PowerPoint Presentation

Tahapan Dasar Rekayasa GenetikaPemotonganModifikasiPenyambunganDefinisi Rekayasa GenetikaIlmu yang mempelajari pengubahan dan pengkloningan gen untuk menghasilkan sifat baru pada suatu organisme atau untuk membuat substansi biologis, seperti protein atau hormon. Rekayasa genetika terutama melibatkan penciptaan DNA rekombinan, yang kemudian dimasukkan ke dalam materi genetik dari sel atau virus.PemotonganPemotonganPemotongan

Variasi fragmen restriksi oleh enzim restriksi endonukleasePemotongan

Beberapa restriksi endonuklease dan situs pengenalan mereka

PemotonganFaktor yang mempengaruhi proses restriksiMetilasiBuffer yang digunakanContohnya enzim EcoRI, biasanya memotong untaian-GAATTC-, tetapi spesifikasi lebih lambat pada kehadiran gliserol pada konsentrasi lebih besar dari 5% v/v, dan pemotongan mengambil tempat pada -AATT- atau -PuPuATPyPy-.Struktur sekunder pada substratModifikasiProses modifikasi genetik meliputi mutasi, penambahan, dan pengurangan

Pendekatan untuk membuat mutasi dapat dibagi menjadi dua: mutasi berdasarkan enzim restriksi mutasi yang menggunakan oligonukleotidaModifikasi: Mutasi berdasarkan Enzim RestriksiPenghapusan Tempat RestriksiDNA dipotong dengan enzim meninggalkan ujung terpotongBagian yang terpotong diisi dengan DNA polimerase atau degradasi dengan eksonukleaseHasilnya adalah insersi kecil atau delesiPemasukan Tempat RestriksiTempat restriksi tambahan dapat dimasukkan dekat dengan tempat restriksi yang sudah ada Contoh : pembentukan sekuens polilinker dalam pUC dan vektor M13.memungkinkan dengan mutagenesis oligonukleotida dari daerah yang mengandung sekuens sama, tapi tidak identik dengan tempat restriksi.

Modifikasi: Mutasi berdasarkan Enzim RestriksiPembentukan Insersicukup mudah untuk dibentukmemotong tempat restriksi yang sesuai mengisi ujung yang lengket dengan DNA polimerasemenyambung oligonukleotida atau fragmen restriksi yang sesuai dari tempat lain.

Pembentukan Delesidapat dibentuk dengan memotong dan degradasi ujung single-stranded dengan exonuclease. fragmen restriksi yang komplit dapat dipotong dan molekulnya didegradasi. Modifikasi: Mutagenesis OligonukleotidaMutagenesis tanpa PCRmengklon DNA untuk tempat dimutasi, tempat untuk sintesis DNAmenggunakan DNA single-stranded (vektor fase filamentous) atau dsDNA (vektor konvensional) Setelah proses menguatkan oleh oligonukleotida, DNA polimerase dan dNTPs ditambahkan.Oligonukleotida berfungsi sebagai permulaan untuk sintesis pada second strandMutagenesis dengan PCRPCR terkadang dapat digunakan untuk membuat molekul DNA dengan satu atau lebih mutasi acakModifikasiMolekul-molekul yang berperan dalam modifikasiFosfatasemenghilangkan gugus fosfat dari substratnya dengan menghidrolisis asam fosforat monoester (termasuk enzim hidrolase).Metilasemelindungi DNA dari degradasi enzim.Eksonukleasemenghancurkan untai DNA atau RNA pada posisi ujung.

(cont.)ModifikasiPolymeraseditemukan dalam sel-sel yang terlibat dalam polimerisasi polinukleotida, atau penciptaan molekul DNA atau RNA. Terdapat 4 tipe, yakni: 1)DNA-dependent DNA polymerase: berperan mensintesis DNA komplementer dari suatu template DNA; 2) RNA-dependent DNA polymerase: dikenal juga sebagaireverse transcriptaseyang berperan mensintesis DNA dari suatu template RNA; 3) DNA-dependent RNA polymerase: berperan mensintesis RNA dari suatu template DNA; 4) Template-independent polymerase: berperan dalam menambahkan untai nukleotida pada DNA, tanpa harus menggunakan suatu template.

PenggabunganLigasi merupakan penyambungan 2 fragmen asam nukleat menggunakan enzimDikategorikan menjadi 2 berdasarkan bentuk ujung potongan; 1) Blunt ended dan 2) Sticky endedEnzim yang paling umum digunakan adalah ligasePenggabunganTerdapat 2 jenis reaksi ligasi, yakni:Intermolekuler: ujung 2 molekul DNA saling bergabungIntramolekuler: ujung molekul DNA yang sama saling bergabung sehingga membentuk suatu sirkular.

Penggabungan: Enzim yang berperanT4 DNA LigaseEnzim ini disandi oleh T4 bakteriofag dan diproduksi dengan infeksi pada sel dari E. coli., dapat melakukan ligasi blunt-end maupun sticky-end dan memerlukan ATP sebagai kofaktor. E. coli DNA Ligaseenzim endogen dari bakteri, tidak dapat melakukan ligasi blunt-end, memerlukan NAD+ sebagai kofaktor. TopoisomeraseFungsi normal dari enzim ini adalah untuk mengubah tingkat supercoiling dari molekul DNA. TransposaseElemen genetik yang dapat diubah urutannya, dapat berpindah dari satu bagian sebuah DNA ke bagian yang lain, dibawah kerja dari enzim transposase. RecombinaseBeberapa sistem rekombinasi fag tertentu yang dapat mengkatalisis perusakan dan penggabungan dari molekul pada situs tertentu.

PenggabunganFaktor yang mempengaruhiKonsentrasi DNAKonsentrasi EnzimSuhuKomposisi Buffer