MAKALAH REKAYASA GENETIKAPenyisipan Gen Apoptin Disertai GFP pada Tanaman Tembakau oleh Bakteri Agrobacterium Tumofaciens

Kelompok 2Faustina Prima1306404802Famila Anindia1306404790Giovanni A. P1306412155Muh. A. H. Vinci1306403390Nadia Tuada A 1306413422Sonia Limoes1306412142

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI BIOPROSESDEPARTEMEN TEKNIK KIMIAFAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIADEPOK, 2015

KATA PENGANTAR

Puji serta syukur penulis panjatkan atas kehadiran Tuhan Yang Maha Esa, karena berkat limpahan nikmat akal dan rahmat-Nya penulis ini dapat menyelesaikan makalah tepat waktu. Segala halangan dan rintangan yang penulis hadapi selama pembuatan makalah ini menjadi pemacu bagi penulis untuk tetap terus belajar dan memperbaiki diri.Makalah ini berisi cara transformasi gen apoptin ke tanaman tembakau yang dirangkai penulis berdasarkan hasil review jurnal penelitian. Apoptin yang merupakan gene of interest ditransformasi ke tanaman menggunakan Ti plasmid yang dikandung oleh Agrobacterium Tumefaciens. Hasilnya, tanaman tembakau yang terinfeksi akan mengalami tumor. Di tempat tumor itulah DNA tanaman tembakau termutasi dengan gene apoptin.Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Muhamad Sahlan M.Eng selaku dosen dan Chandra Dwi selaku asisten dosen pengampu mata kuliah Rekayasa Genetika. Tanpa bantuan serta bimbingan mereka penulis tidak akan mampu menyelesaikan makalah dengan baik. Selain itu, penulis juga berterima kasih kepada semua pihak yang memberikan kontribusi baik secara langsung maupun tidak langsung.Penulis menyadari bahwa makalah Penyisipan Gen Apoptin Disertai GFP pada Tanaman Tembakau oleh Bakteri Agrobacterium Tumofaciens masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik serta saran membangun dari pembaca.

Depok, 30 November 2015Tim Penulis

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR2DAFTAR ISI3BAB I : PENDAHULUAN41.1.LATAR BELAKANG41.2.RUMUSAN MASALAH41.3.TUJUAN4BAB II : PEMBAHASAN52Persiapan transformasi gen ke tumbuhaN52.1Chicken Anemia Virus52.2Apoptin62.2.1Mengisolasi Apoptin dari DNA CAV72.3GFP (Green Fluorescent Protein)82.3.1Mengisolasi GFP92.4Agrobacterium tumefaciens92.4.1Plasmid Ti112.4.2Region Gen Virulensi122.4.3Region Transfer-DNA (T-DNA)132.4.4Mekanisme Infeksi Genetik Agrobacterium ke Tanaman133.Transformasi163.1.Teknik Transformasi Agrobacterium ke Tanaman melalui Vektor Biner163.2.Modifikasi Gen Apoptin dengan Penambahan Green Fluorescent Protein (GFP)184Transformasi Plasmid Rekombinan ke dalam Agrobacterium214.1Transformasi Plasmid E. Coli Ke Dalam Agrobacterium224.2Tahapan Transformasi Plasmid E. Coli Ke Dalam Agrobacterium235Infeksi Genetik Ke Tembakau Dengan Menggunakan Agrobacterium235.1Persiapan Agrobacterium dan Tembakau245.2Inokulasi dan Kokultivasi245.3Seleksi dan Regenerasi25BAB III : KESIMPULAN26DAFTAR PUSTAKA27BAB IPENDAHULUAN

1.1. LATAR BELAKANGApoptin merupakan protein yang mampu memrogam kematian sel (apoptosis). Apoptin ditemukan pada Chicken Anemia Virus (CAV) yang menyerang anak ayam. Virus ini menyebabkan anemia pada anak-anak ayam karena sel darah merahnya mengalami apoptosis. Sifat tersebut dapat dimanfaatkan sebagai terapi gen sel-sel yang mengalami kanker.Secara alamiah, Apoptin berada pada sitoplasma setiap sel. Jika sel tersebut telah tua dan telah tiba saatnya untuk mati, apoptin tersebut akan pindah ke dalam nukleus dan merilis program kematiannya. Akan tetapi, pada sel kanker gen apoptin terjebak dalam nukleus tanpa bisa berekspresi dan memrogam kematiannnya. Itulah sebabnya sel kanker terus berkembang secara tidak normal.Pembuatan produksi apoptin protein sebagai yang mampu untuk menekan kanker sudah terbukti. Yi Tang, profesor kimia dan teknik bio-molekul dari University of California Los Angeles (UCLA) berhasil mengembangkan kapsul kecil dari polimer larit air yang aman mampu mengantarkan protein kompleks ke inti sel kanker untuk memicu kematian. Zat penghancur kanker, apoptin, adalah sebuah protein kompleks yang berasal dari virus anemia pada burung, Chicken Anemia Virus (CAV). Kumpulan protein ini akan terakumulasi dalam inti sel kanker dan memberikan sinyal ke sel kanker untuk melakukan program penghancuran diri. Dalam melakukan misinya tidak mengkhawatirkan karena tidak akan membahayakan sel non kanker. Menurut Yi, proses ini tidak akan menyebabkan risiko mutasi genetik yang ditimbulkan oleh terapi gen untuk kanker atau risiko yang membahayakan sel-sel sehat akibat kemoterapi yang diketahui tidak efektif dalam membedakan antara sel sehat dan sel kanker.1.2. RUMUSAN MASALAH1. Apakah fungsi apoptin dan GFP?2. Bagaimana cara mendapatkan gen apoptin dan GFP?3. Bagaimanakah prinsip transformasi gen pada tanaman (terutama tanaman tembakau)?4. Vektor dan host apakah yang digunakan dalam proses transformasi tersebut?5. Bagaimana cara menyisipkan gen apoptin+GFP ke dalam vektor, host, hingga ke tanaman tembakau?1.3. TUJUAN1. Mengetahui fungsi apoptin dan GFP2. Mempelajari cara isolasi apoptin dari ayam yang terinfeksi CAV3. Mempelajari cara isolasi GFP dari hewan Aequorea victoria 4. Mengetahui prinsip transformasi gen ke tumbuhan5. Memilih vektor dan host yang tepat untuk proses menyisipkan gen ke tumbuhan

BAB IIPEMBAHASAN

2 Persiapan transformasi gen ke tumbuhaN

2.1 Chicken Anemia VirusChicken Anemia Virus (CAV) merupakan virus yang hanya menyerang ayam dari semua unggas. CAV pertama kali dijabarkan oleh Yuasa et al. pada tahun 1979. Virus ini ditemukan pada ayam yang diternakkan secara massal. CAV merupakan virus tanpa selubung, berbentuk icosahedral dengan besar sekitar 25 nm. Virus ini termasuk dalam genus Gyrovirus dan memiliki DNA untai tunggal sirkular sepanjang 2298-2319 pasang basa. Genome CAV mengandung 3 kode protein viral yakni VP1 (protein yang terekspresikan menjadi kapsid), VP2 (Protein untuk pelipatan VP1 dan berpengaruh pada proses replikasi in vivo), dan VP3 (Apoptin, menginduksi kematian sel yang terinfeksi). Virus ini memiliki ketahanan tubuh yang cukup tinggi, ia tahan terhadap panas maupun disinfektan.

(a)(b)

Gambar 1. (a) Struktur ORF Chicken Anemia Virus, (b) Bentuk virus icosahedral(Sumber: Swiss Institute of Bioinormatics)Seperti namanya, CAV menyebabkan anemia pada anak ayam yang baru menetas. Selain itu, CAV juga menyebabkan penghancuran sel eritroblastoid di sumsum tulang belakang dan timus di jaringan timus.CAV dapat menyebar secara horisontal (dari sistem pernapasan maupun kotoran yang tidak segera dibersihkan) maupun vertikal (telur ditularkan oleh ayam betina terinfeksi). Anak-anak ayam yang terinfeksi akan menyebarkan virus tersebut ke sesama anak ayam yang memiliki antibodi lemah turunan induk mereka. Memberikan vaksin kepada para betina sebelum mereka bertelur merupakan salah satu cara pencegahan penularan virus.

2.2 ApoptinApoptin mengandung sinyal Bipartite-type Nuclear Localization Sequence (atau NLS1 dan NLS2) pada rentang asam amino 82-88 untuk NLS1 dan pada rentang asam amino 111-121 untuk NLS2 atau pada ujung c-terminalnya, serta Nuclear Export Signal (NES) yang mempunyai rentang asam amino 97-105 yang menunjukkan adanya potensi perpindahan dari nukleus ke sitoplasma dan sebaliknya. NLS1, NLS2, dan NES merupakan sequence yang memungkinkan Apoptin untuk keluar dan masuk ke dalam nucleusGambar 2. Posisi sinyal NES dan NLS pada untai Apoptin

Pembentukan multimer kompleks dapat terjadi melalui interaksi antara wilayah hidrofobik yang kaya akan prolin pada ujung N-terminal (asam amino 1-69) dari setiap monomer. Ujung C terminal dari setiap monomer, mengandung NLS dengan situs fosforilasi (Thr-108) yang memperbolehkan terjadinya interaksi dengan protein lain dan untuk modifikasi oleh kinase. Pada suatu injeksi mikro dari multimer apoptin ke dalam sitoplasma sel tumor, terbukti bahwa kompleks apoptin dapat berpindah ke nukleus dan menyebabkan kematian sel (apoptosis). Bagaimanapun, apoptin hanya dapat menginduksi sel tidak normal (kanker) dan tidak menyerang sel normal.

Gambar 3. Mekanisme perpindahan Apoptin dari sitoplasma menuju nukleus(Sumber: NCBI)

2.2.1 Mengisolasi Apoptin dari DNA CAVPada dasarnya, langkah mengisolasi (memurnikan) DNA dari sel adalah dengan merusak struktur sel sehingga didapatkan lisat, memisahkan DNA terlarut dari hancuran sel dan material sel lain yang tidak terlarut, dan memurnikan DNA yang diinginkan dari protein dan asam amino lain yang terlarut. Pada awal perkembangannya, isolasi gen dapat dilakukan dengan ekstraksi organik menggunakan kloroform dan presipitasi menggunakan etanol.

1 ATGAACGCTC TCCAAGAAGA TACTCCACCC GGACCATCAA CGGCGTTCAG GCCACCAACA 61 AGTTCACGGC CGTTGGAAAC CCCTCACTGC AGAGAGATCC GGATTGGTAT CGCTGGAATT 121 ACAATCACTC TATCGCTGTG TGGCTGCGCG AATGCTCGCG CTCACACGCT AAGATCTGCA 181 ACTGCGGACA ATTCAGAAAG CACTGGTTTC AAGAATGTGC CGGACTTGAG GACCGATCAA 241 CCCAAGCCTC CCTCGAAGAA GCGATCCTGC GACCCCTCCG AGTACAGGGT AAGCGAGCTA 301 AAAGAAAGCT TGATTACCAC TACTCCCAGC CGACCCCGAA CCGCAAGAAG GTGTATAAGA 361 CTGTAAG

Gambar 4. Genome sequence Apoptin(Sumber: NCBI)Tahapan isolasi gen dari apoptin adalah melakukan pemisahan dari DNA CAV dari komponen virus lain. Langkah pertama adalah mengambil sebagian sampel dari anak ayam yang terinfeksi virus CAV. Umumnya virus CAV menyerang kelenjar timus, hati, dan sumsum tulang belakang sehingga sampel dapat ditemukan di tempat-tempat tersebut. Ambil sampel sumsum tulang belakang ayam menggunakan suntikan.Selanjutnya, sampel disuspensi dengan larutan buffer pada suhu 37oC selama satu malam atau 56oC selama 2 jam. Kandungan larutan buffer yang digunakan teridiri dari (200mm NaCl, 100mm Tris pH 7,5, 20mm EDTA, pH 8, 1% SDS). Setelah proses inkubasi, suspen dipanaskan pada suhu 65oC selama 20 menit untuk mendenaturasi jaringan lain dan menyisakan DNA virus. Langkah selanjutnya menambahkan fenolkloroform jenuh dengan volume yang sebanding dengan volume sampel dan kocok menggunakan vortex selama 3 menit. Penambahan fenolkloroform berfungsi memisahkan fasa-fasa virus. Fasa organik akan terikat pada fenolkloroform yang mempunyai sifat sesama non polar. Larutan fenolkloroform akan mengikat protein-protein berat seperti kapsid. Kemudian komponen DNA akan terikat pada fasa cair yang lebih ringan.Agar perbedaan antar fasa lebih jelas berbeda, campuran tersebut kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 14000 rpm. Selanjutnya menambahkan Natrium Asetat 3M. Tambahkan lagi etanol sebanyak 2x volume sampel dan kocok dengan vortex selama 3 menit. Dinginkan sampel pada suhu -20oC selama 30 menit. Kemudian sentrifugasi kembali pada 14000 rpm selama 5 menit hingga terbentuk pelet. Memisahkan pelet dari supernatan menggunakan pipet secara perlahan. Pelet dibiarkan mengering. Hasil pelet yang kering kemudian disuspensi dengan aquades. Larutan DNA siap digunakan untuk eksperimen.Seiring dengan perkembangan teknologi, metode-metode untuk memurnikan DNA semakin beragam, mudah, dan efisien. Contohnya Promega yang menawarkan pemurnian DNA dengan cara cepat dan aman. Promega menggunakan garam Chaotropic untuk mengancurkan struktur sel, mendenaturasi sel menggunakan deterjen atau alkali, dan lisat dipisahkan dengan sentrifugasi, filtrasi, ataupun magnet. Penggunaan fenolkloroform mulai ditinggalkan berkaitan dengan faktor keamanan dan biaya proses ekstraksi organik.Langkah selanjutnya ialah memotong DNA hanya pada bagian yang diinginkan. Pemotongan atau restriksi bisa menggunakan PCR ataupun dengan menggunakan enzim restriksi yang sesuai pada tempat yang ingin dipotong. Namun penggunaan PCR lebih efisien ketimbang enzim restriksi karena PCR dapat sekaligus memperbanyak DNA isolat.

2.3 GFP (Green Fluorescent Protein)Green Fluorescent Protein (GFP) merupakan protein yang mampu mengeluarkan cahaya hijau dari serapan energi cahaya di lingkungan sekitar. GFP secara alamiah dimiliki oleh ubur-ubur Aequorea victoria yang hidup di laut dingin Pasifik Utara. Aslinya, ubur-ubur A. victoria memiliki bioluminescent aequorin yang mengeluarkan pendar warna biru. Akan tetapi, keberadaan protein GFP ditambah interaksi ion kalsium mengubah warna pendaran biru menjadi hijau yang lebih sedikit mengonsumsi energi.GFP merupakan protein dengan 238 asam amino yang sangat stabil pada range pH 5,5 - 12 dan suhu mencapai 65oC. GFP memiliki banyak kegunaan dalam penelitian. Sifatnya yang dapat memendarkan cahaya di bawah sinar UV membuat ia sering digunakan untuk mengontrol keberhasilan ekspresi maupun lokasi keberadaan gen/protein tertentu. Berikut adalah beberapa kegunaan GFP pada berbagai bidang:

Secara umum GFP digunakan sebagai biosensor. Penggunaannya semudah menempelkan GFP pada protein ataupun gen yang direkayasa. Ketika mutan berpendar saat disinari UV, maka protein ataupun gen rekombinan berhasil terkspresikan. Lokasi yang berpendar sekaligus menunjukkan keberadaan ekspresi gen atau protein rekombinan.Bagaimana GFP mendeteksi cahaya? Seperti organ penglihatan manusia (mata), protein ini juga memiliki fungsi kompleks yang saling menunjang. Jika pada mata terdapat retina yang berfungsi sebagai penerima cahaya di bola mata. GFP memiliki 3 sekuens unik yakni, Glycine, Serine (atau Threonine), dan Tyrosine yang berfungsi sebagai pendeteksi cahaya (Chromophore).Ketiga sekuens tersebut melesak ke dalam lipatan protein saat protein melipat. Protein tersebut perlu melalui tahapan tertentu untuk akhirnya bisa menjadi chromophore. Tahap pertama sesudah pelipatan protein ialah reaksi antara Glysine dan Serine yang membentuk siklik. Kemudian tahap dehidrasi sehingga terbentuk ikatan rangkap pada siklik tersebut. Selang satu jam, oksigen dari lingkungan menyerang daerah siklik sehingga terjadi oksidasi yang menyempurnakan pembentukan chromophore.

Gambar 5. Mekanisme pelipatan protein Green Fluorescent Protein(Sumber: http://www.biotek.com/)

2.3.1 Mengisolasi GFPGFP merupakan protein yang bersifat sangat hidrofobik, salah satu cara mengisolasi protein hidrofobik ialah dengan Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC). Di mana kromatografi ini memanfaatkan sifat hidrofobik sampel agar menempel pada kolom dalam larutan bergaram tinggi dan meluruhkan protein tertentu dengan mengelusi dengan larutan berkadar garam rendah.Tahap pertama yang harus dilakukan ialah dengan melisiskan bagian ubur-ubur yang diperkirakan mengandung protein GFP secara mekanis kemudian kimiawis. Pelisisan secara mekanis berarti mencacah bagian/organ sampel dari ubur-ubur. Kemudian larutkan cacahan sampel pada deterjen atau enzim nanas untuk merobek dinding sel yang terdiri dari lipid sehingga DNA dapat keluar dari organel maupun nukleus. Sentrifugasi larutan akan menghasilkan supernatan dan pelet. Buang supernatan dan mengencerken pelet dengan larutan berkadar garam tinggi.Setelah larutan berisi protein GFP siap, tahap selanjutnya ialah mempersiapkan kolom HIC. Siapkan kolom berisi hidrofobik beads pada fasa diam. Seperti yang telah dijelaskan, beads ini akan mengikat GFP dan beberapa protein pada larutan berkadar garam tinggi. Protein lain yang tidak diinginkan memiliki tingkat hidrofobik yang lebih rendah dicuci dengan mengalirkan larutan buffer resin sebagai fase bergerak.Terakhir, di dalam kolom hanya tersisa GFP yang memiliki tingkat hidrofobik yang paling tinggi. GFP dalam kolom diluruhkan dengan mengalirkan larutan buffer berkadar garam rendah sebagai fase gerak. GFP yang diperoleh kemudian siap digunakan diadisi dengan apoptin sebagai GOI.2.4 Agrobacterium tumefaciensSpecies Agrobacterium tergolong bakteri gram negatif yang tergolong bakteri aerob dan mampu hidup baik sebagai saprofit maupun parasit. Agrobacterium berbentuk batang, berukuran 0,6 1,0 m sampai 1,5 3,0 m, dalam bentuk tunggal atau berpasangan. Agrobacterium merupakan bakteri yang mudah bergerak (motile) dan memiliki 1-6 flagela peritrichous serta merupakan bakteri tak berspora. Suhu optimal pertumbuhan bakteri ini adalah 25-28C. Kumpulan bakteri ini biasanya berbentuk cembung, bulat, lembut, dan tak berpigmen. Agrobacterium diisolasi dari tanaman yang terinfeksi Crown Gall. Agrobacterium tumefaciens dan spesies Agrobacterium lainnya telah dikenal luas sebagai patogen bagi tanaman sejak awal abad ke-20. Namun, dalam dua dekade terakhir, kemampuan yang dimiliki Agrobacterium untuk mentransfer DNA ke dalam sel tanaman telah banyak dimanfaatkan untuk keperluan rekayasa genetik khususnya pada tanaman.

Gambar 6. Agrobacterium tumefaciens(sumber: http://www.bio.davidson.edu)

Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri yang secara alami dapat menginfeksi tanaman dengan penyakit crown gall tumor (tumor mahkota empedu) pada tanaman-tanaman dikotiledon. Penyakit ini dinamakan demikian karena terdapatnya tumor besar yang membengkak yang terdapat pada tanaman. Penyakit ini adalah salah satu penyakit yang paling umum diketahui karena perubahan yang ditimbulkannya pada sistem biologis tanaman. Secara mendasar, ketika bakteri ini menginfeksi tanaman, sebagian dari materi DNA-nya dipindahkan ke genom tanaman yang akhirnya menyebabkan tumor dan perubahan pada sistem metabolisme tanaman. Hal ini dapat terjadi karena materi genetik yang diberikan kepada tanaman salah satunya mengandung gen pengkode hormon pertumbuhan tanaman yang dalam jumlah berlebih akan menyebabkan pertumbuhan tidak terkendali dan pada akhirnya menyebabkan kanker atau tumor.Bakteri yang tergolong ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah plasmid besar yang disebut plasmid-Ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini pada tanaman. Untuk memulai pembentukan tumor, Agrobacterium tumefaciens harus menempel terlebih dahulu pada permukaan sel inang dengan memanfaatkan polisakarida asam yang akan digunakan untuk mengkoloniasi/menguasai sel tanaman. Selain tanaman dikotiledon, tanaman monokotiledon seperti jagung, gandum, dan tebutelah digunakan untuk memasukkan sel asing ke dalam genom tanaman. Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik.

Gambar 7. Siklus Penyakit Crown Gall(Sumber : https://www.cals.ncsu.edu/)Sifatnya yang unik ini membuat bakteri Agrobacterium tumefaciens digunakan sebagai alat pada proses pengembangbiakan tanaman. Gen yang diinginkan, seperti gen insectisidal toxin genes atau herbicide-resistance dapat dimasukan ke dalam DNA bakteri dan kemudian dimasukan ke dalam genom tanaman. Penggunaan bakteri ini tidak hanya memperpendek waktu pengembangbiakan tanaman, tetapi juga memungkinkan tanaman untuk memiliki sifat baru yang tidak dimiliki tanaman pada umumnya.Transformasi menggunakan Agrobacterium ternyata lebih disenangi dibandingkan dengan metode lain karena memilikin keunggulan antara lain 1). Efisiensi transformasi dengan salinan gen tunggal lebih tinggi, 2). Dapat dilakukan dengan peralatan laboratorium yang sederhana, dan 3) Ekspresi gen transfer yang stabil cukup banyak. Gen dengan salinan tunggal lebih mudah dianalisa dan biasanya bersegregasi mengikuti pola pewarisan Mendel. 2.4.1 Plasmid TiGen penyebab penyakit yang disebabkan oleh Agrobacterium umumnya tidak ditemukan pada kromosomnya, melainkan pada plasmidnya, yang dinamakan tumor-inducing plasmid (plasmid Ti). Agrobacterium tumefaciens memiliki Ti-plasmid yang menyebabkan penyakit tumor mahkota empedu pada tanaman dengan mentransfer bagian dari DNA nya ke dalam genom tanaman ketika penginfeksian. Ti-plasmid Ti-plasmid memiliki panjang sekitar 200kbp dengan 4 region: region T-DNA, region gen virulensi, region gen katabolisme opine, dan origin of replication (ORI).

Gambar 8. Plasmid Ti(sumber: http://www.cambia.org/)

Bagian penting dari plasmid Ti, yaitu: T-DNA border sequences, yamg membatasi segmen DNA (T-DNA) yang akan ditransfer ke genom tumbuhan. T-DNA akan dijelaskan pada bagian selanjutnya. Virulence genes, yang dibutuhkan untuk mentransfer daerah T-DNA ke tanaman tetapi tidak memindahkan seluruh plasmid ke tanaman. T-DNA termodifikasi, dimana gen yang ingin ditransfer diletakan sehingga dapat dipindahkan ke dalam tanaman tetapi tidak menyebabkan tumor pada tanaman.2.4.2 Region Gen VirulensiVirulence genes yang terdapat pada plasmid Ti berperan dalam mediasi dan transfer T-DNA ke dalam sel tanaman inang. Ada sekitar 35 gen vir yang disusun dalam 8 operon gen pada Ti-plasmid: Vir A, Vir B, Vir C, Vir D, Vir E, Vir F, Vir G, dan Vir H, yang keseluruhannya memiliki panjang 40kbp dan masing-masing operon mengkodekan enzim-enzim yang berperan dalam fungsi-fungsi tertentu untuk mentransfer T-DNA ke dalam sel tanaman inang. Dengan masing-masing fungsinya adalah sebagai berikut: virA mengkodekan protein reseptor acetosyringone, juga mengaktivasi VirG dengan fosforilasi yang menyebabkan ekspresi konstitutif pada keseluruhan gen operon virB mengkodekan protein membran, berperan dalam pembentukan lorong konjugasi di mana T-DNA ditransportasikan. virC mengkodekan enzim helikase yang merelaksasi untaian T-DNA dan mengikat overdrive sequence. virD mberperan dalam aktivitas topoisomerase, dan virD2 yang memproduksi endonuclease yang mentarget sekuens batas dari daerah T-DNA. virE yang mengikat untai T dan melindunginya dari serangan nuklease dan menginterkalasinya dengan lemak dan menciptakan ruang bagi kompleks T untuk menuju sel tanaman. virF belum diketahui aktivitasnya. virG berperan sebagai rotein DNA-binding master controller; VirA mengaktivasi VirG dengan fosforilasi, VirG mendimer dan menaktivasi ekspresi konstitutif semua operon vir. virH belum diketahui aktivitasnya.

2.4.3 Region Transfer-DNA (T-DNA) T-DNA atau transferred DNA adalah bagian DNA dari plasmid Ti yang dipindahkan ke genom tumbuhan, berukuran 24kb, yang diintegrasikan ke dalam genom tanaman di dalam nukleus. Bagian ini dibatasi oleh 25 pasang basa nitrogen yang sama pada kedua ujungnya, yaitu Left-Border (LB) dan Right-Border (RB) yang bersekuens sama. Proses transfer dimulai pada batas kanan dan diakhiri pada batas kiri. Penghapusan RB menggagalkan transfer T-DNA, namun penghapusan LB tidak berpengaruh terhadap transfer T-DNA secara signifikan. Daerah T-DNA pada plasmid Ti mengandung gen yang mengkode enzim pensintesi opines dan fitohormon atau hormon pertumbuhan tanaman. Dengan memindahkan materi genetik tersebut ke tanaman, bakteri secara langsung menyebabkan tumor pada tanaman akibat banyaknya jumlah hormon pertumbuhan sehingga tidak terkontrol. Maka dari itu, ketika Agrobacterium digunakan untuk mentransfer gen tertentu kepada tanaman, daerah ini akan dihilangkan dan diganti dengan gen yang diinginkan dan penanda yang berguna untuk menentukan tanaman yang sudah terinfeksi dan belum. Contoh dari penanda yang sering digunakan adalah neomycin phosphotransferase dan hygromycin B phosphotransferase.Pada area T-DNA, terdapat 4 segmen utama, yakni: Gen OnkogenikGen onkogenik merupakan gen yang mensintesis auksin dan sitokinin (fitohormon; hormon pertumbuhan) yang menginduksi pembentukan tumor. Ti-plasmid yang tidak memiliki gen onkogenik disebut sebagai disarmed Ti-plasmid, artinya Ti-plasmid yang tidak memiliki gen penyebab tumor. Disarmed Ti-plasmid dikonstruksi oleh insinyur genetik dan digunakan dalam transfer genetik termediasi Agrobacterium.

Gen OpineOpine adalah senyawa ber-Mr rendah yang ditemukan pada tumor tanaman terinfeksi penyakit crown gall. Biosintesis opine dikatalisis oleh enzim spesifik yang dikodekan oleh gen opine pada T-DNA yang merupakan bagian dari Ti-plasmid. Opine tersebut digunakan bakterium sebagai sumber nitrogen dan energi. Sejauh ini, ditemukan A. tumefacies yang mengkatalisis jenis opine yang berbeda, yaitu nopaline (dikodekan oleh gen noc) dan octopine (dikodekan oleh gen occ).Ketika A. tumefaciens dikultur pada temperatur di atas 28oC, Ti-plasmid kadang hilang. Bakteri A. tumefaciens yang kehilangan Ti-plasmid menjadi avirulen dan juga kehilangan kemampuannya untuk mengkatabolisis asam amino turunan spesifik. Namun, ketika Ti-plasmid ditransformasi lagi ke dalam A. tumefaciens avirulen atau dengan konjugasi oleh A. tumefaciens virulen, maka A. tumefaciens menjadi virulen kembali dan dapat mengkatalisis octopine atau nopaline. Jika donor Ti-plasmid adalah strain octopine, resipiennya menjadi strain octopine, tanpa pengaruh apakah resipien merupakan strain octopine atau nopaline; dan sebaliknya. Strain octopine dan nopaline mengklasifikan tipe Ti-plasmid menjadi dua: Ti-plasmid octopine dan Ti-plasmid nopaline, yang hampir homolog. Jenis Ti-plasmid ini menentukan apakah octopine atau nopaline yang akan disintesis di dalam sel tumor dan juga gen yang mengkatalisis sintesisnya.

Left-Border (LB) dan Right-Border (RB)LB dan RB merupakan sekuens sama panjang (24bp) dan berbasa sama yang mengapit kedua ujung region T-DNA. Sekuens tersebut misalnya adalah 5-GGCAGGATATTCAATTGTAAAT-3. Dua border tersebut memiliki peran penting dalam transfer T-DNA ke dalam genom tanaman. LB dan RB adalah target aktivitas endonuklease oleh produk salah satu gen virulen VirD.2.4.4 Mekanisme Infeksi Genetik Agrobacterium ke TanamanProses transfer genetik dari Agrobacterium pada sel tanaman melalui beberapa tahap (gambar 9) yaitu :

Gambar 9. Mekanisme Transfer Genetik dari Agrobacterium ke Tumbuhan (Sumber: http://staff.uny.ac.id/ )

Kolonisasi bakteri Merupakan tahapan awal yang penting untuk menginduksi terbentuknya tumor. Tahap ini berperan pada saat Agrobacterium menempel pada permukaan sel tanaman. Polisakarida yang terdapat pada permukaan sel Agrobacterium berperan penting dalam proses kolonisasi. Induksi sistem virulen bakteri (Nomor 1 hingga 5)Transfer T-DNA ditunjukkan dengan produk yang dikode oleh 30-40 kb daerah Vir pada Ti plasmid. Daerah ini sedikitnya terdiri dari enam operon esensial ( Vir A, Vir B, Vir C, Vir D, Vir E dan Vir G) dan operon non esensial (Vir F dan Vir H). Jumlah gen masing-masing operon berbeda, Vir A, Vir G dan Vir F hanya terdiri dari satu gen; Vir C, Vir E dan Vir H terdiri dari dua gen; sedangkan Vir D dan Vir B mempunyai masing-masing empat dan tujuh gen. Vir A-Vir G merupakan dua komponen sistem yang mengaktifkan transkripsi pada gen Vir yang lain. Vir A yang teraktivasi mempunyai kapasitas untuk mentrnsfer fosfat menjadi residu aspartat yang sesuai dengan DNA sitoplasmik binding protein Vir G. Fungsi Vir G adalah sebagai faktor transkripsi yang mengatur regulasi ekspresi gen Vir pada saat terfosforilasi oleh Vir A. Daerah C-terminal bertanggung jawab dalam mengikat DNA, sedangkan N-terminal merupakan domain fosforilasi yang menunjukkan homologi dengan domain sensor Vir A. Aktivasi sistem Vir juga tergantung pada faktor eksternal seperti temperatur dan pH. Pada tempertur lebih dari 32oC, gen Vir tidak akan terekspresi karena mengubah konformasi folding Vir A yang menginduksi terjadinya inaktivasi. Pengaruh temperatur pada Vir A ditekan dalam bentuk mutan Vir G (Vir Go), yang mengaktifkan ekspresi gen Vir. Pembentukan generasi komplek T-DNA (Nomor 6 hingga 8)Aktivasi gen Vir menghasilkan generasi molekul single strand (ss) yang menghadirkan copy strand T-DNA. DNA yang terletak diantara batas T-DNA akan ditrnasfer ke dalam sel tanaman sebagai ssDNA, dan kemudian berintegrasi ke dalam genom tanaman. Protein Vir D1 dan Vir D2 merupakan protein yang berperan penting pada tahap ini, dengan mengenali sekuen batas T-DNA dan nicking ( aktivitas endonuklease) pada strand bawah di setiap batas. Pada daerah nick diasumsikan sebagai tempat inisiasi dan terminasi untuk pemulihan strand T. Setelah terjadi pemotongan endonukleotida, Vir D2 secara kovalen akan menempel pada ujung 5' pada ss strand T. Asosiasi ini mencegah eksonukleolitik pada ujung 5' pada ss strand T dan membedakan ujung 5 sebagai pemeran penting dalam komplek transfer T-DNA. Transfer T-DNA meliputi dua model untuk translokasi kompleks T-DNA (Nomor 9)Sarana transfer ke dalam nukleus tanaman adalah komplek protein ssT-DNA. Ini harus ditranslokasi ke dalam nukleus tanaman melalui tiga membran, dinding sel tanaman dan ruang seluler. Berdasrkan model yang paling banyak diterima adalah kompleks ss T-DNA Vir D2 yang dilingkupi 69 kDa protein Vir E2, ssDNA binding protein. Asosiasi ini mencegah nuklease dan penambahan perpanjangan strand ss T-DNA sehingga mengurangi diameter kompleks sekitar 2 nm. Hal ini mengakibatkan translokasi melalui membran menjadi lebih mudah. Walaupun demikian, asosiasi tersebut tidak dapat menstabilkan kompleks T-DNA dalam Agrobacterium. Vir E2 terdiri dari dua signal tanaman yaitu NLS (nuclear location signal) dan Vir D2 terdiri dari satu NLS. Fakta ini menunjukkan bahwa kedua protein rupanya berperan penting dalam sel tanaman sebagai perantara transfer kompleks T-DNA ke dalam nukleus. Vir 5 E1 diperlukan untuk ekspor Vir E2 ke dalam sel tanaman, walaupun fungsi spesifik yang lain belum diketahui. Model alternatif lain yaitu bahwa kompleks transfer berupa ssDNA secara kovalen terikat pada ujung 5' dengan Vir D2, tetapi tanpa dilingkupi oleh protein Vir E2. Ekspor independen Vir E2 ke dalam sel tanaman merupakan proses alami, dan sekali kompleks ssT-DNA VirD2 tersebut masuk dalam sel tanaman, akan dilingkupi oleh protein Vir E2. Hal ini juga memungkinkan proses tersebut dapat terjadi sebagai alternatif pada saat kondisi terinfeksi. Integrasi T-DNA dalam genom tanaman (Nomor 10 hingga 12)Pada sel tanaman, kompleks ssT-DNA merupakan target nukleus untuk melewati membran nukleus. Dua protein Vir telah diketahui penting dalam tahap ini, yatitu Vir D2 dan Vir E2 adalah yang paling penting, dan kemungkinan Vir F memberikan sidikit peran pada proses ini. Signal NLS dari Vir D2 dan Vir E2 berperan penting sebagai target nukleus dalam mengantarkan kompleks ssT-DNA sebagai gambaran awal. Vir D2 mempunyai satu NLS fungsional. Kompleks ss T-DNA merupakan kompleks nukleoprotein berukuran besar sekitar diatas 20 kb yang hanya terdiri dari satu ujung 5' secara kovalen menempel pada protein Vir D2 per kompleks. Setiap kompleks dilingkupi molekul Vir E2 dengan ukuran besar yaitu sekitar 600 per 20 kb T-DNA, dan masing-masing terdiri dari 2 NLS. Dua NLS dari Vir E2 ini telah dipertimbangkan sebagai sesuatu yang penting untuk kelanjutan impor nukleus kompleks ss-TDNA, kemungkinan dengan menjaga kedua sisi pori nukleus yang terbuka secara simultan. Impor nukleus ini kemungkinan diperantarai oleh NLS spesifik binding protein, yang terdapat dalam sitoplasma tanaman.Tahapan akhir dari transfer T-DNA adalah integrasi T-DNA ke dalam genome tanaman. Berdasarkan model di atas, pasangan sedikit basa yang dikenal sebagai mikro-homologi diperlukan untuk tahap pre-annealing antara pasangan strand T-DNA dengan Vir D2 dan DNA tanaman. Homologi ini sangat kecil dan mempunyai sedikit spesifitas dalam proses rekombinasi dengan memposisiskan Vir D2 untuk ligasi. Pada ujung 3' atau sekuen yang berdekatan pada T-DNA terdapat beberapa homologi sedikit dengan DNA tanaman yang menghasilkan kontak awal (sinapsis) antara stran T dan DNA tanaman dan membentuk gap pada strand 3'-5' DNA tanaman. Pemindahan DNA tanaman akan memotong pada ujung 3' pada gap oleh endonuklease, dan nukleotida pertama pada 5' menempel pada pasangan Vir D2 dengan nukleotida pada ujung (5'-3') strand DNA tanaman. Pada 3' overhang, T-DNA bersama dengan pemindahan DNA tanaman merupakan peristiwa digesti baik oleh endonuklease atau 3'-5' eksonuklease. Kemudian, 5' menempel pada akhiran Vir D2 dan ujung 3' lain pada stand T (berpasangan dengan DNA tanaman selama sejak tahap awal pada proses integrasi) tepat di bawah strand DNA tanaman. Inilah pengenalan strand T pada strand 3'-5' DNA tanaman terjadi sempurna, pilinan yang diikuti dengan nick pada lawan strand DNA tanaman dihasilkan. Situasi ini mengaktifkan mekanisme repair pada sel tanaman dan strand komplementer yang disintesis melalui sisipan awal strand T-DNA sebagai cetakan (Gustafo, dkk., 1998).3. Transformasi3.1. Teknik Transformasi Agrobacterium ke Tanaman melalui Vektor BinerKemampuan A. tumefaciens ber-Ti-plasmid yang mengandung T-DNA yang dapat ditransferkan ke dalam genom tanaman membuat A. tumefaciens digunakan sebagai agen penyisip gen rekayasa dalam rekayasa genetik tanaman. T-DNA dalam Ti-plasmid direkayasa oleh insinyur genetik dengan mengubah region T-DNA: gen onkogenik dan gen opine, dengan gen klona yang diinginkan beserta penanda seleksinya.

Gambar 11. Peta Plasmid Disarmed Ti-Plasmid yang sudah disisipi Gen Klona (Sumber: http://nptel.ac.in/courses/102103013/module5/problems/5.html)Gambar 10. Peta Plasmid Ti-Plasmid (Sumber: http://nptel.ac.in/courses/102103013/module5/problems/5.html)

Pada rekayasa genetika tanaman dengan metode Agrobacterium, terdapat dua metode yang menggunakan vektor tertentu yaitu co-integrative vector system dan binary vector system untuk dapat menyisipkan gene of interest ke dalam Agrobacterium.

1. Metode Co-integrative Vector SystemPada sistem ini, digunakan vektor intermediet yang mengandung marker untuk seleksi, gen target, border kanan, origin of replication E. coli, dan gen marker untuk bakteri. Gen yang ingin disisipkan dimasukkan ke dalam vektor ini yang kemudian di induksi ke sel Agrobacterium yang mengandung Ti-plasmid. Vektor co-integrated berekombinasi dengan Ti plasmid tidak berbahaya (disarmed) yang sudah tidak memiliki gen pemroduksi tumor dan border kanan dari T-DNA di dalam A. tumefacies, dan akhirnya keseluruhan bektor ini akan berintegrasi ke dalam disarmed Ti-plasmid untuk membentuk Ti-plasmid rekombinan. Ti plasmid rekombinan ini kemudian ditransfer ke sel tanaman yang dituju. Vektor intermediet tidak dapat direplikasi oleh Agrobacterium, tetapi dapat melakukan rekombinasi ke dalam daerah T-DNA dari Ti-plasmid yang dituju. Agar sel tanaman yang ingin disisipkan tidak tumbuh dengan abnormal, maka perlu dilakukan inaktivasi satu atau lebih gen untuk biosintesis regulator pertumbuhan. Metode ini kompleks karena perlu adanya proses rekombinasi antara vektor integratif dan Ti-plasmid secara in vivo.

1. Metode Binary VectorPada sistem ini, digunakan plasmid kecil, vektor biner, yang dapat dimanipulasi secara in vitro. Plasmid ini mengandung border repeats yang akan disisipkan dengan gen yang kita inginkan di antara kedua border tersebut yang kemudian di transformasi ke dalam E coli. Dalam kasus dimana tidak terdapat gen vir dalam vector biner, biasanya digunakan sebuah vector penolong lain (helper vector) berupa disarmed Ti plasmid yang memiliki gen vir keseluruhan, namun tidak memiliki daerah T-DNA. Disarmed Ti-plasmid (mengandung gen vir) terdapat dalam plasmid yang berbeda dengan vektor biner yang memiliki T-DNA, namun tetap berada di dalam satu host Agrobacterium yang sama. Sehingga dalam system ini digunakan 2 macam vector (binary), yaitu vector dengan T-DNA, dan sebuah disarmed Ti-plasmid yang memiliki gen vir.

Gambar 12. Binary Vector System(Sumber: Howe, 2007)

Dalam perancangan ini, sisgtem vector biner lebih dipilih karena mempunyai kelebihan dibandingkan co-integrated vector, antara lain: Tidak ada proses rekombinasi yang berlangsung di antara molekul-molekul yang terlibat Vektor biner berukuran cukup kecil dibandingkan dengan disarmed Ti-plasmid rekombinan, sehingga meningkatkan efisiensi transfer dari E. coli ke Agrobacterium. Ukuran vektor biner kecil karena vir region-nya dipisah ke plasmid yang berbeda (disebut helper plasmid)

Vektor biner yang digunakan dalam mentransfer gen apoptin ke tanaman tembakau adalahh pGreenII0229 dengan vector helpernya, pSoup. Vektor pGreenII 0229 adalah vektor shuttle, sehingga dapat diperbanyak baik di dalam E. coli maupun Agrobacterium karena memiliki dua ORI (origin of replication), yakni ColEI-ORI memungkinkan replikasi di E. coli dan pSA-ORI memungkinkan replikasi dalam strain Agrobacterium yang sesuai.

Gambar 13.Peta Plasmid pGreenII-0229 dan pSoup(Sumber: http://www.snapgene.com/)

pGreen adalah vektor biner di mana tiga komponen utamanya (T-DNA & MCS, marker untuk seleksi, dan ori) telah dioptimalkan untuk meningkatkan transformasi Agrobacterium ke tanaman. Adapun alasan penggunaan plasmid pGreenII0229 adalah: Ukurannya yang relative kecil (453bp). Ukuran yang kecil ini menguntungkan, karena meningkatkan efisiensi transformasi ke dalam E. coli. pGreenII adalah vector biner yang sudah dimodifikasi dari pGreenI, sehingga meningkatkan stabilitasnya dalam E. coli Memiliki marker seleksi, yaitu gen resistan antibiotik kanamycin (NptI)Gen apoptin nantinya akan diligasi ke dalam pGreenII0229, namun terlebih dahulu dilakukan modifikasi dari apoptin dan pGreenII0229, yaitu penambahan sekuens GFP. 3.2. Modifikasi Gen Apoptin dengan Penambahan Green Fluorescent Protein (GFP)Untuk mengetahui keberhasilan ekspresi gen apoptin pada host (misalnya E. coli), dapat dibantu dengan penambahan sebuah penanda (marker) yang ditambahkan pada ujung N atau ujung C apoptin. Marker yang digunakan dalam perancangan ini adalah green fluorescent protein (GFP).Green Fluorescent Protein adalah protein yang dapat berpendar yang secara alami dihasilkan oleh ubur-ubur. GFP kini digunakan secara luas dalam studi-studi ekspresi gen maupun mikroskopik karena aplikasinya yang relatif mudah. Hanya dengan adanya pendaran cahaya dapat menunjukkan bahwa gen yang kita teliti terekspresi. Pada GFP terdapat 234 residu asam amino.GFP menjadi istimewa karena ia bersifat auto-katalitik, tidak membutuhkan kofaktor atau enzim lain agar ia bekerja. Selain itu GFP dapat digabung (fusi) dengan protein lain tanpa saling mengganggu fungsi masing-masing. Sehingga GFP dapat digunakan secara luas di berbagai organisme.Penambahan GFP pada apoptin dapat dilakukan pada vector biner pGreenII0229 dengan prinsip restriksi-ligasi.1. Pemilihan Plasmid dan Host.Plasmid yang digunakan pada perancangan rekayasa genetika tanaman adalah plasmid biner pGreenII0229 dengan vector helpernya yaitu pSoup. pGreenII0229 adalah plasmid biner yang memiliki origin of replication dari E. coli dan Agrobacterium tumefaciens sehingga dapat bereplikasi di kedua bakteri tersebut. Adapun host yang digunakan untuk berlangsungnya proses cloning plasmid ini adalah dari jenis bakteria Escherichia Coli, yaitu E. Coli strain DH5a. Pemilihan strain ini berdasarkan pada sifat jenis strain ini yang cocok digunakan untuk proses cloning bakteria, karena efisiensi replikasinya yang tinggi. 1. Penambahan GFP pada pGreenII0229pGreen.co.uk menyediakan gen GFP yang dimodifikasi dengan penambahan RE site BamHI dan SacI. Namun GFP ini belum memiliki promoter dan terminator pada tanaman sehingga tidak bisa diekspresikan dalam tanaman.

Gambar 14. Peta DNA GFP modifikasi(sumber: http://www.pgreen.co.uk/)

Penambahan promoter dan terminator pada GFP dilakukan dengan merestriksi sekuens promotor 35S-CaMV cassette, yaitu pada situs BamHI dan SacI. Kemudian dilakukan ligase.

Gambar 15. Peta DNA 35S-CaMV Cassette(sumber: http://www.pgreen.co.uk/)

Hasil dari tahap ini adalah GFP yang sudah memiliki promoter 35S-CaMV dan terminator CaMV polyA.

Gambar 16. Insersi GFP pada 35S CaMV cassette(sumber: http://www.pgreen.co.uk/)

GFP diinsert ke dalam pGreenII0229 dengan teknik restriksi-ligasi, pGreenII 0229 direstriksi dengan enzim restriksi EcoRV dan diligasi dengan T4 DNA Ligase.Hasil ligase adalah:Right Border (RB)BgIII (3347)

Gambar 17. Diagram Susunan Hasil Insersi GFP pada T-DNA pGreenII0229(sumber: Ilustrasi penulis)

1. Penambahan RE site pada Apoptin dengan Teknik PCRSekuens gen apoptin dapat dimasukkan kedalam area 5 MCS atau 3 MCS pada pGreenII0229. Dalam kasus ini, gen apoptin akan disisipkan pada area enzim restriksi XbaI dan BamHI, pada ujung 3 GFP. Sebelum memasukkan apoptin pGFP, apoptin harus diberi tambahan situs RE XbaI dan BamHI dengan PCR. Adapun primer-primer yang digunakan: Primer Forward5 basa tambahan XbaI site Gen Apoptin 35 CGA TCTAGA ATGAACGCTC TCC 3 Panjang 22 pasang basa, GC content 50%, Tm 54,8oC Primer Reverse5 basa tambahan BamHI site Gen Apoptin reverse complement 3 5 GCC GGATCC TTACAGTCTTATACA 3Panjang 24 basa, GC content 46%, Tm 55,7oC (Tm=0,9oC)Hasil PCR adalah apoptin yang telah memiliki situs RE bagi XbaI pada ujung 5 dan BamHI pada ujung 3, yakni XbaI Apoptin BamHI.

Gambar 18. Diagram Hasil PCR Sekuens Apoptin(sumber: Ilustrasi penulis)

1. Ligasi Apoptin ke dalam pGFPTahap selanjutnya adalah memasukkan Apoptin+RE ini ke dalam pGreenII0229, atau dikenal dengan tahap ligase. Apoptin dan pGreenII0229 terlabih dahulu diberi enzim restriksi XbaI dan BamHI untuk membentuk sticky end pada kedua ujungnya, sehingga dapat terjadi penyambungan pada gen apoptin dan gen pada pGreenII0229, atau dikenal dengan istilah ligase. Ligasi dilakukan menggunakan enzim T4 DNA Ligase. Hasil ligase ini adalah plasmid pGreenII0229 yang sudah berhasil dimasuki dengan Apoptin dan GFP

1. Transformasi pGreenII-0229 Rekombinan ke dalam E. Coli DH5Hasil ligase apoptin ke dalam pGFP kemudian ditransformasikan ke dalam host, yaitu E. Coli strain DH5. Proses transformasi dilakukan dengan teknik elektroforasi, yang memanfaatkan kejutan listrik untuk merusak membran sel bakteri sementara dan membentuk pori-pori pada membran sel. DNA plasmid yang sudah di elektroporasi kemudian ditambahkan LB cair untuk pemulihan sel dan diinkubasi selama 3 jam pada incubator shaker. Hasil inkubasi kemudian diratakan pada permukaan medium LB padat dengan penambahan antibiotin untuk seleksi. Medium tersebut kemudian diinkubasi dengan suhu 30C selama 48 jam. Selanjutnya, E. Coli yang sudah memiliki plasmid rekombinan pGreenII0229 ditumbuhkan dalam plat agar, untuk selanjutnya dilakukan proses seleksi.

1. SeleksiProses seleksi adalah tahapan dimana kita hendak mengetahui apakah gen of interest yang kita sisipkan dalam plasmid benar-benar sudah ditransformasikan ke dalam host. Caranya dapat menggunakan seleksi dengan antibiotik atau dengan seleksi blue-white screening. Seleksi pada kasus ini dilakukan dengan uji antibiotik dan uji marker gene GFP, karena dalam pGreenII0229 terdapat gen resistan terhadap antibiotik kanamycin, yaitu NptI. Jika kita menumbuhkan E. Coli DH5a yang sudah ditranformasi dengan plasmid rekombinan ke dalam media agar yang mengandung kanamycin, maka koloni yang dapat bertahan hidup adalah koloni yang sudah berhasil dimasuki plasmid rekombinan. Namun sebaliknya, jika E. Coli DH5a tidak dapat bertahan hidup dalam media, maka sudah dapat dipastikan bahwa E. Coli tersebut tidak memiliki plasmid rekombinan. Selain itu, dalam media juga dapat kita lihat secara langsung bahwa E. coli yang berhasil disisipi pGreenII0229 akan memendarkan cahaya hijau jika disinari cahaya UV, karena pGreenII0229 sudah memiliki gen GFP.

Gambar 19. Contoh Hasil Seleksi E. Coli dengan gen GFP(sumber: https://s3.amazonaws.com/files.digication.com/M827155a6aecd283f1be073fe04b608b4.jpg)Adapun tahapan yang dapat dilakukan untuk uji seleksi: Mengkultur bakteri pada LB-plate yang mengandung 100 g/ml of kanamicin, 80 g/ml X-gal segar, dan 20 mM IPTG. Penambahan kanamicin berguna untuk mencegah pertumbuhan E. Coli yang tidak mengandung plasmid pGreenII0229 rekombinan.Setelah didapatkan bakteri E. Coli yang mengandung plasmid pGreenII0229 rekombinan, maka selanjutnya kita dapat mengkultur kembali bakteri ini sehingga didapatkan jumlah yang cukup untuk transformasi ke dalam Agrobacterium tungefasiens.4 Transformasi Plasmid Rekombinan ke dalam AgrobacteriumSetelah plasmid dimofikasi lalu dilakukan proses transformasi ke dalam inang perantara yaitu E. coli, plasmid termodifikasi tersebut akan ditransformasi ke dalam Agrobacterium. Berikut adalah beberapa metode yang dapat digunakan untuk melakukan proses transformasi tersebut: Metode Freeze/ThawKetika DNA plasmid murni tersedia, metode freeze/thaw memberikan alternatif yang cepat dan mudah. Mekanisme secara tepat dari bagaimana keberhasilan metode ini masih belum dapat dimengerti dengan baik. Secara kesimpulan, pemasukkan DNA bergantung pada perusakan dinding sel yang terpapar oleh kation divalent dan perubahan temperatur yang sangat cepat yang menghambat fluidisasi dari membran sel. Metode ElektroporasiElektroporasi bergantung kepada penggunaaan kejutan listrik untuk membuat pori dalam membran lipid dari bakteri. Pori tersebut cukup besar sehingga molekul DNA dapat masuk ke dalam sel. Parameter kesuksesan dari metode ini bergantung pada pengendalian dari kekuatan medan listrik dan durasi kejutannya.

Metode Tri-parental MatingTri-parental Mating merupakan metode yang efektif untuk memindahkan plasmid non-konjugatif tetapi mobilizable ke dalam Agrobacterium. Metode ini menggunakan dua jenis E. coli dengan plasmid berbeda. Yang pertama adalah E. coli yang mengandung plasmid helper yang mengkode protein yang memformasikan dan menjembatani perpindahan vektor biner ke dalam Agrobacterium. Yang kedua adalah E. coli yang mengandung vektor biner tersebut yang berisi DNA asing atau gen yang diinginkan. Hal ini dapat terjadi karena fungsi dari origin oriT yang ada pada plasmid helper dapat membantu vektor biner. Skema kerja metode tri-parental mating adalah sebagai berikut,

Gambar 20. Skema Kerja Tri-parental Mating(sumber: Wise Arlene, et. al. 2006)

Dengan A adalah E. coli dengan plasmid helper sebagai pembantu proses transmisi plasmid. B adalah E. coli dengan plasmid berisi vektor biner beserta gen yang diinginkan. C adalah E. coli dengan kedua plasmid tersebut di dalamnya. D adalah Agrobacterium penerima. E adalah Agrobacterium tumefaciens yang sukses memiliki vektor biner rekombinan.4.1 Transformasi Plasmid E. Coli Ke Dalam AgrobacteriumMetode transformasi yang digunakan dalam kasus ini adalah Tri Parental Mating. Komponen yang terlibat adalah sebagai berikut: E.coli dan plasmid donorStrain E.coli yang digunakan adalah DH5 yang telah disisipi plasmid pGreenII-0229 yang telah dimodifikasi dan mengandung gen apoptin dan GFP. Plasmid inilah yang akan disisipkan ke dalam Agrobacterium tumefaciens

E. coli helperStrain E. coli yang memiliki plasmid helper didalamnya. Plasmid helper berperan dalam penyisipan plasmid yang diinginkan ke dalam Agrobacterium tumefaciens. Plasmid helper memiliki kemampuan self transmissible, sehingga bisa berpindah melalui konjugasi secara mandiri. Plasmid helper mengkodekan protein yang dibutuhkan untuk menyusun mating bridge dan mentransfer dirinya sendiri ataupun mobilizable plasmid lain ke dalam sel tujuan, dalam hal ini Agrobacterium tumefaciens. Vektor helper yang digunakan pada E. coli DH5 ialah pSoup.

RecipientSel tujuan dimana plasmid termodifikasi akan disisipkan. Dalam rekayasa tanaman, biasanya digunakan Agrobacterium tumefaciens. Dalam kasus ini, yang digunakan adalah Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404.4.2 Tahapan Transformasi Plasmid E. Coli Ke Dalam Agrobacterium1. Mengkultur E. coli DH5 yang telah disisipi plasmid pGreenII-0229. E. coli DH5 yang mengandung plasmid pGreenII-0229, dan resipien yaitu Agrobacterium tumefaciens LBA440. Masing-masing dalam media yang sesuai. Untuk E. coli donor, dan E. coli helper yaitu E. coli DH5, ditambahkan antibiotik Kanamycin. Sementara, pada media kultur Agrobacterium tumefaciens, ditambahkan rifampicin dan tetracycline.1. Memanen dan mencuci masing-masing bakteri untuk menghilangkan antibiotik. Bila kultur menggunakan media cair, diambil lalu dimasukan ke dalam microtube untuk selanjutnya disentrifugasi. Hasil pelet kemudian dicampur kembali dengan media cair yang sesuai.1. Menyiapkan plate berisi media LB agar tanpa tambahan antibiotik1. Satu koloni dari masing-masing bakteri (E. coli DH5 yang mengandung plasmid pGreenII-0229, dan Agrobacterium tumefaciens LBA440), digoreskan secara terpisah ke dalam LB agar dengan posisi sangat dekat satu sama lain1. Dengan kawat ose steril, ketiga strain bakteri dicampur secara merata 1. Plate tersebut lalu diinkubasi selama 12-18 jam pada suhu 30C5 Infeksi Genetik Ke Tembakau Dengan Menggunakan AgrobacteriumTembakau merupakan tanaman dikotil dan inang alami untuk A. tumefaciens (Mayo et al., 2006). Nicotina tabacum (Mayo et al., 2006; Bhatti dan He, 2009) dan Nicotina benthamiana (Anggraito, 2012) merupakan jenis tembakau yang sering digunakan dalam transformasi genetik. Pada jenis N. tabaccum seperti Samsun (Stanic et al., 1999), SRI (Bhatti dan He, 2009), Bright yellow (An, 1985), Xanthi (Su, 2012), dan Kasturi (Miswar, 2005), telah berhasil dilakukan transformasi melalui perantara A. tumefaciens. Daun muda (Jones, 1996; Su et al., 2012) dan suspensi sel (An, 1985; Mayo et al., 2006) merupakan eksplan yang telah berhasil diintroduksi gen asing. Keberhasilan transformasi genetic tembakau telah digunakan untuk berbagai tujuan seperti mengungkap regulasi sistem biologi tanaman (Langbecker et al., 2004), bioremediasi untuk merkuri (He et al., 2001), tanaman model untuk pengujian cekaman biotik (Waigman et al., 2000), dan abiotic (Rizhsky et al., 2002).Tabel 1. Sejumlah Keterlibatan Tembakau dalam Perkembangan Tanaman TransgenikTahunPeristiwa

1982Tanaman transgenik yang pertama dihasilkan berupa tembakau resisten antibiotik

1986Tanaman transgenik pertama kali diuji coba langsung di Prancis dan AS, berupa tembakau tahan herbisida

1987Tanaman tahan serangga berupa tembakau yang tersisipi gen Bt pertama kali dihasilkan oleh Plant Genetic System

1992Tanaman transgenik pertama kali diperkenalkan di Cina dalam bentuk tembakau tahan virus

1994Tanaman transgenik pertama kail dikomersialkan di Eropa dalam bentuk tembakau tahan herbisida bromoxynil

Beberapa tahap tahap ini umumnya dilakukan dalam proses transformasi genetic pada Tembakau dengan Agrobacterium. Umumnya pada proses ini menggunakan Agrobacterium tumefaciens dan dilakukan dengan metode leaf disk

Gambar 21. Pembuatan Planlet Daun Hasil Infeksi Agrobacterium(Sumber: Primrose, et al, 2001)5.1 Persiapan Agrobacterium dan TembakauSebelum A. tumefaciens yang telah disipi gene of interest menginfeksi tembakau, dilakukan preparasi koloni A. tumefaciens dalam medium Saint et al (1994) maupun medium Susanto et al (2011) dan Waluyo et al (2013). Saint et al (1994) [sebagaimana diuraikan oleh Santoso et al (2000)] menumbuhkan A. tumefaciens dalam medium cair LuriaBertani (LB) yang mengandung antibiotic untuk seleksi A. tumefaciens yang telah tersisipi gen/plasmid yang diinginkan (biasanya kanamisin). Susanto et al (2011) dan Waluyo et al (2013) menumbuhkan A. tumefaciens dalam dalam media YEP (yeast extract pepton 10 g/l pepton, 10 g/l kamir dan 5 g/l NaCl) yang ditambahkan antibiotik sebagai kanamisin. Keduanya ditumbuhan selama 24 48 jam pada suhu 28C dengan pengocokan 150-200 rpm. Kultur dilakukan hingga OD600 = 0,5. Pada medium Saint et al (1994), kultur A. tumefaciens dilakukan dalam keadaan gelap dan dikulturkan kembali selama sekitar tiga jam pada kondisi yang sama setelah diencerkan 100 1000 kali dengan medium yang sama.Tembakau yang umumnya disiapkan untuk transformasi genetic biasanya diambil dari daun tembakau muda (umumnya dari hasil perkecambahan in vitro) yang telah disterilkan. Daun tembakau yang diambil dipotong dengan ukuran 5 mm x 10 mm kemudian diprekultur selama 60 menit untuk dijadikan sebagai eksplan.5.2 Inokulasi dan KokultivasiInokulasi dilaksanakan dengan merendam eksplan tembakau dalam suspensi A. tumefaciens selama 30 menit. Setelah inokulasi, eksplan diletakkan di atas kertas saring hingga kering, kemudian eksplan ditanam di media kokultivasi berupa MS (Murashige-Skoog), asetosiringon, serta nutrisi tambahan dan diinkubasi pada kondisi gelap pada suhu 28C selama 2-3 hari. Asetosiringon ditambahkan untuk merangsang transkripsi gen vir agar proses transfer T-DNA ke tumbuhan berlangsung lebih cepat.5.3 Seleksi dan RegenerasiEksplan dipindahkan ke media seleksi yang berupa medium MS, antibiotic atau herbisida untuk menentukan sel tembakau yang telah tersisipi gene of interest (umumnya antibiotic kanamisin) dan antibiotic pembunuh A. tumefaciens (seperti sefotaksim dan karbenisilin untuk membunuh bakteri Gram-negatif). Komposisi media dasar MS seperti pada pustaka. Kultur pada media seleksi diinkubasi pada ruang kultur dengan suhu 27C dengan fotoperiodisitas cahaya 16 jam terang. Eksplan disubkultur setiap 4-6 minggu.Tabel 2. Komposisi Medium MS (Murashige-Skoog)(Sumber: Maeda et al, 1985)

Penanda bahwa telah terjadi perpindahan T-DNA ke dalam kromosom tanaman adalah gen resisten antibiotik. Dalam T-DNA disisipi gen resisten zat kimia tertentu, sehingga, apabila penanda ini telah masuk ke dalam kromosom tanaman, tanaman tersebut akan tahan zat kimia itu. Berikut beberapa penanda (selected marker) yang lazim digunakanTabel 3. Selectable Gene(Sumber: Primrose et al, 2001)

Eksplan/kalus yang bertunas dipindahkan ke media pemanjangan tunas dengan medium dan penambahan yang sama seperti media seleksi. Tunas yang terbentuk pada media pemanjangan tunas dipisahkan dari kalus dan dipindahkan ke media perakaran beruma medium MS disertai penambahan antibiotic seleksi dan nutrisi tambahan pada botol selai. Planlet yang terbentuk siap untuk dipindahkan ke medium tanah.BAB IIIKESIMPULAN

Berdasarkan pembahasan dalam makalah, dapat ditarik beberapa kesimpulan yaitu;1. Fungsi apoptin ialah menginduksi program kematian sel. Potensi tersebut dimanfaatkan untuk terapi gen pada penderita penyakit tumor maupun kanker di mana apoptin non-esensial dalam tubuhnya terperangkap dalam nukleus tanpa mampu berekspresi. Sedangkan protein GFP digunakan sebagai biomarker yang memudahkan peneliti dalam mendeteksi lokasi serta ekspresi gen.2. Cara isolasi apoptin dari gen CAV dengan menggunakan teknik fenol-kloroform.3. Cara isolasi GFP dari ubur-ubur jenis Aequorea victoria adalah teknik separasi HIC.4. Prinsip transformasi gen apoptin ke tumbuhan menggunakan Tri-parental Mating.5. Terdapat dua vektor yang digunakan dalam transformasi GOI ke tumbuhan yakni pGreenII-0229 dan pSoup sebagai vektor helper. Host kompeten yang terpilih untuk mentransformasi GOI ialah E. Coli DH5.6. Insersi gen apoptin ke tembakau menggunakan Agrobacterium dilakukan dengan metode leaf disk, yang langkah-langkahnya berupa persiapan daun tembakau dan kultur Agrobacterium, inokulasi, kokultivasi, seleksi, dan regenerasi.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. N.d. Concept 34: Genes Can Be Moved Between Species. [Online] Diakses dari http://www.dnaftb.org/34/problem.html pada 23 November 2015Arbianto, Puro. 1994. Biokimia Konsep Konsep Dasar. Bandung : ITBBiologyExams4U. Vir genes or virulence region of Ti Plasmid. http://www.biologyexams4u.com/2012/12/vir-region-or-virulence-region-of-ti.html#.VGiKjjSUeCo (diakses 24 November 2015 Pukul 2.50)Campbel dan Reece-Mitchell. Biologi Edisi Kelima Jilid 1. Jakarta : ErlanggaChaidamsari, T., et al. 2006. Ekspresi fenotipe gen APETALA1 kakao (TcAP1) pada eksplan tembakau. Menara Perkebunan, 74(1), 1-9.Gelvin, Stanton B. (2003). Agrobacterium Mediated Plant Transformation: The Biology Behind The Gene-Jockeying Tool. American Society for MicrobiologyGoodsell, David; RSCB Protein Data Bank. 2015. Green Fluorescent Protein. http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=42 diakses pada 27 November 2015.Hao, Wang., Yongyan, Bai. (1990). The Expression of Foreign Gene Under The Control of Cauliflower Mosaic Virus 35s RNA Promoter. Shanghai Institute of Plant Physiology, ChinaHenyhili, Victoria dan Suratsih. 2003. Common Textbook Genetika, Yogyakarta: UNYKetut Sarna, dkk. 2001. Buku Ajar Genetika Singaraja: IKIP N SingarajaMaeda, T., et al, Chlorella Industry Co., Ltd, 1985. Cell culture method. Austria. EP 0049632 B1.Promega. N.d. Bacterial Strain JM109. [Online] Diakses dari https://worldwide.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/bacterial-strains-and-competent-cells/bacterial-strain-jm109/ diakses pada 23 November 2015Primrose, S.B., 2003. Principle of Gene Manipulation 6th edition. USA: Blackwell ScienceSugiyarto, M. n.d. Transformasi T-DNA Agrobacterium sebagai Model Integrasi Gen pada Tumbuhan. [PDF] Tersedia di: http://staff.uny.ac.id/sites/default/files/penelitian/lili-sugiyarto-ssi-msi/agrobacterium.pdf.[Diakses pada 24 November 2015 Pukul 03.30].Santoro, T. J., et al, 2011. Konstruksi Kandidat Gen AV1 Begomovirus pada pBI121 dan Introduksinya ke dalam Tembakau Menggunakan Vektor Agrobacterium tumefaciens Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay (Smith). Jurnal AgroBiogen, 7(1), 9-15Vadawale, Ashutosh, dkk. (2011). Transformation of Agrobacterium Tumifascience LBA 4404 with a Cholin Oxidase-Cox Gene Conferring Salinity Tolerance. Department of Biochemistry, Faculty of Science, The Maharaja Sayajirao University of Baroda.Waluyo, S., et al, 2013. Transformasi Genetik Tembakau dengan Gen Cold Shock Protein melalui Perantara Agrobacterium tumefaciens. Jurnal AgroBiogen,9(2), 58-65.Zambryski, P. et al. 1983. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity. [Jurnal] The EMBO Journal Vol. 2 No. 12 pp.2143 2150.

[3]