TUGAS PENDAHULUAN

APLIKASI BIOTEKNOLOGI

ISOLASI MIKROBA

NAMA : ERVAN TOGATOROP

NIM : G31113302

KELOMPOK: VI

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

JURUSAN TEKNOLOGI PERTANIAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2015

1. Sebutkan bahan-bahan praktikum beserta mikroba yang akan di isolasiJawab: - Bonggol nanas- Yoghurt : Streptococcus thermophilus- Nata de coco : Acetobacter xylinum

Acetobacter oxidans Acetobacter rancens Acetobacter aceti Acetobacter melagens

- Kubis : - Jeruk : - Inokulum tempe : Aspergillus oryzae- Ragi tempe : - Tape

2. Jelaskan sifat fisik dan kimia dari mikroba yang akan diisolasi masing-masing kelompokLactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus. Kedua bakteri tersebut merupakan bakteri gram positif, tidak membentuk spora, tidak motil, mikroaerofilik. Lactobacillus bulgaricus mempunyai kebutuhan akan nutrisi yang kompleks termasuk ketidakmampuannya memfermentasi sembarang gula kecuali laktosa. Lactobacillus bulgaricus bersifat homofermentatif dan heterofermentatif, serta tumbuh secara optimal pada pH rendah (4.6-5.4). Sedangkan Streptococcus thermophilus merupakan bakteri homofermentatif yang tumbuh secara optimal pada pH yang lebih tinggi edua bakteri tersebut terbukti dapat tumbuh bersama secara simbiosis mutualisme. Streptococcus thermophilus akan berkembang lebih cepat mengawali pembentukan asam laktat melalui fermentasi laktosa, pertumbuhan ini terus berlangsung sampai mencapai pH 5,5. Kondisi ini memberikan lingkungan yang sangat baik untuk pertumbuhan Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus tumbuh karena distimulir adanya histidin dan lisin hasil degradasi protein oleh Lactobacillus bulgaricus. Lactobacillus bulgaricus tumbuh dengan cepat setelah Streptococcus thermophilus mencapai fase stationer. Lactobacillus bulgaricus bersifat lebih tahan terhadap keadaan asam yang tinggi, serta pertumbuhannya dipacu oleh CO2 dan asam format yang dihasilkan Streptococcus thermophilus, sehingga asam laktat yang terbentuk lebih maksimal Kedua starter ini memang sering digunakan pada beberapa macam produksi susu fermentasi. Walaupun kedua mikroorganisme tersebut dapat digunakan secara terpisah, penggunaan keduanya dalam fermentasi susu secara bersama-sama terbukti meningkatkan efisiensi kerja kedua bakteri tersebut. Melihat karakteristik pertumbuhan Lactobacillus

bulgaricus dan Streptococcus thermophilus, maka kombinasi starter yang optimal penting untuk meningkatkan produktifitas dari kedua bakteri tersebut. Berdasarkan uraian di atas, penelitian tentang amobilisasi bakteri asam laktat pada fermentasi susu sapi diharapkan dapat digunakan sebagai salah satu alternatif untuk mencari kombinasi starter yang optimal dari Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus

3. Jelaskan contoh media tumbuh !

a. Media padatMedia padat yaitu media yang mengandung agen pemadat (misalnya agar atau gelatin) dengan konsentrasi tertentu sehingga setelah dingin media menjadi padat. Media padat berguna untuk menjaga sel tidak berpindah tempat sehingga akan mudah dihitung dan dipisahkan jenisnya ketika tumbuh menjadi koloni. Media padat juga menampakkan difusi hasil metabolit bakteri sehingga memudahkan dalam pengujian suatu hasil metabolit.

b. Media cairMedia cair yaitu media yang mengandung larutan cari dari satu atau lebih bahan. Media cair tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth). Medium cair akan memberi kesempatan bakteri untuk menyebar dan tercampur dengan seluruh nutrisi sehingga lebih cocok untuk mengoptimumkan pertumbuhan mikroba. Dapat juga untuk mengetahui karakter suatu mikroba berdasarkan kebutuhan

c. Media setengah padat (semisolid) Media setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,30,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat dan tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.

Berdasarkan kandungan bahana. Media sintetik

Media sintetik adalah media yang seluruh komposisinya diketahui. Media sintetik digunakan dalam penelitian mengenai uji metabolisme suatu mikroorganisme. Banyak jenis mikroorganisme kemoorganotrof heterotrof dapat tumbuh pada media sintetik dengan glukosa sebagai sumber karbon dan ammonium salt sebagai sumber nitrogen (Prescott et al., 2002:105). Berikut contoh komposisi media sintetik : BG–11 Medium for Cyanobacteria (g/liter) Agar 10.0g

NaNO3 1.5gMgSO4·7H2O 0.075gKH2PO4 0.04gCaCl2·2H2O 0.036gNa2CO3 0.02gCitric acid 6.0 mgFerric ammonium citrate 6.0 mgEDTA disodium salt 1.0 mgTrace metal mix A5 1.0 mg

b. Media kompleksMedia kompleks adalah media yang sebagian komposisinya tidak diketahui dengan pasti. Media kompleks seringkali dibutuhkan karena kebutuhan nutrisi dari beberapa bakteri tidak diketahui sehingga media sintetik tidak dapat dibuat untuk keperluan ini. Seringkali satu jenis media kompleks dapat cukup kaya untuk memenuhi kebutuhan banyak jenis bakteri. media ini dapat mengandung bahan yang tidak diketahui pasti komposisinya seperti peptone, meat extract dan yeast extract. Contoh media kompleks adalah Nutrient Broth, Tryptic Soy Broth dan Mac Conkey Agar.

Berdasarkan tujuan

a. Media isolasiMedia isolasi adalah media umum yang digunakan untuk mengisolasi suatu mikroba menjadi kultur murni. Biasanya mengandung semua kebutuhan untuk tumbuh, misalnya Blood agar atau Chocolate agar.

b. Media selektif (selective or inhibitory media)Berfungsi untuk menumbuhkan mikroba target / yang diinginkan dan menekan pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan (background flora). Umumnya media selektif menseleksi mikroba target berdasarkan kelompok, genus atau spesiesnya, misalnya EMB agar untuk menseleksi E.coli, Baird parker untuk isolasi S. aureus.

c. Media pengkaya (enrichment media)Media pengkaya termasuk media selektif namun lebih berfungsi untuk memperbanyak mikroba target sehingga saat dilakukan pengkulturan, mikroba yang tidak diinginkan tidak dalam jumlah besar. Media pengkaya harus dalam bentuk cair dan digunakan di awal tahap analisa.

d. Media untuk peremajaan kultur (maintenance of cultures)Media peremajaan kultur seharusnya tidak begitu kaya nutrisi sehingga mempercepat pertumbuhan, misalnya Nutrient agar.

e. Media untuk penentuan kebutuhan nutrisi / kemampuan penggunaan substrat.Media ini berfungsi untuk mendeteksi dan mengidentifikasi kebutuhan suatu substrat dari bakteri (yang tidak diketahui kebutuhan nutrisinya) dengan menghilangkan atau mensubtitusi komponen suatu substrat. Media ini tidak digunakan untuk kebutuhan seharihari namun lebih untuk keperluan penelitian. Sebagai contoh sederhananya adalah Koser Citrate untuk mendeteksi penggunaan citrate sebagai sumber karbon tunggal.

f. Media untuk karakterisasi bakteriUmumnya mengandung nutrisi yang cukup untuk pertumbuhan dan ditambah substrat yang akan diuji penggunaannya. Reagen atau indicator tertentu dapat juga ditambahkan untuk mengetahui hasil reaksi.

g. Media skrining (screening media)Media ini diperuntukkan untuk menggambarkan sekilas reaksi yang diperoleh dari beberapa substrat seperti produksi H2S pada TSI oleh enterobacteria.

h. Media uji mikrobiologi untuk vitamin, asam amino dan antibioticMedia ini memerlukan pengontrolan ketat pada saat preparasinya untuk memastikan kemurniannya. Penggunaan cawan kotor dimungkinkan akan menyediakan nutrisi sehingga hasil uji menjadi rancu. Sedangkan media untuk uji antibiotik tidak begitu membutuhkan kepastian kemurnian media karena nutrisi asing tidak berpengaruh kepada hasil uji.

i. Media dasar tanpa nutrisi (nonnutrient basal media) j. Berfungsi untuk berbagai keperluan pendukung pertumbuhan mikroba seperti pelapisan

Chitin agar menggunakan media chitin yang dilarutkan pada Salt agar

4. Apa fungsi dari larutan fisiologis ?Larutan pengencer/ larutan fisiologis adalah larutan yang digunakan untuk mengencerkan contoh pada analisis mikrobiologi. Pengenceran dilakukan untuk memperoleh contoh dengan jumlah mikroba terbaik untuk dapat dihitung yaitu antara 30 sampai 300 sel mikroba per ml. Pengenceran biasanya dilakukan 1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya. Pengenceran adalah melarutkan atau melepasan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Tujuan pengenceran yaitu untuk mengurangi kepadatan kepadatan bakteri yang ditanam. Pengenceran merupakan proses yang dilakukan untuk menurunkan atau memperkecil konsentrasi larutan dengan menambah zat pelarut ke dalam larutan sehingga volume larutan menjadi berubah. Seperti halnya media, larutan yang digunakan untuk mengencerkan contoh biasanya mangandung buffer untuk menjaga keseimbangan ion dari mikroba. Buffer yang digunakan untuk pembuatan media dan larutan pengencer adalah fosfat. Pengunaan fosfat dikarenakan satu-satunya komponen anorganik yang mengandung sifat buffer pada kisaran pH normal, yaitu merupakan pH yang dapat mempertahankan keseimbangan fisiologi dari mikroba. Selain dari itu fosfat tidak mempunyai unsur racun bagi mikroba. Garam fosfat yang sering digunakan sebagai buffer adalah kalium monohidrogen fosfat atau kalium hidrogen fosfat. Sebagai larutan pengencer, selain larutan yang mengandung buffer fosfat, dapat juga digunakan larutan garam fisiologi (0,85%) atau larutan reagen. Larutan pengencer ditempatkan dalam tabung reaksi adalah 9 ml setiap tabung nya.

Pembuatan Larutan Fisiologis

1. Ditimbang 0.8 gram NaCl dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 100ml.

2. Dilarutkan dengan 100ml air, lalu dihomogenkan3. Dipanaskan di hot plate sambil diaduk hingga larutan mendidih.4. Ditutup dengan alumunium foil.5. Disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 800oC selama 20 menit.

5. Jelaskan macam-macam teknik isolasi Ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari isolat campuran. Dua di antaranya yang sering digunakan adalah teknik cawan gores dan teknik cawan tuang. Prinsip dari kedua teknik tersebut sama, yaitu mengencerkan biakan campuran hingga setiap individu spesies dapat dipisahkan, sehingga setiap koloni yang terbentuk merupakan hasil dari pembelahan satu sel.

a. Metode Cawan Gores Kuadran (Strike Plate) Metode ini praktis, hemat biaya dan waktu, hanya membutuhkan keterampilan. Hasil penggoresan diharapkan tampak seperti gambar di bawah ini. Kesalahan-kesalahan yang umum dilakukan dalam metode ini antara lain : (1) tidak memanfaatkan permukaan medium untuk digores sehingga pengenceran kurang optimal, (2) penggunaan inokulum yang terlalau banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel waktu digores. b. Metode Cawan Tuang (Pour Plate) Metode cawan tuang merupakan teknik lain yang dapat digunakan untuk mendapatkan koloni murni mikroorganisme. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan waktu dan bahan yang lama dan banyak, akan tetapi tidak memerlukan keterampilan tinggi. Biakan campuran diencerkan dengan menggunakan medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan. Pengenceran dilakukan dalam beberapa tahap hingga diperoleh koloni tunggal.