Download - Rekayasa Genetika Revisi Lengkap
Sukarti Moeljopawiro
Laboratorium BiokimiaFakultas BiologiUniversitas Gadjah Mada
REKAYASAGENETIKAREKAYASAGENETIKA
RekayasaGenetika
REKAYASA GENETIKA
Teknik untuk menghasilkan molekul DNA yang berisi gen baru yang
diinginkan/kombinasi gen-gen baru atau dapat dikatakan manipulasi organisme
ILMU YANG MENDUKUNG UNTUK DAPAT MELAKUKAN DAN MEMANFAATKAN REKAYASA GENETIKA
Fisiologi mikrobia Genetika molekular Biokimia Biokimia genetik Ilmu pendukung yang lain:
Kultur jaringan Fusi sel Bioreaktor
TAHAP PENTING PERKEMBANGAN BIOTEKNOLOGI MODERN
1944 DNA pembawa informasi genetik1953 struktur DNA1961 kodon1968 ditemukan enzim endonuklease restriksi1973 teknik kombinasi gen berhasil dilakukan1977 hormon tumbuh diproduksi di bakteri dengan
teknik rekombinasi DNA1978 gen untuk insulin diperbanyak1982 Humulin mulai dijual1983 Polymerase Chain Reaction (PCR)1985 PCR dipublikasikan1990 Human Genom Project1990 terapi gen pertama kali diaplikasikan2000 Human Genom Project selesai
DOGMA SENTRAL BIOLOGI
DNA RNA ProteinTranskripsi Translasi
Transkripsi Balik
Replikasi
KROMOSOM – DNA
DNA
ENZIM RESTRIKSI
Ada 3 macam enzim restriksi, yaitu: Tipe I, II dan III
Masing-masing mempunyai spesifisitas tempat pemotongan
Tipe II memotong pada urutan basa pengenal Enzim yang banyak digunakan dalam DNA
rekombinan
Nama terdiri dari 3 singkatan spesies bakteri: BamH I: Bacillus amyloliquefaciens H EcoR I: Escherichia coli RY13
*
SUMBER ENZIM SINGKATANURUTAN
PENGENAL
Bacillus amyloliquefaciens H BamH I GGATCCCCTAGG
Brevibacterium albidum Bal I TGGCCAACCGGT
Escherichia coli RY13 EcoR I GAATTCCTTAAG
Haemophilus aeqyptius Hae III GGCCCCGG
Haemophilus influenzae Rd Hind III AAGCTTTTCGAA
Haemophilus parainfluenzae Hpa II GTTAACCAATTG
*
*
**
*
LANGKAH – LANGKAH MEMBUAT DNA LANGKAH – LANGKAH MEMBUAT DNA REKOMBINANREKOMBINAN
1.1. Isolasi sumber DNA yang diinginkan :Isolasi sumber DNA yang diinginkan : DNA dari total genomicDNA dari total genomic Dibuat dari mRNA yaitu cDNADibuat dari mRNA yaitu cDNA Dibuat secara Dibuat secara in vitroin vitro
2.2. Pemotongan gen yang diinginkanPemotongan gen yang diinginkan Bila hasil pemotongan ujungnya tumpul pada ujung Bila hasil pemotongan ujungnya tumpul pada ujung
perlu ditambahkan Fragmen DNA :perlu ditambahkan Fragmen DNA : Ekor homopolimerEkor homopolimer LinkerLinker Adaptor Adaptor
3.3. Menyisipkan gen yang diinginkan ke alat pembawa Menyisipkan gen yang diinginkan ke alat pembawa “vektor”“vektor” Plasmid : materi gen ekstrakromosomalPlasmid : materi gen ekstrakromosomal Bacteriophage : virus bakteriBacteriophage : virus bakteri Cosmid : gabungan Cosmid : gabungan “cohesive ends” “cohesive ends” bacteriophage bacteriophage
lambda dan plasmidlambda dan plasmid
LANGKAH – LANGKAH MEMBUAT LANGKAH – LANGKAH MEMBUAT DNA REKOMBINANDNA REKOMBINAN (lanjt.)(lanjt.)
4.4.Memasukkan DNA Rekombinan ke Memasukkan DNA Rekombinan ke sel inangsel inang TransformasiTransformasi DNA-packagingDNA-packaging MikroinjectionMikroinjection
5.5.Menyeleksi cloneMenyeleksi clone GenetikGenetik Hibridisasi asam nukleatHibridisasi asam nukleat
LANGKAH – LANGKAH – LANGKAH LANGKAH MEMBUAT MEMBUAT DNA DNA REKOMBINANREKOMBINAN
ISOLASI SUMBER DNAISOLASI SUMBER DNA
PENYISIPAN DNA
CARA INTRODUKSI DNACARA INTRODUKSI DNA
TransformasiTransformasi
E.coliE.coli dapat menyerap DNA dapat menyerap DNA bakteriophage maupun DNA plasmid bakteriophage maupun DNA plasmid dengan perlakuan CaCl3, diikuti dengan perlakuan CaCl3, diikuti perlakuan suhu.perlakuan suhu.
TransfeksiTransfeksi
Sama dengan transformasi, bedanya Sama dengan transformasi, bedanya yang masuk bukan plasmid tetapi yang masuk bukan plasmid tetapi DNA-DNA-phage phage atau virus. Masuknya DNA atau virus. Masuknya DNA diinduksi dengan diinduksi dengan heat shock.heat shock.
CARA INTRODUKSI DNA CARA INTRODUKSI DNA (lanjt.)(lanjt.)
DNA- packagingDNA- packaging
Masuknya molekul Masuknya molekul DNA-phageDNA-phage lebih lebih efisien apabila dikemas di dalam partikel efisien apabila dikemas di dalam partikel phage daripada transfeksi.phage daripada transfeksi.
MicroinjectionMicroinjection
Dengan memakai jarum super kecil Dengan memakai jarum super kecil menginjeksikan DNA secara langsung ke menginjeksikan DNA secara langsung ke inti sel yang ditransformasi.inti sel yang ditransformasi.
SELEKSI SELEKSI CLONE CLONE
SYARAT VEKTOR UNTUK TRANSFER SYARAT VEKTOR UNTUK TRANSFER GENGEN
1.1. Harus berukuran kecilHarus berukuran kecil
2.2. Melangsungkan independen replikasi Melangsungkan independen replikasi (replikasi sendiri)(replikasi sendiri)
3.3. Berisi sisi pengenal tunggal untuk satu Berisi sisi pengenal tunggal untuk satu atau lebih enzim restriksi pada tempat atau lebih enzim restriksi pada tempat yang tidak esensial unruk replikasiyang tidak esensial unruk replikasi
4.4. Memiliki gen untuk resistensi terhadap Memiliki gen untuk resistensi terhadap antibiotikantibiotik
5.5. Tidak mengganggu metabolisme dan Tidak mengganggu metabolisme dan merusak gen dalam sel targetmerusak gen dalam sel target
6.6. Mampu memindahkan secara efisienMampu memindahkan secara efisien
PLASMID PLASMID pBR 322pBR 322
CLONING VECTORSCLONING VECTORS
VECTOR AVARAGE INSERT SIZE
(BP)
Plasmid 4.000
Lambda 20.000
Cosmid 40.000
Yeast Artificial
Chromosome (YAC)
400.000
JENIS VECTORJENIS VECTOR
1. 1. VIRAL VECTORVIRAL VECTORRetrovirusRetrovirusAdenovirusAdenovirusAdeno Ass. VirusAdeno Ass. VirusHerpes virusHerpes virusHepatitis virusHepatitis virus
2. 2. NON- VIRAL VECTORNON- VIRAL VECTOR
JENIS VECTOR JENIS VECTOR (lanjt.)(lanjt.)
RETROVIRUS :RETROVIRUS :Mampu menginfeksi Mampu menginfeksi
bermacam – macam sel bermacam – macam sel targettarget
Tidak merusak sel yang Tidak merusak sel yang diinfeksidiinfeksi
SYARAT SEL INANG YANG BAIKSYARAT SEL INANG YANG BAIK
1.1. Cepat tumbuhCepat tumbuh2.2. Mampu tumbuh pada medium kultur Mampu tumbuh pada medium kultur
yang murahyang murah3.3. Tidak pathogenikTidak pathogenik4.4. Stabil dalam kulturStabil dalam kultur
Sel inang yang banyak digunakan Sel inang yang banyak digunakan untuk mempelajari cloning :untuk mempelajari cloning :
E.coli, Bacillus subtilis, E.coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevicaeSaccharomyces cerevicae
KEBERHASILAN REKAYASA KEBERHASILAN REKAYASA GENETIKAGENETIKA
Keberhasilan Rekayasa Genetika Keberhasilan Rekayasa Genetika tergantung pada :tergantung pada : Kemurnian DNAKemurnian DNA Bersih dari Bersih dari “DNA-ase”“DNA-ase” Kemampuan penguasaan teknik Kemampuan penguasaan teknik
rekombinanrekombinan
Kriteria keberhasilan :Kriteria keberhasilan :
Bila gen asing yang di “clone” dapat Bila gen asing yang di “clone” dapat berekspresi dengan baik dan stabilberekspresi dengan baik dan stabil
Terima Terima KasihKasihTerima Terima KasihKasih