PRODUKSI OBAT DENGAN REKAYASA GENETIKA

TRESNA LESTARI

DNA REKOMBINAN

• Melakukan kloning gen yang diinginkan ke dalam sel transforman

• Satu organisme dimanipulasi menjadi organisme baru (sel transforman) yang membawa sifat kombinasi baru (novel-combination)

• Organisme baru dapat membuat produk baru yang sebelumnya tidak dapat dibuat secara alami

Bahan yang dibutuhkan untuk kloning

• Molekul DNA asing yang akan disisipkan• Vektor• Enzim restriksi• Enzim ligase • Sel inang

Isolasi DNA

Vektor

• Alat untuk memindahkan DNA asing ke sel inang

• Dapat bereplikasi sendiri (self replication) di dalam sel inang

• Beberapa jenis vektor : Plasmid

Bakteriofaga Cosmid Transfosom

Plasmid yang ideal untuk vektor

• Ukurannya kecil

• Memiliki Origin Of Replication (ORI)Inisiasi proses replikasi

• Memiliki gen untuk seleksi (selectable marker)Seleksi transforman dan non transforman

• Memiliki sisi pengenalan enzim restriksi (restriction site)

Menyisipkan DNA insert

multiple cloning site (MCS)

/

Enzim Restriksi

• Enzim endonuklese yang terdapat pada sebagian besar sel bakteri

• Pertama kali ditemukan oleh WERNER ARBER & HEMILTON SMITH

• Dapat mengenali dan memotong urutan basa nukleotida yang spesifik (palindrom)

• Hasil pemotongan dapat berupa ujung yang menonjol (sticky end) atau ujung rata (blunt end)

Enzim restriksi Sumber Sisi

pengenalanBamHI Bacillus amyloliquefaciens G↓GATCC

EcoRI Eschericia coli RY13 G↓AATTC

HindIII Haemophilus influenzae Rd A↓AGCTT

PstI Providencia stuartii CTGCA↓G

SmaI Serratia marcescens CCC↓GGG

Enzim DNA LigaseMenggabungkan fragmen-fragmen secara kovalen

Ligation

cut plasmid

Using ‘sticky ends’

PRINSIP KLONING

TAHAPAN :

1.RESTRIKSI2.LIGASI3.TRANSFORMASI4.SELEKSI

Transformasi

• Heat shock (Kejut Panas)• Electroporation• Biolistic transformation “Gene gun”

Heat Shock

Electroporation

• Prinsip: pembukaan membran pembentukan pori sel tanaman dengan muatan listrik

• DNA in the surrounding solution can enter the cell through these pores and become incorporated into the cell’s nuclear genome through illegitimate recombination

Biolistic transformation – “Gene gun”

DNA is precipitated on the surface of heavy metal (gold; tungsten) particles

Loaded particles are driven into plant cells by high velocity gas propulsion (originally gunpowder; now helium)

Distance between discharge nozzle and tissue can be optimized, as can particle velocity

Target tissue must be regenerable

SELEKSI SEL TRANSFORMAN1. Gen penanda resistensi antibiotik sel non

transforman tidak tumbuh

2. Gen pengkode β-galaktosidase Seleksi koloni biru putih :

• Adanya lac operon pengkode enzim β-galaktosidase

• X-gal substrat enzim β-galaktosidase warna biru

• DNA asing dalam plasid menyebabkan lac operon tidak menghasilkan enzim β-galaktosidase warna putih

PRINSIP KLONING INSULIN

1. Menyiapkan plasmid

2. Menyisipkan human cDNA

3. Rekombinan plasmid ditransfer ke sel bakteri

4. Sel bakteri berkembang dan menghasilkan insulin

5. Insulin diisolasi dan dimurnikan

PRODUK APLIKASI SEL INANG

Interferon Infeksi virus dan kanker E. coli

Interleukin 2 Kanker dan aktivasi sistem imun E. Coli

Insulin Diabetes melitus E. coli

Aktivator plasminogen

Penyumbatan darah/stroke

E. coli

ErythropoietinMenstimulasi pembentukan sel darah merah

CHO

Tumor Necrosis Factor

Penghancuran sel tumor BHK

CHO : chinese hamster ovary; BHK : baby hamster kidney cells

• 2L E. coli hasil rekayasa dapat menghasilkan somatostatin (hormon pertumbuhan) setara dengan yang dihasilkan 100 otak kambing

Insulin

Interferon

Erythropoietin

PRODUKSI VAKSIN BAKTERIA

Vaksin konvensional : • Menggunakan kuman yang sudah dimatikan• Harus diberikan secara berulang dan periodik

Vaksin bakteria :• Menggunakan bakteri hidup yang dilemahkan• Daya proteksinya lebih lama• Contoh : vaksin kolera mengandung Vibrio

cholera yang dilemahkan dengan menghilangkan gen penghasil enterotoksin dengan teknologi DNA rekombinan

• Gene of interest is isolated• It is microinjected into a fertilized egg cell– The hope is that the foreign DNA will be taken into the host

DNA and replicated with each division.

• Egg is put into a host animal• It is only when the animal is born that they find out if

it has foreign DNA in all of its cells• Dolly -nuclei from adult cells were injected into eggs

cells which had their nucleus removed

TRANSGENIC ANIMALS

DOLLY

Human Cloning

Want to know more? Just ask!