rekayasa genetika (kelompok 4).pptx
TRANSCRIPT
Anissa Permatadietha Ardiellaputri
Fransiska Milaniati Pratiwi
Khairu Nuzula
Yunita Florensia
pemotongan modifikasi penyambungan
t u j u a n p e m o t o n g a n D N A
Untuk memudahkan dalam pemisahan DNA dengan sekuen-
sekuen tertentu. DNA yang sudah dipotong dapat digunakan
untuk produksi, kloning, dan identifikasi dalam rekombinasi
molekul DNA
(Nicholl 1994)
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
m e t o d e p e m o t o n g a n D N A
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
2 cara
pemotongan
Secara mekanisPengocokan
(sonikasi)
Secara
enzimatisEnzim restriksi
j a l a n p e m o t o n g a n
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
s o n i k a s i
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
http://www.diagenode.com/en/topics/sonication/sonication.php
s o n i k a s i
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
http://www.diagenode.com/en/topics/sonication/sonication.php
e n z i m a t i s
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA dengan
sekuen yang didefinisikan
Enzim restriksi yang mengikat DNA pada sekuen yang
spesifik dinamakan regnition sites (Sofer 1991).
Enzim ini ditemukan pada sel bakteri yang berfungsi
sebagai bagian dari mekanisme protektif yang disebut
restriction mechanism system.
e n z i m a t i s (sekuens pengenal)
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
Adalah situs pengenalan merupakan sekuen DNA yang
menjadi tempat menempelnya enzim restriksi dan
melakukan pemotongan pada sekuen tersebut
Sekuen Pengenal Ecori
e n z i m a t i s (jenis enzim restriksi)
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
e n z i m a t i s (jenis enzim restriksi)
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
e n z i m a t i s (hasil restriksi)
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
e n z i m a t i s (jenis enzim restriksi)
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
e n z i m a t i s (hasil restriksi)
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
e n z i m a t i s (nomenclature)
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
Contoh berikut enzim EcoRI yang memiliki pola
e n z i m a t i s (karakteristik enzim restriksi)
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
PALINDROMIK
e n z i m a t i s (karakteristik enzim restriksi)
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
Setiap enzim mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada
utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang basa, diperkirakan
akan memotong setiap 256 nukleotida.
Asumsi : setiap basa mempunyai kemungkinan yang sama
untuk muncul, yaitu sebesar 1/4 (kemungkinan muncul 1 dari
4 basa). Jadi jika sekuen pengenalan mempunyai panjang 6
basa, maka perhitungannya menjadi: (1/4)6 = 1/4096.
e n z i m a t i s (karakteristik enzim restriksi)
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
Enzim restriksi yang berbeda, dapat mempunyai situs
pengenalan yang sama, isoschizomers
Contoh :
e n z i m a t i s (karakteristik enzim restriksi)
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
Beberapa enzim yang berbeda dapat membentuk akhiran
yang sama. Contoh Sau3AI menghasilkan akhiran GATC-
begitu juga dengan BamHI
Pemotongan dipengaruhi oleh :
Metilasi
Buffer
Struktur sekunder dalam substrat
e n z i m a t i s (karakteristik enzim restriksi)
Re ka y a s a G e n e t i ka (PEMOTONGAN , M o d i fi ka s i , & Pe n y a m b u n g a n )
Aktivitas Enzim diukur dalam sebuah unit
Preparasi restriksi endonuklease digunakan untuk kloning
seharusnya terbebas dari nukleases yang lainnya
Digesti parsial mungkin berguna
Cleavage sites dapat diketahui menggunakan molekul
standard
Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , MODIFIKASI , & Pe n y a m b u n g a n )
e n z i m y a n g b e r p e r a n
Phosphatases
Polymerases
Exonycleases Methylases
Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , MODIFIKASI , & Pe n y a m b u n g a n )
p h o s p h a t a s e s
Enzim yang secara hidrolitik membuang gugus phosphate
dari molekul DNA, menggantinya dengan gugus hidroksil
Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , MODIFIKASI , & Pe n y a m b u n g a n )
p o l y m e r a s e s
DNA-dependent DNA polymerases
RNA-dependent DNA polymerases
DNA-dependent RNA polymerases
RNA-dependent RNA polymerases
Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , MODIFIKASI , & Pe n y a m b u n g a n )
e x o n u c l e a s e s
Memendekkan rantai dobel DNA dengan 2 jalan :
Memindahkan strands secara terpisah
Memindahkan kedua strands dengan
bersamaan
Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , MODIFIKASI , & Pe n y a m b u n g a n )
e x o n u c l e a s e s
Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)
l i g a s i
Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)
l i g a s i
INTERMOLEKULAR
• ujung dari molekul
diligasikan dengan
ujung dari molekul
yang lainnya
INTRAMOLEKULAR
• ujung dari molekul
diligasikan dengan
ujung dari molekul
itu sendiri
Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)
l i g a s i(enzim yang berperan)T4 DNA
Ligase
E.coli DNA Ligase
TopoisomeraseTransposase
Recombinase
Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)
l i g a s i(enzim yang berperan)
1. T4 DNA ligase
dikodekan oleh bakteriofage T4 dan diproduksi pada infeksi sel
E.Coli, dapat digunakan untuk ligasi sticky ends dan blunt
ends, butuh ATP, butuh 3’-hydroxyl dan 5’-gugus fosfat pada
molekul untuk disatukan
2. E.coli DNA ligase
– Tidak dapat digunakan untuk ligasi blunt-ended
– butuh 3’-hydroxyl dan 5’-gugus fosfat pada molekul untuk
disatukan
– NAD+ sebagai kofaktor
Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)
l i g a s i(enzim yang berperan)
Action of DNA
ligase
Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)
l i g a s i(enzim yang berperan)
3. Topoisomerase
– Mengubah derajat supercoiling dari molekul DNA.
– Dengan membelah satu atau dua strands, rotasi duplex
dan menyegelnya.
– Diberikan DNA molekuler linier dengan topoisomerasi
terlampir diakhir dan merupakan target molekul yang
sesuai, enzim akan meligasi keduany, oleh karena itu
enzim ini cepat
Re ka y a s a G e n e t i ka ( Pe m o t o n g a n , M o d i fi ka s i , & PEMOTONGAN)
l i g a s i(enzim yang berperan)
4. Transposase
– Mampu memindahkan DNA satu sama lain
– Dapat digunakan sebagai jalan untuk menyisipkan
features seperti replikasi asli atau gen antibiotik
resistansi kedalam molekul
5. Recombinase
pemurnian plasmid
gel elektrofore
sissekuensing
t r a n s f o r m a s i g e n e t i k
Transformasi genetik termasuk salah satu cara
terjadinya perubahan sel akibat adanya sel dari luar.
Transformasi jarang terjadi alami
Transformasi pada bakteri digunakan untuk rekayasa
genetika
transformasi genetik
Dalam rekayasa genetika, transformasi berperan
penting untuk kloning molekuler
Gen yang ingin digandakan, disisipkan ke dalam vektor.
Vektor mengganda dan gen yang diinginkan pun
bereplikasi
transformasi dalam konteks genetic engineering
transformasi genetik
komponen transformasi genetik
vektor
gene of interest
host
vektor
Vektor adalah materi genetik yang bersifat Replicon atau
mudah mengganda. Sifat ini yang menjadikan gen dapat
mengganda dengan cepat
Contoh vektor yang sering digunakan adalah plasmid
vektor plasmid
Plasmid biasanya memiliki gen yang mengekspreksikan
resistansi terhadap antibiotik tertentu
Plasmid sangat mudah untuk mengganda
Untuk berperan sebagai vektor, plasmid pertama-tama di
isolasi sehingga dapat disispkan dengan gene of interest
gene of interest
Gen ini adalah gen yang ingin disisipkan untuk
mendapatkan sel baru dengan sifat yang diinginkan
Misalnya : gen antihama untuk sel tumbuhan ; gen pengurai
logam untuk bakteri sebagai penanggulangan limbah ; dll
Gen itu diisolasi dari gen asal setelah dilakukan sekuensing
dgn cr elektroforesis
host
Host adalah sel yang akan dimasukan plasmid rekombinan. Atau
dengan kata lain host adalah sel yang akan bertransformasi
Host yang biasa digunakan adalah E. Coli
Untuk transformasi yang bertujuan untuk menghasilkan suatu
produk, host kemudian dipecah dengan metode lisis alkali
memasukkan insert ke dalam host
Agar Plasmid bisa masuk kedalam sel, maka perlu rekayasa
terhadap Permeabilitas sel host.
Karena faktor ini menyebabkan transormasi alami jarang
terjadi
Caranya dengan menginkubasikan sel dalam larutan kalsium
klorida kemudian mengaplikasikan gelombang panas
isolasi dan purifikasi plasmid
Untuk dapat menyisipkan gene of interest kedalam plasmid
dan membuat plasmid rekombinan, sebelumnya plasmid
yang ingin digunakan sebagai vektor perlu diisolasi
Teknik isolasi dari plasmid ada bermacam-macam.
p e m u r n i a n p l a s m i d
isolasi dan purifikasi plasmid
Pada prinsipnya, yang pertama dilakukan adalah melisis sel
bakteri yang plasmidnya ingin dijadikan vektor
Kemudian komponen sel yang terlisis tersebut disentrifugasi
sehingga akan terpisah berdasarkan berat molekulnya.
Setelah itu dengan menggunakan membran dilakukan
pemisahan antara DNA sirkuler dan DNA kromosomal dengan
Membrane Binding atau penambahan reagent seperti EtBr.
p e m u r n i a n p l a s m i d
isolasi dan purifikasi plasmid
p e m u r n i a n p l a s m i d
mendapatkan gene of interest
Gene of Interest atau Insert didapatkan dengan melakukan
pemotongan DNA tepat pada basa nitrogen yang mengkodekan
protein yang diinginkan
Untuk dapat memisahkan DNA yang akan disisipkan dari
keseluruhan DNA digunakan metode Gel elektroforesis
p e m u r n i a n p l a s m i d
gel elektroforesis
Gel elektroforesis adalah teknik analitik untuk memisahkan
protein berdasarkan ukuran molekulnya.
Karena medium gel yang digunakan berpori dengan diameter
tertentu. maka molekul yang lebih besar akan membutuhkan
waktu yang lebih lama untuk melewati medium.
Karena itu fragmen-fragmen DNA akan terpisahkan
berdasarkan ukuran fragmenya
gel elektroforesis
gel elektroforesis DNA
Molekul asam nukleat di atur didalam media yang memiliki
viskositas tinggi yaitu gel.
Kemudian medan listrik diinduksikan sehingga asam nukleat
akan bergerak ke arah anoda karena muatan negatif yang
dimiliki gula-fosfat.
Karena perbedaan ukuran maka molekul yang lebih besar akan
kesulitan melewati gel sementara molekul yang lebih kecil akan
lebih mendekati anoda dibanding molekul yang lebih besar.
Gel yang biasa digunakan untuk elektroforesis DNA adalah
Agarosa atau Poliakrilamida.
gel elektroforesis dalam rekayasa genetika
Untuk dapat menyisipkan Gen kedalam plasmid,
sebelumnya perlu diketahui fragmen yang mengandung
gen yang diinginkan.
Maka perlu diketahui urutan atau sekuens dari basa
nitrogen dalam DNA
Ada 2 metode yang umum dilakukan untuk menentukan
sekuens DNA
metode maxam-gilbert
Ditemukan oleh Allan Maxam dan Walter Gilbert
Prinsipnya adalah menambahkan bahan kimia sehingga
memutus rantai DNA
Basa nitrogen Purin diputus dengan Asam Format
Guanin direaksikan dengan Dimetil Sulfat
Pirimidin direaksikan dengan hydrazine
Basa nitrogen Cytosin diputus dengan hydrazine yang
ditambah dengan garam dapur
s e k u e n s i n g
metode sanger
Salah satu metode untuk melakukan Sekuensing adalah
Metode Sanger atau Chain Termination Methods.
s e k u e n s i n g
metode sanger
Setelah terjadi pemutusan basa nitrogen akibat pengikatan
ddNTP, fragmen tersebut akan dibaca oleh gel elektroforesis.
s e k u e n s i n g
DNA PRIMER
dNTP
ddNTP
metode sanger
s e k u e n s i n g
hasil pembacaan
elektroforesis untuk
metode sanger
DNA primer
s e k u e n s i n g
Untuk mendapatkan Sekuens DNA dengan metode
Sanger dibutuhkan Primer DNA
Bagaimana cara mengetahui sekuens
DNA Primer agar dapat menempel di
template DNA?
caranya..... (menduga)
s e k u e n s i n g
Menggunakan metode Maxam-Gilbert
Memutasi secara terkontrol Gen-gen yang paling ujung
sehingga diketahui Gennya
Menyisipkan DNA pada plasmid bakteri yang sudah
diketahui sekuensnya.
Menggunaan DNA spesies yang mirip
kesimpulannya.....Transformasi genetik
Vektor Plasmid
Isolasi Plasmid
Insert
Sekuensing
Gel Elektroforesi
s
konsep dasar
faktor keberhasil
anmodifikasi
adalah sebuah teknik ilmiah dalam biologi molekular untuk
memperkuat satu atau beberapa salinan sepotong DNAdi beberapa
kali lipat, menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan tertentu
urutan DNA
p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n
1983
Kary Mullis
k o m p o n e n P C R
PCR
DNA templat
e
DNA primer
dNTP
enzim DNA
Polimerase
D N A t e m p l a t e
sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama
komponen P C R
peyiapan DNA template
Metode LisisMetode isolasi DNA
kromosom / DNA plasmid
p e n y i a p a n DNA t e m p l a t e (metode lisis)
merusak dinding sel tanpa harus merusak DNA yang diinginkan menggunakan buffer lisiscontoh :
5 mM Tris-Cl pH8,5; 0,1 mM EDTA pH 8,5; 0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL
50mM KCl, 10-20mM Tris-Cl dan 2,5mM MgCl20,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL
komponen P C R
buffer yang biasa digunakan
buffer lisis K
D N A p r i m e r
sebagai penginisiasi rekasi polimerisasi DNA secara in vitro
membatasi daerah mana yang akan diamplifikasi pada
reaksi PCR
komponen P C R
Sepotong DNA pendek utas tunggal atau lebih dikenal dengan
oligonuleotida, panjangnya anatar 10 sampai sekitar 40 basa
saja.
F U N G S I D N A P R I M E R
D N A p r i m e r komponen P C R
Desain DNA primer yang bagus
keseimbangan antara spesifisitas dan efisiensiS
pesi
fisi
tasFrekuensi
terjadinya mispri
ming (kesalahan
penempelan)
primer pada
tempat yang
tidak seharusnya
Efisi
ensi Seberapa dekat
perolehan jumlah
produk PCR
dengan nilai
teoritis yang
seharusnya
dicapai
m e n d e s a i n D N A p r i m e r komponen P C R
Tentukan tujuan
Menyiapkan sekuen Referensi (GenBank)
Manual atau perlu bantuan software
Siap mendesain primer
Menguji spesifisitas primer
m e n d e s a i n D N A p r i m e r komponen P C R
m e n d e s a i n D N A p r i m e r komponen P C R
Pada kotak yang tersedia, masukkan sekuen referensi Anda. Anda bisa juga mengunggah
(upload) sekuen dari file di komputer.
Pilih jenis primer yang ingin Anda desain, sense primer (left primer), antisense (right primer)
dan probe untuk hibridisasi (internal oligo). Kotak yang ada di bawahnya bisa diisi jika Anda
sudah memiliki kandidat primer.
Tentukan beberapa parameter lain jika diperlukan seperti excluded region (daerah dimana
primer tidak boleh menempel di situ), targets (primer harus mengapit daerah tersebut)
dan included region(kedua primer harus berada di dalam daerah ini).
Beberapa opsi yang lebih mendalam bisa kita tambahkan pula pada tab General Settings,
Advance Settings, Internal Oligo, Penalty Weights dan Sequence Quality. Namun untuk saat
ini kita biarkan dalam pilihan defaultnya.
Jika semua opsi sudah terisi, tekan tombol PICK PRIMERS untuk memulai pencarian primer
yang terbaik.
m e n d e s a i n D N A p r i m e r komponen P C R
m e n d e s a i n D N A p r i m e r komponen P C R
Primer3Plus akan memberikan beberapa alternatif pasangan
primer yang dapat kita pilih. Pada gambar di atas terlihat
pasangan primer pertama.
Nama Left Primer dan Right Primer
Sekuen kedua primer
Posisi primer pada sekuen referensi, panjang primer, Titik Leleh
(Tm), % GC dan beberapa parameter terkait struktur sekunder
yang mungkin terjadi.
Ukuran produk PCR
p a r a m e t e r D N A p r i m e r komponen P C R
p a n j a n g p r i m e r
• Umumnya panjang primer berkisar antara 18 – 30 basa
• Primer dengan panjang kurang dari 18 basa akan menjadikan
spesifisitas primer rendah
k o m p o s i s i p r i m e r
• Rentetan nukleotida yang sama perlu dihindari, hal ini dapat
menurunkan spesifisitas primer yang dapat memungkinkan
terjadinya mispriming di tempat lain
• Urutan nukleotitda pada ujung 3’ sebaiknya G atau C
p a r a m e t e r D N A p r i m e r komponen P C R
m e l t i n g t e m p e r a t u r ( T m )
• Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena Tm primer• [2(A+T) + 4(C+G)]
i n t e r a k s i p r i m e r - p r i m e r
• Interaksi primer-primer seperti self-homology dan cross-homology
harus dihindari
d N T P
bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam
proses ekstensi DNA
komponen P C R
suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin
trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP (deoksisitidin trifosfat)
dan
dGTP (deoksiguanosin trifosfat)
F U N G S I d N T P
b u f f e r P C R d a n M g C l 2
komponen P C R
untuk menjamin pH medium
buffer
sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase
MgCl2
e n z i m D N A p o l i m e r a s ekomponen P C R
Berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA
Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR
diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena
itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95oC
elongasi proofreading
m e k a n i s m e P C R
m e k a n i s m e P C R
m e k a n i s m e P C R
f a k t o r k e b e r h a s i l a n P C R
Jenis Polimer-ase DNA
1 Konsen-trasi2 Suhu3 Buffer
PCR4 Waktu5
j e n i s p o l i m e r a s e D N A
Kemampuan mengkatalisis reaksi polimerasi DNA pada proses
PCR yang terjadi pada tahap ekstensi untuk DNA rantai panjang
akan berbeda dengan untuk DNA rantai pendek
keberhasilan P C R
k o n s e n t r a s ikeberhasilan P C R
dNTPs
< 1 kbasa 100 uM
> 1kbasa 200 uM
MgCl2Konsentrasi MgCl2 yang
terlalu rendah akan
menurunkan perolehan
PCR. Konsentrasi yang terlalu tinggi akan
menyebabkan akumulasi produk non
target
DNA polimerase
< 2kbasa 1,25 - 2 unit
per 50 uL
> 2kbasa 3 - 5 unit per 50
uL
s u h ukeberhasilan P C R
• 93 – 95 0C• Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan
menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR
denaturasi
• 30 – 67 0C• Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm
primer yang digunakan untuk proses PCR
annealing
• 72 0Celongasi
b u f f e r P C Rkeberhasilan P C R
high-salt buffer
low-salt buffer
w a k t ukeberhasilan P C R
denaturasi
• 30 – 90 detik
annelaing
• 18 – 22 basa
: 30 detik
• > 22 basa :
60 detik
elongasi
• untuk
mengamplifi
kasi setiap
satu kilo
basa DNA
diperlukan
waktu 30 –
60 detik
m o d i f i k a s i t e k n i k P C R
hot start PCR
touch down PCR
nested
M E N I N G K A T K A N S P E S I F I T A S
h o t s t a r t
Sumber: http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mb1509.html
t o u c h - d o w n
Sumber: http://blog.biosearchtech.com/TheBiosearchTechBlog/bid/34285/This-Year-s-MVP-Most-Valuable-Practice-Touchdown-PCR
n e s t e d
Sumber: http://www.pcrstation.com/nested-pcr/
If suitable restriction sites are not present within the DNA
sequence to be amplified, then it is possible to incorporate
them during amplification by inclusion of an appropriate
sequence containing a restriction enzyme recognition site at
the ends of the primers when they are synthesized
H A R D C O P I E S
m o d i f i k a s i t e k n i k P C R
h a r d c o p i e s
Sumber: Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation, Second Edition. New York: Cambridge University Press
STANDAR PCR IPCR
amplification
of sequence beTween the primer
annealing sites
amplification of sequences
outside the primers
I N V E R S P C R
m o d i f i k a s i t e k n i k P C R
i n v e r s P C R
Sumber: Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation, Second Edition. New York: Cambridge University Press
R E V E R S E T R A N S C R I P T A S E P C R ( R T P C R )
m o d i f i k a s i t e k n i k P C R
RT PCR is a PCR amplification of a reverse transcription product
RT PCR amplifies very small amounts of any kinds of RNA
(mRNA, rRNA, tRNA etc.)
RT PCR commonly used in molecular biology where a RNA
strand is reverse transcribed into its DNA complement
(complementary DNA, or cDNA) using the enzyme reverse
transcriptase, and the resulting cDNA is amplified using PCR.
i n v e r s P C R
Sumber: http://bios-project.blogspot.com/2010/04/rt-pcr-reverse-transcriptase-polimerase.html
I N S I T U P C R
m o d i f i k a s i t e k n i k P C R
In Situ PCR (ISH) is a polymerase chain reaction
that actually takes place inside the cell on a slide.
Can be performed on fixed tissue or cells.
Factors affecting In Situ PCR sensitivity:
the strandedness of the target molecule
the lack of a complementary sequence proximal to the
target sequences
i n s i t u P C R
sumber: http://www.pcrstation.com/in-situ-pcr/
Q U A N T I T A T I V E P C R
m o d i f i k a s i t e k n i k P C R
Quantitative PCR commonly used to analyze the PCR
amplification of the target gene in a more accurate way, for
example to estimate the abundance of a particular nucleic acid
molecule in a sample.
A fluorescent stain for dsDNA is added to the reaction and
enables us to monitor the number of replicates as the cycle
progresses.
q u a n t i t a t i v e P C R
Sumber: http://www.rpgroup.caltech.edu/courses/PBL/bootcamp0907.html
M U T A G E N E S I S
m o d i f i k a s i t e k n i k P C R
used to engineer specific mutations in the amplified
sequence by constructing a primer that corresponds
to the mutated sequence rather than the original
A S Y M M E T R I C P C R
m o d i f i k a s i t e k n i k P C R
Preferential amplification of one of the strands by
reducing the amount of one of the two primers
Resulting in a preparation of single-stranded DNA,
which has a number of uses in molecular biology
A N C H O R E D P C R
m o d i f i k a s i t e k n i k P C R
Applied to double-stranded DNA fragments for which the
sequence at only one end of the gene is known.
The aim is to attach the region to be amplified to a piece of
known sequence and then to use that as the second priming
site.
a n c h o r e d P C R
Sumber: Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation, Second Edition. New York: Cambridge University Press.
E M U L S I I O N P C R
m o d i f i k a s i t e k n i k P C R
Incorporate all the reagents inside lipid droplets
and carry out PCR on a much smaller scale.
Advantages increase and decrease the
temperature of small droplets very quickly
a n c h o r e d P C R
Sumber: http://www.ncl.ac.uk/igm/research/facilities/flx/empcr.html
I S O T H E R M A L A M P L I F I C A T I O N
m o d i f i k a s i t e k n i k P C R
Allows templates to be amplified at a constant
temperature (typically around 650C).
It uses a DNA polymerase with strand-displacing activity
and avoids the need for heating to high temperatures.
Can be used for detection of pathogens outside of
specialist laboratories, as it is rapid and avoids the need
for expensive PCR machines
R E F E R E N S I . . . • Bruce, B. (Eds.). 1997. Genome Analysis, a laboratory manual. vol
1 (Analyzing DNA). USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press.• Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation, Second
Edition. New York: Cambridge University Press.• Innis, M.A.(Eds.). 1990. PCR Protocols a Guide to Methods and
Applications. California: Academic Press, Inc..• Newton, C.R. and A. Graham. 1994. PCR. UK: Bios Scientific
Publisher.• Richard Williams, Sergio G Peisajovich, Oliver J Miller, Shlomo
Magdassi, Dan S Tawfik, Andrew D Griffiths (2006). "Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR". Nature methods
• Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
• Watson, J.D., M. Gilman, Witkowski, J., Zohler, M. 1992. Recombinant DNA. USA: Scientific American Books.
• http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mb1509.html
• http://blog.biosearchtech.com/TheBiosearchTechBlog/bid/34285/This-Year-s-MVP-Most-Valuable-Practice-Touchdown-PCR
• http://www.pcrstation.com/nested-pcr/• http://www.pcrstation.com/in-situ-pcr/• http://www.rpgroup.caltech.edu/courses/PBL/bootcamp0907.html• http://bios-project.blogspot.com/2010/04/rt-pcr-reverse-
transcriptase-polimerase.html• http://www.cryst.bbk.ac.uk/pps97/assignments/projects/borek/
Domina/page9.html• http://www.molecularstation.com/pcr/pcr-site-mutagenesis/• http://www.ncl.ac.uk/igm/research/facilities/flx/empcr.htm• www.Youtube.com• www.biotech.iastate.edu/lab.../plasmid_isolation_analysis.html• http://sciencebiotech.net/yuk-mendesain-primer-dengan-
primer3plus/