang dan ginjal. Bakteriemia ini berlangsung singkat akibat fagositosis oleh makrofag, masih terus berkembang di organ tertentu (empedu) karena ada kapsel Vi. Proses ini memerlukan waktu 7 10 hari.

Patogenesis (lanjutan)Dari kandung empedu, kembali ke usus halus dan jaringan getah bening, terutama plaque Peyer. menimbulkan reaksi peradangan, hiperplasia dan infiltrasi sel mononuklear, kemudian kuman kembali masuk ke sirkulasi darah lagi (bakteriemia II). Pada bakteriemia II dilepaskan endotoksin.

Pemeriksaan laboratoriumDarah tepiAnemia normositik normokromLeukopenia (3.000 4.000/uL) pada fase demamAneosinofilia pada permulaan penyakitTrombositopenia Limfositosis relatif

Pemeriksaan laboratorium (lanjutan)UrinProteinuriaReaksi Diazo (Erlich)Serologi ( Widal, hemaglutinasi, Elisa, dsb)Bakteriologik : isolasi kuman. Sampel darah, aspirasi sumsum tulang, rose spot, urin, tinja

Test laboratorium untuk membantu menegakkan diagnosis

Test serologis (mendeteksi kenaikan titer/ kadar antibodi terhadap antigen S.typhi dan menentukan adanya antigen spesifik dari S.typhi.Test biakan untuk mendeteksi kuman S.typhi dari spesimen darah, urin, feses, sumsum tulang.Test Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk mendeteksi DNA spesifik S. typhi.

Bahan Biakan / Kulturdarah, urin, feses, sumsum tulang.darah : minggu I atau II sakiturin : minggu II atau III sakittinja : minggu II atau III sakitsumsum tulang : minggu I sakit.

DIAGNOSISDiagnosis demam tifoid sulit ditegakkan tanpa test laboratorium, sebab gambaran klinis penyakit ini sangat bervariasi dan pada umumnya tidak khas (spesifik). Diagnosis pasti : test biakan/kultur bakteri ditemukan S. typhi.

Test WidalReaksi aglutinasi, dikembangkan pertama kali oleh Widal (1896).Di daerah non endemik, titer H dan O > 1: 80 menyokong diagnosisDi daearh endemik, titer H dan O > 1:160 menyokong diagnosisKenaikan titer antibodi > 4x pada pemeriksaan ulangan 1 atau 2 minggu kemudian menyokong diagnosis

Prinsip Test Widal. reaksi aglutinasi. antigen S.typhi/S.paratyphi bila dicampurkan dengan serum penderita demam tifoid yang mengandung antibodi terhadap S.typhi/S.paratyphi akan terjadi aglutinasi.

Peralatan dan bahan pemeriksaan serum penderita demam tifoidantigen somatik (O) dan flagelar (H) larutan NaCl 0.85% (0.9%)1 microplate plastik dengan sumur-sumur kecilmikropipet dengan tips-nya.mesin penggoyang (shaker machine)

Antigen Somatik (O) Salmonella grup A (S.paratyphi A): A-OSalmonella grup B (S.paratyphi B): B-OSalmonella grup C (S.paratyphi C): C-OSalmonella grup D (S. typhi) : O

Antigen flagelar (H) Salmonella grup A : A-H Salmonella grup B : B-H Salmonella grup C : C-H Salmonella grup D (S.typhi) : H

Persiapan Penderita. Penderita sebaiknya belum mendapat terapi antibiotik.Jenis sampel : serum penderita tersangka demam tifoid, tidak hemolisis

Pengambilan sampel. Pengambilan sampel darah sebaiknya dilakukan pada fase akut dan fase konvalesen.

Cara Kerja Test kualitatif dengan Slide teteskan satu tetes (0.04 mL) serum penderita (tidak diencerkan) di slide. teteskan satu tetes suspensi antigen yang telah dikocok homogen di samping tetes serum.campur serum dan suspensi antigen dengan batang pengaduk, sebarkan memenuhi lingkaran pengamatan.

Cara kerja (lanjutan)goyang slide perlahan-lahan dgn tangan selama 1 (satu) menitamati adanya aglutinasi pada slide baik antigen O dan antigen H.bila terjadi aglutinasi, lanjutkan test konfirmasi dengan menggunakan tabung reaksi untuk menentukan titer antibodi dalam sampel.nilai titer = pengenceran yang masih ada aglutinasi.

Test Kuantitatif dengan Cara Slide pipet serum sampel yang belum diencerkan 0.08 mL (80 uL), (nilai 1 : 20)0.04 mL (40 uL), (1 : 40)0.02 mL (20 uL), (1 : 80)0.01 mL (10 uL). (1 : 160)0.005 mL (5 uL) (1 : 320)

Cara test kuantitatif dengan cara slide (lanjutan)2. untuk pembanding, pipetkan 0.04 mL kontrol (+) dan 0.04 mL kontrol (-) di tempat terpisah pada slide.3. teteskan satu tetes suspensi antigen yang telah dikocok homogen ke atas sampel serum, kontrol (+) & kontrol (-).

Cara test kuantitatif menggunakan slide (lanjutan)campurkan serum dan suspensi antigen dengan batang pengaduk (tusuk gigi), mulai dari pengenceran terkecil ke pengenceran serum yang lebih besar, sebarkan campuran sampai memenuhi lingkaran pengamatan. Lakukan juga terhadap kontrol (+) dan kontrol (-).

Cara test kualitatif dengan cara slide (lanjutan)putar slide dengan tangan atau rotator selama 2-3 menit.baca hasil reaksi di bawah penerangan yang baik. Hasil positip ditandai dengan adanya aglutinasi.nilai titer antibodi sesuai dengan nilai pengenceran tertinggi yang didapat.

Interpretasi test Widal harus hati-hatiBanyak faktor mempengaruhi hasil test :Stadium penyakit.Pemberian antibiotikaTeknik laboratoriumTest tidak spesifik

TUBEX-TFSuatu pemeriksaan laboratorium untuk mendeteksi adanya antibodi IgM di serum sampel terhadap antigen S.typhi LPS-O9 (lipopolisakarida) dengan metoda Immunoassay Magnetic Binding Inhibition (IMBI). Tingkat inhibisi setara dengan kadar antibodi IgM S.typhi dalam sampel

Prinsip Test TUBEX-TFTUBEX TF mendeteksi adanya antibodi IgM thd antigen LPS-O9 S.typhi di serum penderita dengan cara menghambat reaksi antara antigen berlabel partikel lateks magnetik(brown reagent) dan antibodi monoklonal berlabel lateks warna (blue reagents). Ikatan inhibisi dipisahkan dgn daya magnetik. Hasil dinyatakan dalam skala warna (color scale).

Bahan Pemeriksaan serum atau plasma heparin. JANGAN menggunakan plasma EDTA atau plasma sitrat. Serum lipemik, hemolisis dan ikterik TIDAK BOLEH digunakan, karena warna merah dari hemoglobin (pada hemolisis) atau bilirubin mengganggu warna yang terbentuk. pembacaan hasil test. Serum sampel disimpan pada suhu 28 C atau dibekukan (< -18C) bila belum akan segera diperiksa.

Peralatan & ReagenPipet presisi, vortex dan timer (pencatat waktu)Komponen dalam TUBEX TF :TUBEX TF Brown Reagent, mengandung antigen coated particles.TUBEX TF Blue Reagent, mengandung antibody coated particles. Negative & Positive Control. Reaction Well Strip & Sealing TapeTUBEX TF Colored Sticker

persiapanBiarkan reagen dan serum pada suhu kamar.Kocok (homogenisasikan) semua reagen sebelum digunakan, check apakah semua sedimen telah larut.

Prosedur Test (1)Letakkan TUBEX Reaction Well Strip dengan posisi tegak, nomor V-shape well dihadapan kita. Teteskan 45 uL TUBEX TF Brown Reagent pada tiap V-shape Well.Ag LPS-O9 S.typhi akan melekat pd partikel magnetik warna coklat

Prosedur Test (2)Tambahkan 45 uL sampel penderita, TUBEX TF Positive & Negative Control dan serum penderita pada V-shape Well (sumur-V), campur dengan hati-hati dengan menggunakan pipet (isap-dorong) sebanyak 10 x, usahakan agar tidak terjadi busa.

Prosedur Test (lanjutan)Di V-shape well : kontrol positip : Anti IgM Mab S.typhi berikatan dgn Ag LPS-O9. serum sampel : serum Ab IgM S.typhi berikatan dengan Ag LPS-O9

Prosedur Test (3)Inkubasi selama 2 menitTambahkan 90 uL TUBEX TF Blue Reagent ke semua V-shape well. Di Well kontrol negatip : Mab IgM S.typhi melekat pada partikel lateks warna biru berikatan dgn Ag LPS-O9Di Well serum sampel : Reaksi Mab IgM S.typhi dgn Ag LPS-O9 di-inhibisi oleh Ab IgM S.typhi dari serum

Prosedur test (lanjutan)Tutup TUBEX Reaction Well dgn TUBEX sealing TapeHomogenisasi 2 menitLetakkan well strip di atas skala magnetik untuk reaksi separasi selama 5 menit.Interpretasi hasil.

Interpretasi hasil < 2 negatip tidak menunjukkan infeksi. Kontrol negatip. 3 borderline pengukuran tidak dapat disimpulkanm ulangi test. Bila hasil meragukan, lakukan sampling ulang beberapa hari kemudian 4 positip lemah menunjukkan infeksi demam typhoid

Interpretasi (lanjutan)6-10 positip indikasi kuat demam typhoid aktif. Kontrol positip.Indeterminate : ketidakjelasan pengukuran diakibatkan oleh : 1. Protokol test tidak diikuti dgn baik. Ulangi test 2. Kualitas sampel kurang baik. Lakukan sampling ulangi test

Pemeriksaan Serologi Demam Dengue (IgG/IgM)

Pendahuluan Demam Dengue disebabkan oleh Virus Dengue yang disebarkan oleh nyamuk, Stegomyia aegypti (dulu dikenal sebagai Aedes aegypti) dan Aedes albopictusDikenal 4 serotipe virus : Dengue virus 1 Dengue virus 2 Dengue virus 3 Dengue virus 4

Pendahuluan (lanjutan)virus Dengue, termasuk genus Flavivirus, famili Flaviviridae. berbentuk sferis berukuran 40-50 nm, mempunyai 2 tipe protein : 1) protein struktural (3 macam) : protein C (core), protein M (membran), protein E (envelope) 2) protein non struktural (7 jenis) : NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5.

Pendahuluan (lanjutan)Orang yg terinfeksi sering mengalami demam sub fibril dan sembuh sendiriBila terinfeksi kedua kali dengan virus serotipe lain, keluhan menjadi lebih berat dan dapat mengalami dengue hemorrhagic fever (DHF), dengue shock syndrome (DSS)

Demam DengueDi Indonesia, demam dengue merupakan salah satu masalah kesehatan masyarakat, karena selalu menimbulkan wabah yang muncul pada bulan-bulan tertentu setiap tahun.

Patogenesis dan PatofisiologiSetelah gigitan nyamuk, virus Dengue, berkembang biak di kelenjar limfe regional, menyebar melalui sistem limfatik dan sirkulasi darah ke jaringan lain.Masa inkubasi demam dengue berkisar antara 3 14 hari, umumnya 4 7 hari.

Patogenesis & patofisiologi (lanjutan)demam tinggi disertai kejang dan perdarahan saluran cerna akibat infeksi sekunder (infeksi ke dua kalinya) oleh serotipe lain. demam ringan umumnya terjadi pada infeksi primer.

Patogenesis & Patofisiologi (lanjutan)Hal ini disebabkan antibodi anti-dengue dari infeksi sebelumnya berikatan dengan virus Dengue serotipe lain yang menginfeksi saat ini membentuk kompleks Ag-Ab yang akan merangsang penglepasan sitokin dan mengaktivasi komplemen (penglepasan anafilatoksin C3a dan C5a) yang merangsang pengeluaran histamin.

Patogenesis & patofisiologi (lanjutan)Akibatnya terjadi gangguan fungsi endotel (antara lain peningkatan permiabilitas endotel kapiler ). Terjadi kebocoran / perembesan plasma ke ruang ekstravaskuler, sehingga terjadi renjatan (shock) hipovolemik.

Patogenesis & Patofisiologi (lanjutan)Perubahan vaskuler, kerusakan trombosit, trombositopenia dan gangguan faktor-faktor pembekuan menimbulkan gangguan hemostasis dan terjadi perdarahan. Berat ringannya gejala tergantung pada serotipe dan galur virus Dengue, usia dan sifat genetik penderita serta derajat viremia.

Diagnostic testImmunochromatographic assayIsolation of virusAntigen detection in fixed tissuesRT-PCR (Reverse Transcription-PCR)Hemagglutination-inhibition test

Dengue IgG / IgM Rapid testSolid phase immunochromatographic assay.Sifat Test : rapid, kualitatif deteksi antibodi IgG dan IgM virus Dengue di serum atau plasma.Presumptive diagnosis antara infeksi primer dan infeksi sekunder.

Prinsip TestDidesain secara simultan mendeteksi antibodi IgG dan IgM virus dengueMendeteksi semua serotipe dengue menggunakan campuran protein envelope recombinant dengue.Test dilengkapi dengan 3 garis (pre-coated lines: G (IgG), M (IgM), C (kontrol).Garis C harus selalu muncul pd tiap test

Prinsip TestBila sampel diteteskan di sumur sampel, anti dengue IgG / IgM di serum bereaksi dgn recombinant Dengue virus envelope protein-colloidal gold conjugates membentuk komplek Ag-Ab.Dengan daya kapilaritas, komplek Ag-Ab bermigrasi dan sampai ke anti-human IgG dan/atau IgM yg ada di garis test dan menimbulkan pembentukan warna

Bahan TestDengue IgG/IgM test strip :Gold conjugates : recombinant Dengue virus envelope protein-gold colloid.Garis G : mouse monoclonal anti- human IgGGaris M : mouse monoclonal anti-human IgMGaris kontrol : rabbit anti-Dengue IgG

Bahan Test (lanjutan)Assay diluent : 100mM phosphate buffer, Sodium azide5 uL capillary pipette atau mikropipet

Pengambilan dan Penyimpanan SampelSerum : ambil darah vena, masukkan di tabung reaksi tanpa antikoagulan, biarkan 30 , sentrifuge, pisahkan serum dari bekuan darahPlasma : ambil darah vena, masukkan di tabung reaksi mengandung antikoagulan (heparin/Na-EDTA/Na-sitrat), pisahkan plasma dari sel-sel darah.

Pengambilan & penyimpanan sampelBila tidak segera diperiksa, simpan sampel di suhu 2-8 C.Bila disimpan > 2 minggu, dianjurkan di bekukan.Suhu test : suhu kamar.Sampel mengandung presipitat harus di jernihkan dulu sebelum test.

Pengambilan & Pengumpulan Sampel (lanjutan)Sampel hemolisis, lipemik, ikterik, mengandung faktor rheumatoid dapat mengganggu test.

Prosedure TestSiapkan Kit test dan sampel pada suhu kamar.Isap sampel (serum/plasma) menggunakan pipet kapiler sampai black line (5 uL) atau menggunakan mikropipet. Teteskan serum/plasma 5 uL di sumur bertanda S.

Prosedur Test (lanjutan)Tambahkan 3-4 tetes assay diluent ke sumur assay diluent yang berbentuk bulatBaca hasil test dalam waktu 15 20. (jangan dibaca sesudah 20 )

Interpretasi TestNegatif. Hanya tampak garis pink CPositip. IgM (+) (infeksi dengue primer) : tampak 2 garis pink C dan M. IgG (+)(infeksi dengue sekunder atau pernah terinfeksi di masa lalu) : tampak 2 garis pink C dan G. IgM dan IgG (+) : tampak 3 garis pink C, M, G.Invalid : garis C tidak ada

Keterbatasan TestTest jangan digunakan sebagai satu-satunya test untuk mendiagnosis infeksi dengue (should not be used as the sole criterion for diagnosis)Pada infeksi dini, kadar antibodi mungkin rendah, dan pada beberapa penderita kadar antibodi terdeteksi baru pada hari 7 10. Bila gejala klinik ada lakukan re-test dalam 3 4 hari

Keterbatasan Test (lanjutan)Reaksi silang mungkin dapat terjadi dengan grup Flivivirus (virus dengue, St.Louise encephalitis, Japanese encephalitis, West Nile dan yellow fever).Bila hasil test (-), tetapi gejala klinik ada, disarankan test lagi dengan metoda lain.

Expected valueDengue primer ditandai ditemukannya IgM 3 5 hari pasca infeksi.Dengue sekunder ditandai dengan peningkatan IgG 1 2 hari setelah infeksi dan pada sebagian kasus diikuti dengan peningkatan IgM.

Sensitivitas dan spesifitas testSensitivitas : % jumlah kasus (+) benar dari jumlah semua kasus (+).Jumlah kasus (+) :102Jumlah kasus (+) dgn test ini : 93Sensitivitas test : 93/102 x 100%= 91.2%

Spesifitas testSpesifitas : % jumlah kasus (-) benar dari jumlah seluruh kasus (-).Jumlah kasus (-) : 200Jumlah kasus (-) dgn test ini : 180Jumlah kasus (+) palsu 20Spesifitas test : 180/200 x 100% = 90%