tahap 2.docx

5/24/2018 Tahap 2.docx

1/23

TUGAS PENGEMBANGAN METODE ANALISIS

TAHAP II

Detection of the residues of nineteen pesticides in fresh vegetable

samples using gas chromatography mass spectrometry

OLEH:

KELOMPOK VI

Yuni Muftihatin 1108505023

Putu Eka Ayu Sunariyani 1108505046

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS UDAYANA

2014


2/23

1

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pestisida

Pestisida secara umum adalah substansi kimia yang digunakan untuk

membunuh atau mengendalikan berbagai hama (Raini, 2007). Menurut Keputusan

Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor: 1350/MENKES/SK/XII/2001

Pestisida adalah semua zat kimia dan bahan lain serta jasad renik dan virus yang

dipergunakan untuk :

a.

Memberantas atau mencegah hama-hama dan penyakit yang merusak

tanaman, bagian-bagian tanaman atau hasil-hasil pertanian.

b. Memberantas rerumputan.

c. Mematikan daun dan mencegah pertumbuhan yang tidak diinginkan.

d. Mengatur atau merangsang pertumbuhan tanaman atau bagian-bagian

tanaman tidak termasuk pupuk.

e. Memberantas atau mencegah hama-hama luar pada hewan-hewan piaraan dan

ternak.f. Memberantas atau mencegah hama-hama air.

g. Memberantas atau mencegah binatang-binatang dan jasad-jasad renik dalam

rumah tangga, bangunan dn dalam alat-alat pengangkutan; dan atau

h. Memberantas atau mencegah binatang-binatang yang dapat menyebabkan

penyakit pada manusia atau binatang-binatang yang perlu dilindungi dengan

penggunaan pada tanaman, tanah atau air.

Penggolongan pestisida berdasarkan struktur kimianya yang merupakan sub

kelompok pestisida terbesar terdiri dari:

1. Golongan organochlorin

Organochlor adalah pestisida yang mengandung unsur-unsur karbon,

hidrogen, dan chlorin. Atom-atom chlor dalam komposisinya terikat pada atom

hidrokarbon. Secara kimiawi golongan ini relatif stabil dan kurang reaktif,


3/23

2

ditandai dengan dampak residunya yang lama terurai di lingkungan. Kelompok

organoklorin merupakan racun terhadap susunan syaraf baik pada serangga

maupun mamalia. Keracunan dapat bersifat akut atau kronis yang bersifat

karsinogen. Contohnya, aldrin, chlordane, DDT, dieldrin, dan endosulfan (Raini,

2007).

Endosulfan merupakan salah satu contoh pestisida golongan ini yang

memiliki titik didih 700C. Endosulfan praktis tidak larut dalam air, larut dalam

sebagian besar pelarut organik (Moffat et al, 2005).

2. Golongan organofosfat.

Jenis pestisida ini mengandung unsur-unsur fosfat, karbon dan hidrogen.

Pestisida ini terdiri dari satu gugus atau lebih fosfor yang terkait pada molekul

organik. Organofosfat dibuat dari satu molekul organik yang direaksikan dengan

fosforilat. Pestisida ini mempunyai efek memblok penyaluran inpuls syaraf

dengan cara mengikat enzim asetilkolinestrase. Keracunan kronis pestisida

golongan ini berpotensi karsinogenik. Contohnya parathion, malathion,

chlorpyrifos, diazinon, dan fenitrothion.

Gambar 1. Struktur kimia dari (A) Parathion; (B) Malathion; (C) Fenitrorthion; (D)

Chlorpyrifos (Moffat et al, 2005)


4/23

3

3. Golongan Karbamat

Karbamat adalah jenis pestisida yang mengandung gugus karbamat.

Kelompok ini merupakan ester asam N-metilkarbamat. Golongan ini dapat

menghambat asetilkolinesterase, tetapi pengaruhnya terhadap enzim tersebut tidak

berlangsung lama, karena prosesnya cepat reversible. Contoh golongan ini adalah

carbofuran dan carbosulfan (Raini, 2007).

4. Golongan piretroid

Piretroid berasal dari piretrum diperoleh dari bungan Chrysanthum

cinerariaefolium. Piretrum mempunyai toksisitas rendah pada manusia tetapi

dapat menimbulkan alergi pada orang yang peka. Contohnya cypermethrin,

deltamethrin, dan fenvalerate.

Gambar 2. Struktur kimia deltamethrin (Moffat et al, 2005)

2.2 Preparasi dan Clean-upSampel dengan Solid Phase ExtractionSolid phase extraction (SPE) merupakan metode preparasi sampel yang sering

digunakan dalam isolasi dan/atau membersihkan komponen yang diinginkan dari

larutan sampel. SPE umumnya membuat larutan sampel menjadi kontak dengan

sebuah fase padat atau sorben (penyangga) dimana komponen secara selektifteradsorpsi ke permukaan dari fase padat sebelum terelusi (Dean, 2009). SPE

merupakan merupakan metode utama untuk praperlakuan sampel atau untuk clean up

sampel-sampel yang kotor, misal sampel-sampel yang memiliki kandungan matriks


5/23

4

yang tinggi seperti garam-garam, protein, polimer, resin, dan lain-lain (Gandjar dan

Rohman, 2007).

Ekstraksi fase padat (SPE) merupakan metode pemisahan yang banyak

digunakan dalam ekstraksi dan clean up sampel fitofarmasi. Dalam analisis residu

pestisida, sampel tanaman terdiri dari berbagai komponen dengan sifat fisiko-kimia

dan sifat biologis yang berbeda sehingga diperlukan suatu metode pemisahan dan

clean upyang tangguh dan selektif untuk mengekstraksi multi residu pestisida dari

sampel untuk selanjutnya dapat dianalisis dengan metode GC/LC-MS. Secara garis

besar, ekstraksi sampel untuk analisis residu pestisida meliputi proses ekstraksi untuk

memperoleh analit dari sampel solid bahan tanaman dan selanjutnya diclean up untuk

menghilangkan matriks yang dapat mengganggu analisis dan mempengaruhi

kromatogram yang dapat dihasilkan dari GC/LC-MS. Proses preparasi sampel dan

ektraksi merupakan titik kritis dalam suatu analisis. Metode yang tepat dalam

preparasi sampel akan sangat mempengaruhi hasil yang akan diperoleh. Berbagai

faktor harus diperhatikan dalam menentukan suatu metode preparasi yang tepat

meliputi kelarutan, volatilitas, stabilitas, sifat asam bas serta komponen matrik yang

dapat mengganggu analisis (air, lipid, resin dan pigmen) (Durovic dan Dordevic,2011).

Proses preparasi sampel umumnya merupakan tahapan yang mengkonsumsi

60-70% waktu dari analisis, sehingga dibutuhkan suatu prosedur analisis dengan

metode preparasi yang efisien secara ekonomi dan wkatu, memberikan hasil yang

akurat dan tangguh untuk digunakan sebagai metode analisis rutin, tetapi tetap mudah

dan aman untuk dilakukan (Tan dan Chai, 2011). Metode analisis yang paling umum

digunakan dalam penetapan residu pestisida adalah kromatografi gas (GC) ataupun

kromatografi cair (LC) yang dikombinasikan dengan detektor spektrometri massa

(MS), sehingga prosedur preparasi yang digunakan harus kompatibel dan dapat

menunjang sistem analisis yang digunakan. Tahapan utama dalam preparasi sampel

multi residu pestisida meliputi:

1. Homogenisasi sampel untuk memperoleh matriks yang seragam


6/23

5

2. Ektraksi residu pestisida dengan menggunakan pelarut yang sesuai

3. Tahap clean up yang berfungsi menghilangkan komponen matriks yang dapat

mengganggu selama proses analisis dengan LC/GC MS

4. Proses elusi dan/atau fraksinasi analit yang telah diekstraksi

5. Memekatkan eluen dan rekonstitusi dengan menggunakan solven yang

kompatibel dengan kondisi GC/LC.

(Tan dan Chai, 2011).

Preparasi sampel yang sebelumnya banyak digunakan dalam pemisahan

residu pestisida adalah ekstraksi cair-cair dan sokletasi. Metode ini memang

sederhana, akan tetapi pada metode ini membutuhkan banyak pelarut organik dan

menghasilkan limbah yang memerlukan penanganan khusus, selain itu metode ini

tidak dapat secara optimum digunakan untuk memisahkan dan clean up analit dari

berbagai komponen matriks sampel yang dapat menggangu analisis. Berdasarkan

keterbatasan dari metode tersebut, dibutuhkan suatu metode yang tangguh dan dapat

menghasilkan efisiensi pemisahan baik dalam preparasi sampel untuk analisis residu

pestisida. Metode ekstraksi fase padat (SPE) merupakan metode yang

direkomendasikan untuk preparasi dalam analisis multi residu pestisida denganmetode GC/LC-MS. Metode ini dapat memisahkan dan memurnikan analit dari

matrik yang kompleks pada sampel bahan tanaman, SPE juga memiliki durasi analisis

yang lebih pendek, konsumsi solven yang dibutuhkan lebih minimal, pemisahan yang

lebih optimum dan efisien, tahapan analisis yang lebih singkat dan mudah, dapat

secara simultan digunakan untuk berbagai jenis golongan pestisida, effective costdan

dapat secara luas dapat diaplikasikan untuk analisis residu pestisida dalam berbagai

jenis (Parada et al., 2011).

Prinsip pemisahan pada ekstraksi fase pada didasarkan atas proses penjerapan

analit pada medium SPE dengan cara memasukkannya pada selongsong di dalam

suatu pelarut yang memiliki daya mengelusi rendah. Analit tersebut kemudian dapat

dibilas dengan pelarut lain yang berdaya elusi rendah kemudian akhirnya dielusi


7/23

6

dengan pelarut berdaya elusi kuat dengan volume yang kecil (Watson, 2005). Metode

ini terdiri atas empat tahapan utama yaitu:

a. Pengkondisian sorben dengan pelarut

Tahap ini merupakan tahap yang sangat krusial dan meliputi proses

pembasahan packing material, solvatasi grup fungsional penjerap serta

penghilangan pengotor pada permukaan penjerap. Pelarut yang digunakan

dalam pengkondisian sangat bergantung dari sifat sorben yang digunakan.

Pencegahan terhadap pengeringan pada permukaan sampel harus dilakukan

karena permukaan sorben yang kering akan menyebabkan retensi analit yang

terjadi tidak efisien. Apabila terjadi kekeringan pada permukaan sorben, maka

perlu dilakukan tahap pengkondisian ulang (Tan dan Chai, 2011).

Pengkondisian sorben dilakukan dengan pelarut atau buffer dengan komposisi

yang sama dengan larutan sampel yang akan diekstraksi yang nantinya akan

ditarik melalui sorben (Dean, 2009). Kolom dialiri dengan pelarut sampel

untuk membasahi permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang

sama, sehingga perubahan-perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika

sampel dimasukkan dapat dihindari (Gandjar dan Rohman, 2007)b. Penuangan dan tertahannya sampel

Larutan sampel dilewatkan ke cartridge untuk menahan analit yang

diharapkan dan komponen lain akan terelusi (Gandjar dan Rohman, 2007).

Volume yang digunakan antara 1 mL hingga 1 L tergantung dari sistem yang

digunakan. Aplikasi larutan sampel ke dalam sorben dapat dilakukan

berdasarkan gravitasi, sistem pompa ataupun vakum. Pada tahap ini, analit

akan terkonsentrasi pada permukaan sorben. Meskipun terdapat beberapa

komponen matriks yang ikut tertahan pada sorben, umumnya matriks akan

terelusi melewati sorben sehingga terjad proses pemisahan dan pemurnian

(Tan dan Chai, 2011).

c. Pembilasan atau pencucian sorben


8/23

7

Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak

tertahan oleh penjerap selama tahap retensi (Gandjar dan Rohman, 2007).

Tahap ini dilakukan dengan mencuci menggunakan pelarut denga daya elusi

yang rendah yang bertujuan untuk menghilangkan material eksternal yang

tidak diinginkan tanpa mempengaruhi elusi komponen yang diinginkan (Dean,

2009; Tan dan Chai, 2011).

d. Elusi komponen yang diinginkan.

Tahap terakhir untuk mengambil analit yang dikehendaki yang tertahan dalam

penjerap (Gandjar dan Rohman, 2007). Komponen yang diinginkan dielusi

dari sorben atau penjerap menggunakan pelarut dengan volume yang diatur

sedemikian rupa hingga dapat diperoleh perolehan kembali analit secara

kuantitatif dengan pengenceran yang rendah. Laju alir yang digunakan harus

dapat menghasilkan efisiensi selama pengelusian (Dean, 2009; Tan dan Chai,

2011).

Secara umum penjerap atau sorben dibedakan menjadi 3 kelas, yakni fase

normal, fase terbalik, dan penukar ion.Penjerap fase normal memiliki gugus fungsi

yang bersifat polar seperti silika, alumina, amino, cyano, dan diol. Sifat polar inimenunjukkan bahwa penjerap lebih suka terhadap komponen-komponen polar seperti

fenol yang nantinya akan tertahan. Sebaliknya pada penjerap fase terbalik memiliki

gugus fungsi yang bersifat nonpolar seperti oktadesil, oktil, metil, dan akan menjerap

komponen yang bersifat non polar seperti hidrokarbon polisiklik aromatik. Penjerap

penukar ion memiliki gugus fungsi kationik atau anionik dan saat terionisasi akan

menarik ion dengan muatan yang berlawanan (Dean, 2009). Pada pemilihan sistem

penjerap/sorben yang digunakan dalam pemisahan residu pestisida, penjerap yang

bersifat non polar berupa oktadesil (C18) yang terikat pada silika. Sorben reverse

phase lebih dipilih karena dapat meningkatkan retensi analit organik dalam fase

berair. Sistem ini dapat diterapkan dalam ekstraksi pestisida golongan organoklorin

yang tidak membutuhkan proses clean up komponen lipid didalam sampel. Sistem ini


9/23

8

menghasilkan retensi dan selektifitas yang khas untuk senyawa golongan

organoklorin (Kang dan Chang, 2011).

Ekstrak atau sampel tertentu membutuhkan tahap pemurnian dengan

menggunakan berbagai metode clean up untuk menghilangkan interferen yang dapat

mengganggu analisis seperti komponen lipid. Interferen ini banyak ditemukan dalam

penetapan multi residu pestisida terutama pada sampel yang berasal dari bahan

tanaman. Metode ini menggunakan sistem ekstraksi fase pada dengan penjerap yang

terdiri dari silika netral, florisil dan silika asam. Pada tahap clean up untuk penetapan

residu pestisida golongan organoklorin, kombinasi penggunaan penjerap florisil,

silika dan penjerap netral seperti sodium fosfat dapat memberikan proses clean up

yang lebih optimum. Pada tahap pemurnian dan clean up untuk multi residu pestisida

senaywa golongan organoklorin, pelarut n-hexane dengan kombinasi diklorometan

yang digunakan dapat memberikan efisiensi dan meningkatkan perolehan kembali

selama proses pemisahan dibandingkan penggunaan pelarut hanya dengan n-hexana.

Fungsi dari penggunaan N-hexane ini untuk mengekstraksi komponen lipid dan

matriks lainnya yang terdapat dalam sampel (Lino et al., 1998).

2.3 Gas Chromatography Mass Spectrometry

Kromatografi gas-spektrometer massa (GC-MS) adalah metode yang

mengkombinasikan kromatografi gas dan spektrometri massa untuk mengidentifikasi

senyawa yang berbeda dalam analisis sampel. GC-MS adalah terdiri dari dua blok

bangunan utama: kromatografi gas dan spektrometer massa. Adapun kelebihan dari

GC-MS adalah:

1. Efisien, resolusi tinggi sehingga dapat digunakan untuk menganalisa partikel

berukuran sangat kecil.

2. Aliran fasa bergerak (gas) sangat terkontrol dan kecepatannya tetap.

3. Pemisahan fisik terjadi didalam kolom yang jenisnya banyak sekali, panjang

dan temperaturnya dapat diatur.


10/23

9

4. Sangat mudah terjadi pencampuran uap sampel kedalam fasa bergerak.

5. Analisis cepat, biasanya hanya dalam hitungan menit.

6. Tidak merusak sampel.

7. Sensitivitas tinggi sehingga dapat memisahkan berbagai senyawa yang saling

bercampur dan mampu menganalisa berbagai senyawa meskipun dalam

kadar/konsentrasi rendah.

(Hites, 1999)

Prinsip kerja Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa (KG-SM) yaitu, cuplikan

diinjeksikan kedalam injektor. Aliran gas dari gas pengangkut akan membawa

cuplikan yang telah teruapkan masuk kedalam kolom. Kolom akan memisahkan

komponen-komponen dari cuplikan. Komponen-komponen tersebut terelusi sesuai

dengan urutan semakin membesarnya nilai koefisien partisi (K), selanjutnya masuk

dalam spektrofotometer massa (MS). Pada spektroskopi massa komponen cuplikan

ditembaki dengan berkas elektron dan diubah menjadi ion-ion muatan positif yang

bertenaga tinggi (ion-ion molekuler atau ion-ion induk) dan dapat pecah menjadi ion-

ion yang lebih kecil (ion-ion anak pecahan atau ion-ion induk), lepasnya elektron dari

molekul /komponen-komponen menghasilkan radikal kation. Ion-ion molekul, ion-ion pecahan, dan ion-ion radikal pecahan dipisahkan oleh ion pembelokan dalam

medan magnet yang berubah sesuai dengan massa dan muatannya. Perubahan

tersebut menimbulkan arus (arus ion) pada kolektor yang sebanding dengan limpahan

relatifnya. Kemudian dicatat sebagai spektra massa yang merupakan gambaran antara

limpahan relative dengan rasio massa/muatan (m/z) (Sastrohamidjojo, 1985).

Spektrometri massa (SM) adalah suatu instrumen yang dapat menyeleksi

molekul-molekul gas bermuatan berdasarkan massanya. Spektrum massa diperoleh

dengan mengubah senyawa cuplikan menjadi ion-ion yang bergerak cepat yang

dipisahkan berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan (m/z)

(Fessenden,1992).

Spektrometer massa bekerja dengan molekul pengion yang kemudian akan

memilah dan mengidentifikasi ion menurut massa, sesuai rasio fragmentasi mereka


11/23

10

(m/z). Dua komponen kunci dalam proses ini adalah sumber ion (ion source) yang

akan menghasilkan ion dan analisis massa (mass analyzer) yang menseleksi ion.

Gambar 3. Instrumentasi Kromatografi Gas Spektrofotometri Massa

Komponen kromatografi gas spektrofotometri massa (GC-MS)

a. Gas Pembawa

Gas pembawa yang paling sering dipakai adalah helium (He), argon (Ar),

nitrogen (N2), hidrogen (H2), dan karbondioksida (CO2). Keuntungannya adalah

karena semua gas ini tidak reaktif dan dapat dibeli dalam keadaan murni dan kering

yang dikemas dalam tangki tekanan tinggi. Pemilihan gas pembawa tergantung padadetektor yang dipakai. Gas pembawa harus memenuhi sejumlah persyaratan, antara

lain, harus inert (tidak bereaksi dengan sampel, pelarut sampel, material dalam

kolom), murni, dan mudah diperoleh (Agusta, 2000).

b. Injector (Inlet sampel)

Inlet sampel memungkinkan penghantaran sampel dalam jumlah yang sangat

kecil dari berbagai sumber menuju kolom. Kolom dengan fase gerak digunakan untuk

penghantaran sampel gas melewati kolom menuju sumber ionisasi.

- Split Inlet (Injeksi terpecah)

Injeksi terpecah (split injection), yang mana sampel yang diinjeksikan

diuapkan dalam injector yang panas dan selanjutnya dilakukan pemecahan (Gandjar

dan Rohman, 2012).


12/23

11

- Splitless Inlet

Splitless inlet menggunakan instrumentasi yang sama dengan split inlet dan

meningkatkan sensitivitas dengan mentransfer hampil seluruh sampel yang

diinjeksikan menuju kolom kapiler, Pada dasarnya, splitless injection menggunakan

instrumentasi yang sama dengan split, kecuali katup pembersih yang ditutup saat

penginjeksian dan tetap ditutup dalam jangka waktu tertentu (biasanya 30 60

detik)(Grob and Barry, 2004).

Splitless inlet dipanaskan dengan temperature yang cukup tinggi untuk

menjamin penguapan sampel dan pencampuran dengan gas pembawa tanpa

terdegradasi oleh panas. Selama periode tersebut, uap sampel tidak dapat menuju

kolom kapiler. Saat katup dibuka, uap sampel pada inlet akan dengan cepat tersapu

keluar dari katup. Sekitar 95% dari sampel yang diinjeksikan akan mencapai kolom

kapiler. Injeksi menggunakan splitless inlet dapat meningkatkan limit deteksi dan

menjadi teknik yang digunakan untuk trace analysis (konsentrasi analit dalam ppm

dan ppb), walaupun preparasi sampel yang kompleks masih diperlukan injeksi.

Selama periode ini, uap sampel tidak memiliki tempat untuk pergi tapi ke kolom

kapiler. Ketika katup pembersih dibuka, setiap uap sampel yang tersisa diinlet dengancepat menyapu keluar dari katup pembersih (Grob and Barry, 2004).

Sampel harus dilarutkan dengan pelarut yang mudah menguap seperti heksana

atau metanol dan 1-5 L larutan tersebut diinjeksikan pada inlet yang telah

dipanaskan. Untuk menghasilkan kromatogram yang baik, analit yang akan dianalisis

dengan splittles injection harus memiliki titik didih 300C di atas pelarut yang

digunakan (McNair and Miller, 1998).

c. Kolom

Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di dalamnya

terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen sentral pada

kromatografi gas (Rohman, 2009). Keberhasilan suatu proses pemisahan terutama

ditentukan oleh pemilihan kolom. Kolom dapat terbuat dari tembaga, baja tahan


13/23

12

karet, aluminium, atau gelas. Kolom dapat berbentuk lurus,melengkung,atau

gulungan spiral sehingga lebih menghemat ruang (Agusta, 2000).

Gambar 4. Skema GC/MS

d. Jet Separator

Senyawa yang keluar dari kolom GC bersama dengan gas pembawa

dilewatkan interface/transfer lineyang suhunya juga tinggi untuk menjaga agar yang

akan masuk ke MS tetap dalam fase gas. Alat biasanya dilengkapi dengan jet

separator untuk memisahkan gas pembawa dengan senyawa yang akan dianalisis.

Gambar 5. Jet Separator


14/23

13

e. Sumber IonElectrospray Impact Ionization

Inonisasi pada kromatografi gas spektrofotometri massa dapat dilakukan

denganElectrospray Impact Ionization. Electrospray Impact Ionization adalah nergi

ionisasi yang sering digunakan adalah 70 eV. Proses ionisasi electron impactdapat

dijelaskan dengan model gelombang atau partikel. Teorinya didasarkan atas interaksi

antara elektron yang berenergi tinggi dengan elektron terluar dari molekul.

Penyerapan energi awalnya mengarah pada pembentukan molekul M+ dengan

melepaskan sebuah elektron. Kelebihan energi ini menyebabkan eksitasi pada tingkat

energi rotasi dan vibrasi dari redikal kation ini. Proses selanjutnya dari fragmentasi

tergantung dari banyaknya jumlah kelebihan energi dan kemampuan molekul untuk

stabilisasi internal (Hubschmann, 2009).

Ketika analit keluar dari kolom kapiler, ia akan diionisasi oleh elektron dari

filamen tungsten yang diberi tegangan listrik. Ionisasi ini terjadi bukan karena

tumbukan elektron dan molekul, tapi karena interaksi medan elektron dan molekul

ketika berdekatan. Hal tersebut menyebabkan satu elektron terlepas, sehingga

terbentuk ion molecular M+yang memiliki massa sama dengan molekul netral tetapi

bermuatan lebih positif.Untuk analisis keragaman jenis pestisida dengan metode analisis multi residu,

EI lebih banyak digunakan pada sebagian besar pestisida halogen karena

sensitivitasnya yang tinggi pada senyawa halogen. Keuntungan EI lainnya adalah

tersedia library yang luas pada full scan mode dalam konfirmasi senyawa yang

diidentifikasi dengan membandingkannya dengan pustaka (Raina and Hall, 2008).


15/23

14

Gambar 6. Proses ionisasi sampel

Gambar 7. Reaksi Ionisasi Elektron

Setelah molekul diubah menjadi ion kemudian ion ini masuk ke mass analyzer.

Gambar 8. Sumber ionisasi electron


16/23

15

f. Mass Analyzer

Quadrupole Analyzer

Pada Quadrupole terdapat empat batang yang menyerupai kolom yang

tersusun paralel dengan arus searah atau Direct Current (DC) tegangan dan

potensial frekuensi radio atauRadio-Frequency(RF) (Siuzdak, 1996).

Gambar 9. QuadrupoleAnalyzer

Medan quadrupoles digunakan untuk menentukan ion mana yang dapat

masuk untuk mencapai detektor. Quadrupolejuga memiliki fungsi sebagai filter

massa. Pada medan quadrupole, ion akan bergerak ke wilayah medan dan akan

berosilasi tergantung pada rasio massa per muatan dan frekuensi radio, dimana

hanya ion tertentu dalam batas nilai potensial terhadap muatan dibiarkan

terbawa dengan cepat yang melewati filter. M/z dari ion dengan demikian

ditentukan dengan mengkorelasikan medan yang diterapkan pada quadrupoles

dengan ion yang mencapai detektor. Spektrum massa dapat diperoleh dengan

penandaan RF, dimana menggambarkan jalur ion yang memiliki nilai m/z

berbeda yang memasuki quadrupole dengan DC tetap dan pada RF hanya ion

dengan m/z tertentu yang dapat untuk melewatinya (Siuzdak, 1996).

g. Detektor

Detektor pada kromatografi gas spektrofotometri massa berfungsi untuk

mendeteksi ion-ion yang sudah dipisahkan menurut ratio m/z (mass to charge ratio).


17/23

16

Electron Multiplier (EM)

Pada detektor EM, ion dari analyser dipercepat hingga kecepatan yang tinggi

intuk menjamin efesiensi pendeteksian. Sebuah electron multiplier (pengganda

elektron) merupakan salah satu dari deteksi ion yang memiliki sensitifitas yang

tinggi melalui pengembangan prinsip yang digunakan padaFaraday Cup. Dimana

pada Faraday Cup menggunakan satu dynode, sedangkan pada electron

multiplierterdiri dari serangkaian dynode yang dipertahankan pada potensial yang

semakin meningkat.Ion menumbuk permukaan dynode, menghasilkan emisi

elektron. Elektron sekunder ini yang kemudian terikat pada dynode kedua dimana

akan dihasilkan elektron sekunder yang selanjutnya. Pada akhirnya akan

dihasilkan 106 elektron. Masa hidup dari electron multiplier adalah 1-2 tahun

(Siuzdak, 1996).

2.4 Validasi Metode

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter

tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter

tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Tujuan dari validasi metodeanalisis ini adalah untuk menjamin bahwa prosedur analisis yang dilakukan akurat,

presisi dan sesuai dengan tujuan yang telah ditetapkan (ICH, 2005).

Berikut parameter validasi yang harus dipertimbangkan dalam validasi

metode analisis dalam penetapan kadar suatu sediaan atau produk obat akan diuraikan

sebagai berikut.

1. Akurasi

Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil

analisis dengan kadar analit yang sebenarnya yang dinyatakan sebagai persen

perolehan kembali (recovery). Cara penentuan akurasi ada dua yaitu metode

simulasi (spiked-placebo recovery) dan metode penambahan baku (standard

addition method).


18/23

17

Dalam metode simulasi, sejumlah analit murni (senyawa pembanding

kimia CRM (Certified Reference Material) atau SRM (Standard Reference

Material) ditambahkan ke dalam campuran bahan pemawa sediaan farmasi

(plasebo) kemudian campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan

dengan kadar analit sebenarnya. Sedangkan pada metode penambahan baku,

sampel dianalisis kemudian sejumlah tertentu analit yang diperiksa

ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis kembali. Selisih kedua

hasil dibandingkan dengan kadar sebenarnya.

Persen perolehan kembali dapat ditentukan dengan cara membuat

sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit

dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit

yang diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang akan divalidasi.

Tetapi bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo karena matriksnya

tidak diketahui seperti obat-obatan paten, atau karena analitnya berupa suatu

senyawa endogen misalnya metabolit sekunder pada kultur kalus, maka dapat

dipakai metode adisi. Metode adisi dapat dilakukan dengan menambahkan

sejumlah analit dengan konsentrasi tertentu pada sampel yang diperiksa, laludianalisis dengan metode tersebut.

(Ravichandran et al, 2010)

2. Presisi

Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil

uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika

prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari

campuran yang homogen. Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku,

simpangan baku relatif (koefisien variasi) atau koefisien variasi. Keseksamaan

dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability),Intermediate Precision,

dan ketertiruan (reproducibility). Namun pada prosedur analisis penetapan


19/23

18

kadar suatu sediaan obat, ketertiruan telah dilakukan sehingga Intermediate

precisiontidak perlu dilakukan.

Keterulangan adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh

analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek.

Penentuan dari keterulangan adalah harus menggunakan minimal 9

penentuan dengan 3 konsentrasi yang berbeda yang masing-masing diulangi

sebanyak 3 kali. Selain itu keterulangan dapat dinilai dengan menggunakan

minimal 6 penentuan pada 100% konsentrasi analit (larutan uji).

Ketertiruan adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang

berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang

berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda

pula. Ketertiruan ini penting dalam proses standarisasi prosedur analisis

misalnya jika prosedur akan dimuat dalam farmakope.

Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku

relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat

fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel,

dan kondisi laboratorium. Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasimeningkat dengan menurunnya kadar analit yang dianalisis. Ditemukan

bahwa koefisien variasi meningkat seiring dengan menurunnya konsentrasi

analit. Pada kadar 1% atau lebih, standar deviasi relatif antara laboratorium

adalah sekitar 2,5% ada pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per

sejuta (ppm) RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per bilion (ppb) adalah

32%. Pada metode yang sangat kritis, secara umum diterima bahwa RSD

harus lebih dari 2%. Keseksamaan dapat dihitung dengan cara sebagai berikut.


3. Linearitas dan Rentang


20/23

19

Linearitas adalah kemampuan suatu metode analisis untuk memberikan

respon secara langsung dengan bantuan tranformasi matematik yang baik,

proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Sedangkan rentang

adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang ditunjukkan dan

dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat

diterima.

Umunya rentang yang digunakan untuk membuat seri standar berkisar

50 150% dari kadar analit (50%). Menurut ICH, rentang spesifik minimum

yang harus dipenuhi adalah :

Uji assay (uji kandungan) dari suatu senyawa obat atau produk obat :

umumnya minimal mencakup rentang 80 120% dari kadar analit.

Uji homogenitas, umumnya minimal mencakup rentang 70 130% dari

kadar analit, kecuali apabila rentang yang lebih besar dapat memberikan

hasil lebih baik (lebih cocok).

Untuk uji disolusi : 20% terhadap rentang spesifik.


4. Batas Deteksi dan Batas Kuantifikasi (LOD & LOQ)

Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam

sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi.

LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit di atas

atau di bawah nilai tertentu (Gandjar dan Rohman, 2013).

Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam

sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima

pada kondisi operasional metode yang digunakan. Sebagaimana LOD dan LOQ

juga diekpresikan sebagai konsentrasi (Gandjar dan Rohman, 2013).


21/23

20

Pada analisis instrument batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur

respon blangko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blanko.

Berikut adalah formula yang dapat digunakan untuk perhitungan

Keterangan :

Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)

k = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantitasi

Sb = simpangan baku respon analitik dari blangko

Sl = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadapkonsentrasi = slope (b pada persamaan garis y = a+bx)

(Harmita, 2004)

Batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis

regresi linier dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b

pada persamaan garis linier y = a + bx, sedangkan simpangan baku blanko sama

dengan simpangan baku residual (Sy/x.). Dibawah ini adalah rumus LOD dan

LOQ- Batas deteksi (Q)

Karena k = 3 atau 10 Simpangan baku (Sb) = Sy/x, maka

Q =

- Batas kuantitasi (Q)

Q =

(Harmita, 2004)

DAFTAR PUSTAKA


22/23

21

Agusta, Andria. 2000. Minyak Atsiri Tumbuhan Tropika Indonesia. Bandung : ITB

Press, hal 1-7.

Dean, J.R. 2009.Extraction Techniques in Analytical Sciences.United Kingdom: John

Wiley & Sons Inc.

Durovic, R. dan T. Dordevic. 2011. Modern Extraction Techniques for Pesticide

Residues Determination in Plant and Soil Samples. Strategies for Pesticides

Analysis, Prof. Margarita Stoytcheva (Ed.). Shanghai: Intech. Hal. 221-246

Fessenden, R.J dan Fessenden, J.S 1992. Kimia Organik, Jilid 2. Edisi Ketiga

Terjemahan Aloysius Hadyana Pudjaatmaka Ph.D. Jakarta : Erlangga.

Gandjar, I. G. dan A. Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka

Pelajar.

Hites. Ronald. 1999. Gas Chromatography Mass Spectrometry. School of Public and

Enviromental Affairs and Departement of Chemstry. Indiana Universitas.

Kang, J. H and Y. S. Chang. 2011. Organochlorine Pesticides in Human Serum,

Pesticides. Strategies for Pesticides Analysis, Prof. Margarita Stoytcheva

(Ed.). Shanghai: Intech. Hal. 215-240

Lino, E. M., C. B. F. Azzolini, D. S. V. Nunes, J. M. R. Silva dan M. I. N. D.Silveira. 1998. Methods for the Determination of Organochlorine Pesticide

Residues in Human Serum. Journal of Chromatography B, Vol. 716. Hal.

147-152

McMaster, M. C. 2005.LC/MS a Practical Users Guide. New Jersey: John Wiley

& Sons, Inc.

McNair H M dan J M. Miller. 1998. Basic Gas Chromatogaphy. Canada John Wiley

& Sons. Inc.

Moffat, C.A., M. D. Osselton, B. Widdop. 2005. Clarke's Analysis of Drugs and

Poisons. London :Pharmaceutical PressPublications division of the Royal

Pharmaceutical Society of Great Britain.

Parada, A. P., M. Colazzo, N. Besil, E. Dellacassa, V. Cesio, H. Heinzen dan A. R. F.

Alba. Pesticide Residues in Natural Products with Pharmaceutical Use:


23/23

22

Occurrence, Analytical Advances and Perspectives. Strategies for Pesticides


Raini, M. 2007. Toksikologi Pestisida dan Penanganan Akibat Keracunan Pestisida.

Media Litbang Kesehatan. Vol XVII (3).

Siuzdak, G. 1996.Mass Sepctrometry for Biotechnology. London: Academic Press.

Sastrohamidjojo, H. 1985. Kromatografi. Edisi I. Cetakan I. Yogyakarta : Liberty.

an, G. H. dan M. K. Chai. 2011. Sample Preparation in the Analysis of Pesticides

Residue in Food by Chromatographic Techniques. Strategies for Pesticides


Vogeser, M. and Christoph, S. 2008. A Decade of HPLC-MS/MS in The Routine

Clinical Laboratory-Goals for futher Development. Clinical Biochemistry.

Vol. 41.

tahap 2.docx

Documents