rekayasa genetika 2

Makalah Rekayasa genetika

Page 1

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Thereronin 108 merupakan salah satu jenis asam amino yang memiliki peran

penting dalam apoptosis protein apoptin. Menurut hipotesis yang ada, threonin dalam

apoptin mampu menginduksi kematian sel dalam sel kanker. Untuk mengetahui

kebenaran hipotesis tersebut, kita dapat melakukan mutasi gen apoptin.

Mutasi gen dapat dilakukan dengan metode kloning. Pada teknik kloning DNA,

telah diketahui bahwa terdapat cara untuk mengidentifikasi sekuens DNA tertentu

menggunakan hasil kloning DNA tersebut. Namun teknik ini dibatasi oleh beberapa

kondisi yang mengharuskan adanya beberapa modifikasi, seperti modifikasi promoter

untuk memungkinkan adanya transkripsi, modifikasi untuk keperluan pemahaman peran

suatu gen di dalam sel dan perbandingan antara gen asal dan gen hasil kloning. Oleh

karena itu, untuk mencari hubungan antara struktur protein dan fungsinya, kita dapat

melakukan modifikasi. Dalam memodifikasi kode genetik kita dapat melakukan hal-hal

seperti delesi, substitusi, ataupun insersi ataupun hal-hal lainya. Modifikasi ini dapat

digunakan untuk berbagai aplikasi salah satunya untuk mengidentifikasi suatu basa yang

mengkode asam amino tertentu.

Untuk menganalisa thereonin, dapat dilakukan metode site directed mutagenesis.

Dengan metode ini, kita dapat memutuskan sekuens manakah yang akan dilakukan

mutasi. Mutasi ini harus terlebih dahulu mengetahui sekuens basa-basa yang mengkode

protein. Melalui metode ini diharapkan mutasi suatu sisi-sisi basa nitrogen dalam gen

dapt di mutasi dengan tepat. Pada metode ini, basa yang mengkode thereonin 108

digantikan dengan basa yang mengkode asam amino lainnya. Penggantian ini

menyebabkan proses apoptosis menjadi berubah sehingga diketahui akibatnya apabila

asam amino thereonin 108 tidak terdapat dalam apoptin (digantikan dengan asam amino

lain) dan dengan demikian kita mengetahui fungsi dari asam amino thereonin dalam

apoptin.

I.2 Tujuan

Berikut ini merupakan tujuan dari pembuatan makalah ini:

1. Mengetahui pengaruh thereonin 108 di apoptin dalam proses apoptosis.

2. Mengetahui mekanisme site directed mutagenesis.


Page 2

3. Mampu mendesain primer mutagenik yang digunakan dalam site directed

mutagenesis.

I.3 Rumusan Masalah

Thereonin 108 akan dianalisa fungsinya dalam proses apoptosis. Dengan demikian

kita akan menggantinya dengan asam amino lain. Penggantian asam amino ini akan

mempengaruhi apoptosis sehingga kita akan mengetahui pengaruh apakah yang

dihasilkan apabila thereonin 108 digantikan dengan asam amino lain. Oleh karena itu hal/

masalah yang harus dipecahkan adalah:

1. Mampu menentukan kit yang akan kita gunakan dalam proses site directed mutagenesis

ini.

2. Mengetahui letak threonin 108 dalam apoptin dan basa nitrogennya.

3. Mampu menentukan asam amino yang akan menggantikan thereonin 108 (disesuaikan

dengan syarat-syarat yang ditentukan oleh kit yang digunakan).

4. Mampu mendesain primer mutageniknya.

5. Mampu menjalankan mekanisme

I.4 Metode Penulisan

Dalam suatu makalah diperlukan metode penulisan yang baik dan tersusun secara

sistematis untuk memudahkan pembaca dalam memahaminya. Metode penulisan yang

digunakan dalam penulisan makalah ini adalah metode studi literatur dimana sumber

yang diperoleh disesuaikan serta dikembangkan oleh penulis mengacu kepada

permasalahan yang harus dipecahkan dan tujuan pembuatan makalah ini. Penulis

mendapatkan sumber dari buku dan internet serta menggunakan beberapa software

terkait.


Page 3

BAB II

ISI

II.1 Cari sistem (perusahaan tertentu) untuk Site Directed Mutagenesis

Jawaban :

Metode mutagenesis dengan site directed atau desain rasional memiliki

keunggulan jika dibandingkan dengan metode mutagenesis acak (direct evolution), salah

satunya adalah kemampuan untuk memutasi gen pada titik yang benar-benar diinginkan,

sehingga hasil yang didapat diharapkan sesuai dengan keinginan kita tanpa harus

melakukan screening bertahap. Karena itu pula, metode site directed memerlukan

pengetahuan yang jauh lebih mendalam tentang ilmu ikatan protein, juga terhadap fungsi

biologis, atau struktur protein, sedangkan hal-hal tersebut masih sangat terbatas dan

sering tidak tersedia pada masa sekarang ini. Hal ini dikarenakan strategi desain rasional

meliputi beberapa langkah, diantaranya:

Menemukan hubungan antara struktur dan fungsi protein serta stabilitas

molekul melalui informasi dari struktur 3D protein.

Mengidentifikasikan susunan asam amino, seperti mengetahui asam amino

memiliki energy terendah untuk merubah struktur ikatannya.

Merancang protein/enzim dengan sifat yang diinginkan melalui teknik

rekayasa berdasarkan penerapan/peniruan teknik mutasi alam, sehingga dapat

dilakukan analisa terhadap interaksi antara protein-protein, ikatan DNA,

aplikasi karakteristik antibodi, eksplorasi susunan protein, konstruksi hybrod

protein, probing promoter dan region regulasi, serta aktivitas enzim.

Berdasarkan syarat-syarat diatas, jika peneliti ingin membuat desain mutasi

terarah secara manual, diperlukan bantuan superkomputer yang sangat canggih untuk

mengkomputasi situs spesifik mutasi pada vektor dan waktu yang lama karena banyaknya

librari pada mutan yang dihasilkan, selain itu jika menggunakan metode trial and error,

jika gagal maka harus memulai lagi proses mutagenesis dari awal dan memakan biaya

yang besar.


Page 4

Gambar 1. Perbedaan skema proses antara RD dan DE

(Sumber: http://io.ppijepang.org/j/files/Inovasi-Vol19-1-Jul2011.pdf)

Karenanya, kelompok kami memilih untuk menggunakan QuikChange

Site-

Directed Mutagenesis Kit dari perusahaan Stratagene dari California, Amerika Serikat

karena efisiensinya yang mencapai lebih dari 80%. Mutagenesis kit ini dapat digunakan

untuk proses mutasi situs spesifik pada plasmid untai ganda tanpa harus menyediakan

vektor spesifik, situs restriksi tertentu, atau transformasi berkali-kali, sehingga

protokolnya sangat simple dan mudah digunakan. Mutagenesis kit ini dapat digunakan

untuk mutasi titik, menukar asam amino, dan delesi maupun insersi asam amino tunggal

maupun majemuk dan digunakan dengan alat bernama PfuTurbo

DNA polymerase dan

cycler suhu. PfuTurbo

DNA polymerase dapat mereplikasi kedua untai plasmid dengan

ketepatan yang tinggi dan tidak mengganggu primer oligonukleotida mutan.

Material yang disediakan oleh QuikChange

Site-Directed Mutagenesis Kit

berikut spesifikasinya adalah sebagai berikut:


Page 5

Tabel 1. Spesifikasi Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit

Bahan-bahan yang Disediakan

Kuantitas

Catalog #200518

30 reactions

Catalog #200519

10 reactions

PfuTurbo DNA polymerase (2.5 U/ l) 80 U 25 U

10 reaction buffer 500 l 500 l

Dpn I restriction enzyme (10 U/l) 300 U 100 U

Oligonucleotide control primer #1 [34-mer (100

ng/l)]

5` CCA TGA TTA CGC CAA GCG CGC AAT

TAA CCC TCA C 3`

750 ng 750 ng

Oligonucleotide control primer #2 [34-mer (100

ng/l)]

5` GTG AGG GTT AAT TGC GCG CTT GGC

GTA ATC ATG G 3`

750 ng 750 ng

pWhitescriptTM 4.5-kb control plasmid (5 ng/

l) 50 ng 50 ng

dNTP mix 30 l 10 l

XL1-Blue supercompetent cells (blue tubes) 8 200 l 3 200 l

pUC18 control plasmid (0.1 ng/l in TE

bufferc) 10 l 10 l

(Sumber: QuikChange

Site-Directed Mutagenesis Kit Instruction Manual, Catalog #200518 (30

reactions) and #200519 (10 reactions) Revision A.01)

QuikChange

Site-Directed Mutagenesis Kit (Katalog #200518) mengandung reagen

yang cukup untuk total 30 reaksi, dengan 5 reaksi control.

QuikChange

Site-Directed Mutagenesis Kit (Katalog #200519) mengandung reagen


Page 6

yang cukup untuk total 10 reaksi, dengan 5 reaksi control.

10x reaction buffer mengandung: 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4 200 mM Tris-

HCl (pH 8.8), 20 mM MgSO4, 1% Triton

X-100, 1 mG/ml nuclease-free bovine

serum albumin (BSA).

Campuran dNTP hanya boleh dilelehkan sekali dan disiapkan untuk ukuran sekali

pakai dan disimpan dalam suhu -20C dan tidak boleh dibeku-lelehkan berulan-ulang.

Komposisi dNTP merupakan hak milik perusahaan Stratagene dan tidak boleh diganti

dengan dNTP lainnya.

Genotipe XL1-Blue supercompetent cells: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44

relA1 lac [F proAB lacIqZM15 Tn10 (Tetr)]

Kondisi penyimpanan yang tepat adalah sebagai berikut:

XL1-Blue Supercompetent Cells and pUC18 Control Plasmid: 80C

All Other Components: 20C

Materi lain yang diperlukan:

14-ml BD Falcon polypropylene round-bottom tubes (BD Biosciences Catalog

#352059)

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactopyranoside (X-gal)

Isopropyl-1-thio--D-galactopyranoside (IPTG)

Prosedur dasarnya ialah memanfaatkan vektor DNA beruntai ganda (dsDNA)

yang bergelung sedemikian rupa (supercoiled) dengan insert gen yan diinginkan dan dua

primer oligonukleotida sintetik yang mengandung mutasi yang diinginkan. Primer-primer

oligonukleotida tersebut, yang masing-masing berkomplementer dengan untai

seberangnya pada vektor, diperpanjang selama suhu disirkulasikan oleh PfuTurbo

DNA

polymerase. Inkorporasi primer oligonukleotida menghasilkan plasmid bermutasi yang

mengandung staggered nicks.


Page 7

Gambar 2. Staggered Nicks

(Sumber: http://www.memrise.com/mem/1111853/replicative-transposition-mechanism/)

Mengikuti sirkulasi suhu, produk diintroduksikan dengan DPN I endonuklease

(sekuens target: 5`-Gm6ATC-3`) yang spesifik untuk DNA termetilasi dan

terhemimetilasi, digunakan untuk mencerna template DNA parental dan menyeleksi DNA

sintesis yang mengandung gen termutasi. DNA yang diisolasi dari hampir semua strain E.

coli adalah dam termetilasi, karenanya mereka akan menjadi peka terhadap digesti DPN I.

Plasmid DNA yang diisolasi dari hampir semua strain E. coli yang biasanya dipakai

(dam+) sudah termetilasi dan merupakan template yang sesuai untuk mutagenesis,

sedangkan plasmid DNA yang diisolasi dari strain E. coli pengecualian (dam-), termasuk

JM110 dan SCS110, tidak sesuai.

DNA vektor terpotong yang yang mengandung hasil mutasi yang diinginkan

kemudian ditransformasi ke dalam sel supercompetent XL1Blue. Starting DNA template

dalam jumlah kecil yang diperlukan untuk melakukan metode ini, ketepatan yang tinggi

dari PfuTurbo DNA polymerase, dan siklus suhu dalam jumlah kecil, semua ini

berkontribusi terhadap efisiensi mutasi yang tinggi dan penurunan potensi untuk

menghasilkan mutasi acak selama reaksi.

Plasmid kontrol pWhitescriptTM 4.5-kb digunakan untuk menguji efisiensi

generasi plasmid mutan menggunakan QuikChange

Site-Directed Mutagenesis Kit.

Plasmid kontrol pWhitescript 4.5-kb mengandung kodon stop (TAA) pada posisi dimana

kodon glutamin (CAA) biasanya muncul dalam gen -galaktosidase dari phagemid

pBluescript II SK(-) (sesuai dengan asam amino dari 9 protein). Sel supercompetent

XL1-Blue yang ditransformasi dengan plasmid kontrol ini akan tampak putih di plate

agar LB-ampicillin (yang akan dijelaskan pada nomor berikutnya) karena mengandung

IPTG dan X-gal, karena aktivitas -galaktosidase telah dihapuskan. Primer kontrol

oligonukleotida (Oligonucleotide control primer) akan membuat mutasi titik tertentu pada


Page 8

plasmid kontrol pWhitescript 4.5-kb yang mengubah residu T dari kodon stop (TAA)

pada asam amino 9 dari gen -galaktosidase dengan residu C, untuk menghasilkan kodon

glutamin (CAA) yang ditemukan dalam sekuens wild type. Setelah transformasi, koloni

dapat di-screening untuk fenotipe -galaktosidase ( - gal+, biru). Penjelasan lebih

mendalam mengenai proses mutasi site directed akan dijelaskan pada bagian berikutnya.

II.2 Cari gen apoptin

Jawaban :

Berikut ini merupakan asam amino gen apoptin beserta urutan basa nitrogennya, yaitu

setelah EcoRI sampai sebelum Kodon Stop:

Gambar 3. Asam amino gen apoptin beserta urutan basa nitrogennya

II. 3 Tentukan dimana letak posisi threonin 108

Jawaban :

Threonin 108 terletak pada asam amino gen apoptin ke 108 (yang ditunjukkan oleh anak

panah hitam pada gambar di bawah)


Page 9

Gambar 4. Threonin, asam amino apoptin ke 108

dimana urutan basa threonin 108 terletak pada urutan ke 322-324.

Gambar 5. Basa nitrogen threonin 108

Berdasarkan gambar tersebut, kita mengetahui bahwa basa nitrogen thereonin 108 yaitu

ACT.

II. 4 Tentukan pengganti asam amino threonin 108

Jawaban :

Untuk membuktikan apakah benar bahwa asam amino threonin berpengaruh pada

fungsi apoptin sebagai penginduksi kematian sel pada sel kanker, kita akan mengganti

asam amino threonin 108 dengan asam amino lain. Pemilihan asam amino pengganti

thereonin dilakukan secara acak sesuai dengan metode mutagenesis yang kami gunakan.

Pada akhirnya, kita akan melihat perbedaan hasil yang ditunjukkan ketika tidak terdapat

asam amino thereonin 108 dalam gen apoptin tersebut.


Page 10

Asam amino yang kami gunakan adalah arginin. Kami memilih asam amino ini

karena metode mutagenesis yang kami pilih memanfaatkan teknologi PCR dalam proses

mutasinya, dimana dalam metode yang kami pilih ini, kami akan membuat primer untuk

memutasi suatu plasmid. Sarat dari primer untuk metode yang kami pilih adalah

mengandung minimal 40% basa nitrogen Guanine dan Cytocine sehingga kami memilih

asam amino arginin yang memiliki basa nitrogen CGC. Adanya arginin dalam primer

yang akan dimutasi akan memperbesar presentasi Guanine dan Cytocine dalam primer

sehingga kemungkinan keberhasilan mutagenesis akan lebih besar.

II. 5 Dibuat primer untuk site directed mutagenesis sesuai dengan sistemnya

Jawaban :

Mekanisme site directed mutagenesis untuk memutasi gen apoptin tersebut dapat

diilustrasikan pada gambar di bawah.


Page 11

Gambar 6. Mekanisme Site Directed Mutagenesis

Ada 4 tahap yang dilakukan, yaitu isolasi plasmid yang berisi gen dengan sisi

target yang akan dimutasi, temperature cycling (mendenaturasi plasmid) lalu

memperpanjang dan menggabungkan primer mutagenik, digesti metilase, dan

transformasi untai sirkular tersebut.

Dengan demikian yang akan kita lakukan adalah mendesain primer mutageniknya.

Di sini kami mendesain dua primer berdasarkan fungsinya, primer pertama adalah untuk

mendelesi asam amino thereonin 108 dan primer kedua untuk mengganti asam amino

thereonin dengan asam amino arginin.

Terdapat dua jenis primer yang didesain yaitu primer forward dan primer reverse.

Primer-primer tersebut akan di-annealing di daerah plasmid yang terdapat asam amino


Page 12

thereonin 108. Oleh karena itu kita terlebih dahulu harus mengetahui urutan basa nitrogen

di daerah dekat basa nitrogen untuk asam amino thereonon 108. Urutan basa nitrogennya

adalah:

5 3

AGC TTG ATT ACC ACT ACT CCC AGC CGA CCC CGA

Primer mutagenik dimana basa threonin (ACT) digantikan dengan basa arginin (CGC)

adalah sebagai berikut:

Primer forward primer mutageniknya yaitu:

5 3

AGC TTG ATT ACC ACT CGC CCC AGC CGA CCC CGA

Primer reverse primer mutageniknya yaitu:

5 3

TCG GGG TCG GCT GGG GCG AGT GGT AAT CAA GCT

II. 6 Ikuti langkah-langkah pada sistem no. 1

Jawaban :

Secara garis besar, tahapan untuk memutasi Threonin 108 yang berada dalam

apoptin menggunakan Quick Change- Site Directed Mutagenesis Kit digambarkan oleh

diagram alir di bawah ini :

Gambar 7. Diagram alir mutasi menggunakan Quick Change- SDM Kit

Menyisipkan gen apoptin dalam plasmid

(Pembahasan Bab Sebelumnya)

Mengisolasi plasmid yang telah mengandung gen

apotin dari strain E Coli dam+ dan termetilasi

Mendesign primer untuk mutasi threonin 108 sesuai dengan Quick Change- Site Directed Mutagenesis Kit

Thermal Cycling (PCR)

Reaksi Sintesis DNA mutan dengan menggunakan primer yang di design untuk mutasi

Digestion plasmid asal (wild type)

menggunakan Dpn I

Transformasi plasmid ke XL1-Blue

Supercompetent Cells

Color Screening

Elektroforesis


Page 13

Isolasi Plasmid yang Mengandung Gen Apoptin

Plasmid yang telah mengandung apoptin diisolasi dari sel host dan akan dijadikan

bahan untuk mutasi threonin 108. Mutasi threonin 108 bertujuan untuk meneliti aktivitas

apoptosis jika asam amino threonin 108 tersebut di mutasi.

Gambar 8. Plasmid yang telah mengandung apoptin dan threonin 108 sebagai target mutasi

Plasmid-apoptin ini lebih baik diisolasi dari strain E Coli dam+ yang telah termetilasi.

Salah satu contoh strain E Coli dam+ adalah DH5. Tujuan dari pemilihan plasmid yang

termetilasi agar setelah proses mutasi dengan thermal cycling, plasmid wild type yang

masih termetilasi akan terdigesti oleh enzim Dpn I, sedangkan plasmid yang

termutagenesis akan bertahan.

Design Primer untuk Mutasi Threonin 108 (ACT)

Dalam Quick Change- Site Directed Mutagenesis Kit, design primer harus

memenuhi kriteria :

Kedua primer mutagenesis harus mengandung sequence mutasi yang diinginkan dan

menempel pada sequence yang sama dalam strand yang berbeda dari plasmid.

Gambar 9. Primer mutagenesis dalam sequence yang sama di strand yang berbeda

Panjang primer harus diantara 25 45 pasang basa dengan melting temperature (Tm)

78 . Tm primer dalam Quick Change- Site Directed Mutagenesis Kit dapat

dihitung dengan menggunakan kalkulator Tm yang disediakan online oleh

www.stratagene.com atau menggunakan rumus seperti di bawah ini :

Keterangan :

Target yang akan dimutasi


Page 14

N jumlah basa

Mismatch basa yang akan tidak cocok dengan template

Sequence mutasi yang diinginkan harus berada di tengah primer dengan 10-15 basa

yang sesuai di kedua sisinya.

Primer yang optimal memiliki kandungan GC minimum 40%

Dari kriteria tersebut, kelompok kami mendesain primer mutagenik untuk threonin 108

sebagai berikut :

Forward 5 AGC TTG ATT ACC ACT CGC CCC AGC CGA CCC CGA 3

Tm = 78.0 , Bases = 33, GC content = 63.6%, mismatched bases = 3

Reverse 5 TCG GGG TCG GCT GGG GCG AGT GGT AAT CAA GCT 3

Tm = 78.0, Bases = 33, GC content = 63.6%, mismatched bases = 3

Primer mutagenik yang telah kami desain memenuhi keempat kriteria dari Quick Change-

Site Directed Mutagenesis Kit dan dalam primer threonin 108 telah diubah dengan

arginine yang ditandai warna hijau.

Thermal Cycling (PCR)

Proses untuk perbanyakan yang dipakai dalam kit ini adalah thermal cycling.

Stratagene merekomendasikan untuk memakai dinding tabung tipis yang ideal untuk

kontak dengan panas. Thermal cycling yang akan dilakukan untuk dua jenis yaitu sintesis

plasmid yang mutagenik dan plasmid kontrol. Bahan-bahan yang dipakai dalam proses

thermal cycling adalah :

Tabel 2. Bahan untuk proses Thermal Cycling

Bahan

Reaksi untuk Sintesis Plasmid

Mutagenik Reaksi untuk Plasmid Control

1 l of PfuTurbo DNA polymerase (2.5 U/l)


Page 15

Primer yang dipakai untuk reaksi sintesis plasmid mutagenik adalah primer yang

telah kami rancang sebelumnya, sedangkan primer untuk reaksi plasmid kontrol adalah

primer yang sudah disediakan dalam Quick Change- Site Directed Mutagenesis Kit

sekaligus control plasmid plasmidnya (pWhitescript 4.5kb). Di bawah ini merupakan

proses thermal cycling dalam reaksi sintesis plasmid mutagenik.

Gambar 10. Proses sintesis plasmid mutagenik menggunakan thermal cycling

Jika thermal cycling yang ada tidak disusun hot top/ hot start, maka di lapisan atas

ditambahkan 30 l minyak agar polimerase tidak langsung bercampur di awal

(denaturasi). Waktu reaksi thermal cycling adalah sebagai berikut :


Page 16

Tabel 3. Waktu reaksi dalam thermal cycling menggunakan Quick Change- Site Directed

Mutagenesis Kit

Sedangkan untuk sintesis plasmid mutagenik, kita harus memilih banyaknya daur yang

sesuai. Dalam hal ini, mutasi yang kita lakukan adalah mengubah satu asam amino yaitu

threonin 108 menjadi asam amino lain. Sehingga daur yang dibutuhkan untuk thermal

cyling adalah 16.

Tabel 4. Daur untuk sintesis plasmid mutagenik

Setelah proses thermal cycling, dapat dilakukan uji terlebih dahulu dengan elektroforesis

dan dapat juga langsung ke treatment selanjutnya yaitu seleksi plasmid yang termutasi

dengan plasmid wild type. Plasmid yang termutasi dari proses thermal cycling ini

menghasilkan ujung nick dan tidak termetilasi. Seleksi berdasarkan metilasi pada plasmid

yang disediakan oleh kit adalah menggunakan enzim DpnI yang akan dijelaskan lebih

lanjut.

Digestion Plasmid Wild Type menggunakan DpnI

Plasmid awal (Wild type) yang diambil dari strain Ecoli dam+ memiliki strand

yang termetilasi. Sedangkan plasmid mutagenik yang tersintesis sebelumnya sudah tidak

termetilasi. Cara untuk menyeleksi antara plasmid wild type dengan plasmid mutagenik

adalah dengan cara menambahkan enzim DpnI. Enzim DpnI berfungsi memotong/

menghancurkan DNA dam termetilasi sehingga plasmid wild type akan dihancurkan oleh

enzim ini dan plasmid yang termutagenesis bertahan hidup. Dalam kit ini, DpnI

ditambahkan sebanyak 1L (10U/L) langsung untuk setiap reaksi amplifikasi. Campur


Page 17

larutan tersebut dengan cara mem-pipet ke atas dan ke bawah berulang-ulang kali. Setelah

itu disentrifugasi dan diinkubasi dalam suhu 37 selama 1 jam.

Transformasi ke Dalam XL1-Blue Supercompetent Cells

Setelah di seleksi dengan DpnI, telah terpilih plasmid-plasmid yang termutasi.

Plasmid ini akan ditransformasikan ke dalam host cell yang disediakan kit yaitu XL1-

Blue Supercompetent Cells. Plasmid yang dimasukkan ke dalam XL1-Blue

Supercompetent Cells tidak hanya plasmid yang lolos seleksi dari treatment DpnI, namun

juga plasmid control pWhitescript untuk dilihat efisiensi nya dengan menggunakan

screening (yang akan dijelaskan selanjutnya). Selain itu, ujung nick DNA yang termutasi

akan di perbaiki oleh sel host .

Gambar 11. Ujung nick yang diperbaiki oleh sel host

Transformasi yang digunakan sesuai manual book kit ini adalah heat shock,

berikut tahap-tahap transformasi plasmid mutagenik dan plasmid control ke dalam XL1-

Blue Supercompetent Cells :

1. Melakukan thawing sel host yang disimpan dalam suhu -80, untuk setiap reaksi

plasmid mutagenik dan kontrol yang akan ditransformasi, cairkan 50L sel host dalam

falcon 14 mL.

2. Memindahkan DNA yang sudah di treatment dengan DpnI dan plasmid sample ke

dalam larutan sel host yang berbeda dan diinkubasi di es selama 30 menit.

3. Transformasi dengan heat shock 42 selama 45 menit, setelah itu dimasukkan

kembali ke dalam es selama 2 menit.

4. Tambahkan 0,5ml NZY broth pada sel host yang belum dipanaskan dan transformasi

dengan inkubasi dan disentrifuge 225-250rpm.

5. Setelah transformasi, letakkan plasmid di medium LB-ampicilin plates sesuai

komposisi (di bawah) dan diinkubasi 37 > 16 jam


Page 18

Tabel 5. Komposisi medium LB-ampicilin plates

Screening

Untuk menyiapkan LB agar plates untuk bluewhite color screening, tambahkan

80 g/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactopyranoside (X-gal), 20 mM isopropyl-

1-thio--D-galactopyranoside (IPTG), dan antibiotic yang sesuai ke dalam LB agar.

Selanjtnya, 100 l of 10 mM IPTG and 100 l 2% X-gal disebar di atas LB agar plates 30

menit sebelum transformasi. Menyiapkan IPTG pada dH2O steril, X-gal dalam

dimethylformamide (DMF). Jangan campur IPTG dan X-gal sebelum dicampurkan dalam

plates karena akan terpresipitasi.

pWhitescript 4.5-kb plasmid kontrol digunakan untuk menguji efisiensi

generasi plasmid mutagenik dalam QuikChange site-directed mutagenesis kit ini.

pWhitescript 4.5-kb plasmid kontrol mengandung kodon stop (TAA) di posisi kodon

glutamine berada (CAA) yang pada keadaan normal terdapat pada gen -galactosidase

(asam amino ke-9) pBluescript II SK() phagemid. Plamid kontrol ini ditransformasi ke

dalam XL1-Blue supercompetent cells dan ketika diletakkan dalam LBampicillin agar

plates yang mengandung IPTG and X-gal akan berwarna putih, karena akivitas -

galactosidase telah dihapus dengan adanya penggantian CAA menjadi TAA. Namun,

primer oligonucleotide control yang membuat titik mutasi pada pWhitescript 4.5-kb yang

akan mengubah kembali basa residu T pada stop kodon (TAA) di asam amino ke-9 gen -

galactosidase menjadi basa residu C, dan menghasilkan kodon glutamine (CAA) yang

ditemukan dalam wild sequence. Sehingga, koloni yang termutasi ini akan terdeteksi

screened -galactosidase (-gal+, blue) dengan warna biru.

Sehingga dapat disimpulkan, jika mutasi berjalan dengan baik, maka koloni yang

berwarna biru akan lebih banyak dibandingkan dengan koloni yang berwarna putih. Hal

ini dikarenakan mutasi residu T berhasil berubah menjadi C dalam Quick Change- Site

Directed Mutagenesis Kit ini sehingga menghasilkan banyak koloni wild type yang


Page 19

memiliki aktivitas -galactosidase dan menghasilkan warna biru. Tingkat keberhasilan

mutasi pada kontrol plasmid mewakilkan keberhasilan mutasi threonin 108 pada plasmid

apoptin menggunakan Quick Change- Site Directed Mutagenesis Kit ini.


Page 20

BAB III

PENUTUP

Beberapa kesimpulan yang dapat diambil dari pembahasan dalam makalah ini adalah sebagai

berikut :

1. Metode mutagenesis dengan site directed atau desain rasional memiliki keunggulan

jika dibandingkan dengan metode mutagenesis acak (direct evolution), salah satunya

adalah kemampuan untuk memutasi gen pada titik yang benar-benar diinginkan,

sehingga hasil yang didapat diharapkan sesuai dengan keinginan kita.

2. Kelompok kami memilih untuk menggunakan QuikChange

Site-Directed

Mutagenesis Kit dari perusahaan Stratagene dari California, Amerika Serikat karena

efisiensinya yang mencapai lebih dari 80%.

3. Basa nitrogen thereonin 108 adalah ACT.

4. Asam amino yang digunakan sebagai pengganti adalah arginin karena syarat dari

primer untuk metode yang kami pilih adalah mengandung minimal 40% basa nitrogen

Guanine dan Cytocine sehingga dipilihlah asam amino arginin yang memiliki basa

nitrogen CGC.

5. Primer forward primer mutageniknya yaitu:

5 3

AGC TTG ATT ACC ACT CGC CCC AGC CGA CCC CGA

6. Primer reverse primer mutageniknya yaitu:

5 3

TCG GGG TCG GCT GGG GCG AGT GGT AAT CAA GCT

rekayasa genetika 2

Documents