Sukarti Moeljopawiro

Laboratorium BiokimiaFakultas BiologiUniversitas Gadjah Mada

REKAYASAGENETIKAREKAYASAGENETIKA

RekayasaGenetika

REKAYASA GENETIKA

Teknik untuk menghasilkan molekul DNA yang berisi gen baru yang

diinginkan/kombinasi gen-gen baru atau dapat dikatakan manipulasi organisme

ILMU YANG MENDUKUNG UNTUK DAPAT MELAKUKAN DAN MEMANFAATKAN REKAYASA GENETIKA

Fisiologi mikrobia Genetika molekular Biokimia Biokimia genetik Ilmu pendukung yang lain:

Kultur jaringan Fusi sel Bioreaktor

TAHAP PENTING PERKEMBANGAN BIOTEKNOLOGI MODERN

1944 DNA pembawa informasi genetik1953 struktur DNA1961 kodon1968 ditemukan enzim endonuklease restriksi1973 teknik kombinasi gen berhasil dilakukan1977 hormon tumbuh diproduksi di bakteri dengan

teknik rekombinasi DNA1978 gen untuk insulin diperbanyak1982 Humulin mulai dijual1983 Polymerase Chain Reaction (PCR)1985 PCR dipublikasikan1990 Human Genom Project1990 terapi gen pertama kali diaplikasikan2000 Human Genom Project selesai

DOGMA SENTRAL BIOLOGI

DNA RNA ProteinTranskripsi Translasi

Transkripsi Balik

Replikasi

KROMOSOM – DNA

DNA

ENZIM RESTRIKSI

Ada 3 macam enzim restriksi, yaitu: Tipe I, II dan III

Masing-masing mempunyai spesifisitas tempat pemotongan

Tipe II memotong pada urutan basa pengenal Enzim yang banyak digunakan dalam DNA

rekombinan

Nama terdiri dari 3 singkatan spesies bakteri: BamH I: Bacillus amyloliquefaciens H EcoR I: Escherichia coli RY13

*

SUMBER ENZIM SINGKATANURUTAN

PENGENAL

Bacillus amyloliquefaciens H BamH I GGATCCCCTAGG

Brevibacterium albidum Bal I TGGCCAACCGGT

Escherichia coli RY13 EcoR I GAATTCCTTAAG

Haemophilus aeqyptius Hae III GGCCCCGG

Haemophilus influenzae Rd Hind III AAGCTTTTCGAA

Haemophilus parainfluenzae Hpa II GTTAACCAATTG

*

*

**

*

LANGKAH – LANGKAH MEMBUAT DNA LANGKAH – LANGKAH MEMBUAT DNA REKOMBINANREKOMBINAN

1.1. Isolasi sumber DNA yang diinginkan :Isolasi sumber DNA yang diinginkan : DNA dari total genomicDNA dari total genomic Dibuat dari mRNA yaitu cDNADibuat dari mRNA yaitu cDNA Dibuat secara Dibuat secara in vitroin vitro

2.2. Pemotongan gen yang diinginkanPemotongan gen yang diinginkan Bila hasil pemotongan ujungnya tumpul pada ujung Bila hasil pemotongan ujungnya tumpul pada ujung

perlu ditambahkan Fragmen DNA :perlu ditambahkan Fragmen DNA : Ekor homopolimerEkor homopolimer LinkerLinker Adaptor Adaptor

3.3. Menyisipkan gen yang diinginkan ke alat pembawa Menyisipkan gen yang diinginkan ke alat pembawa “vektor”“vektor” Plasmid : materi gen ekstrakromosomalPlasmid : materi gen ekstrakromosomal Bacteriophage : virus bakteriBacteriophage : virus bakteri Cosmid : gabungan Cosmid : gabungan “cohesive ends” “cohesive ends” bacteriophage bacteriophage

lambda dan plasmidlambda dan plasmid

LANGKAH – LANGKAH MEMBUAT LANGKAH – LANGKAH MEMBUAT DNA REKOMBINANDNA REKOMBINAN (lanjt.)(lanjt.)

4.4.Memasukkan DNA Rekombinan ke Memasukkan DNA Rekombinan ke sel inangsel inang TransformasiTransformasi DNA-packagingDNA-packaging MikroinjectionMikroinjection

5.5.Menyeleksi cloneMenyeleksi clone GenetikGenetik Hibridisasi asam nukleatHibridisasi asam nukleat

LANGKAH – LANGKAH – LANGKAH LANGKAH MEMBUAT MEMBUAT DNA DNA REKOMBINANREKOMBINAN

ISOLASI SUMBER DNAISOLASI SUMBER DNA

PENYISIPAN DNA

CARA INTRODUKSI DNACARA INTRODUKSI DNA

TransformasiTransformasi

E.coliE.coli dapat menyerap DNA dapat menyerap DNA bakteriophage maupun DNA plasmid bakteriophage maupun DNA plasmid dengan perlakuan CaCl3, diikuti dengan perlakuan CaCl3, diikuti perlakuan suhu.perlakuan suhu.

TransfeksiTransfeksi

Sama dengan transformasi, bedanya Sama dengan transformasi, bedanya yang masuk bukan plasmid tetapi yang masuk bukan plasmid tetapi DNA-DNA-phage phage atau virus. Masuknya DNA atau virus. Masuknya DNA diinduksi dengan diinduksi dengan heat shock.heat shock.

CARA INTRODUKSI DNA CARA INTRODUKSI DNA (lanjt.)(lanjt.)

DNA- packagingDNA- packaging

Masuknya molekul Masuknya molekul DNA-phageDNA-phage lebih lebih efisien apabila dikemas di dalam partikel efisien apabila dikemas di dalam partikel phage daripada transfeksi.phage daripada transfeksi.

MicroinjectionMicroinjection

Dengan memakai jarum super kecil Dengan memakai jarum super kecil menginjeksikan DNA secara langsung ke menginjeksikan DNA secara langsung ke inti sel yang ditransformasi.inti sel yang ditransformasi.

SELEKSI SELEKSI CLONE CLONE

SYARAT VEKTOR UNTUK TRANSFER SYARAT VEKTOR UNTUK TRANSFER GENGEN

1.1. Harus berukuran kecilHarus berukuran kecil

2.2. Melangsungkan independen replikasi Melangsungkan independen replikasi (replikasi sendiri)(replikasi sendiri)

3.3. Berisi sisi pengenal tunggal untuk satu Berisi sisi pengenal tunggal untuk satu atau lebih enzim restriksi pada tempat atau lebih enzim restriksi pada tempat yang tidak esensial unruk replikasiyang tidak esensial unruk replikasi

4.4. Memiliki gen untuk resistensi terhadap Memiliki gen untuk resistensi terhadap antibiotikantibiotik

5.5. Tidak mengganggu metabolisme dan Tidak mengganggu metabolisme dan merusak gen dalam sel targetmerusak gen dalam sel target

6.6. Mampu memindahkan secara efisienMampu memindahkan secara efisien

PLASMID PLASMID pBR 322pBR 322

CLONING VECTORSCLONING VECTORS

VECTOR AVARAGE INSERT SIZE

(BP)

Plasmid 4.000

Lambda 20.000

Cosmid 40.000

Yeast Artificial

Chromosome (YAC)

400.000

JENIS VECTORJENIS VECTOR

1. 1. VIRAL VECTORVIRAL VECTORRetrovirusRetrovirusAdenovirusAdenovirusAdeno Ass. VirusAdeno Ass. VirusHerpes virusHerpes virusHepatitis virusHepatitis virus

2. 2. NON- VIRAL VECTORNON- VIRAL VECTOR

JENIS VECTOR JENIS VECTOR (lanjt.)(lanjt.)

RETROVIRUS :RETROVIRUS :Mampu menginfeksi Mampu menginfeksi

bermacam – macam sel bermacam – macam sel targettarget

Tidak merusak sel yang Tidak merusak sel yang diinfeksidiinfeksi

SYARAT SEL INANG YANG BAIKSYARAT SEL INANG YANG BAIK

1.1. Cepat tumbuhCepat tumbuh2.2. Mampu tumbuh pada medium kultur Mampu tumbuh pada medium kultur

yang murahyang murah3.3. Tidak pathogenikTidak pathogenik4.4. Stabil dalam kulturStabil dalam kultur

Sel inang yang banyak digunakan Sel inang yang banyak digunakan untuk mempelajari cloning :untuk mempelajari cloning :

E.coli, Bacillus subtilis, E.coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevicaeSaccharomyces cerevicae

KEBERHASILAN REKAYASA KEBERHASILAN REKAYASA GENETIKAGENETIKA

Keberhasilan Rekayasa Genetika Keberhasilan Rekayasa Genetika tergantung pada :tergantung pada : Kemurnian DNAKemurnian DNA Bersih dari Bersih dari “DNA-ase”“DNA-ase” Kemampuan penguasaan teknik Kemampuan penguasaan teknik

rekombinanrekombinan

Kriteria keberhasilan :Kriteria keberhasilan :

Bila gen asing yang di “clone” dapat Bila gen asing yang di “clone” dapat berekspresi dengan baik dan stabilberekspresi dengan baik dan stabil

Terima Terima KasihKasihTerima Terima KasihKasih