p._hlion don Pcng.mbongon Aphkasr lsotop dan RadiMi. 1999

STUDI REAKSI SILANG ANTIBODI TOKSIN BOTULINUM TIPE AYANG DRNAKTIV ASI DENGAN IRADIASI GAMMA

M. Indarwatmi, H.M. Soewarsono, daD Adria P.M. Hasibuan

Pusat Aplikasi lsotop Uan Radiasi, HAT AN

ABSTRAK

STUDI REAKSI SILANG ANTmODI TOKSIN BOTUUNUM TIPE A YANG DIINAKTIV ASIDENGAN IRADIASI GAMMA. Alltibodi poliklonal tidak hanya berikatan dengan antigen spesifiknya, tempimungkin pula berikatan dengaJ1 sekelompok antigen yang strul..1\U" kimianya seru~ dengan antigen spesifikpembentuk antibodi tersebut. Untuk pengujian reaksi silang antibodi toksin botulinum tipe A yang diproduksi padakelinci dat1 mencit yang diimunisasi toksin botulinum tipe A yang diinaktivasi dengan imdiasi gamma dosis 20 kGyterl1adap toksin botulinwn tipe A aktif, telah dilakukan penelitian reaksi antigen-antibodi secara kualitatif denganmetode Irnunodifusi ~da lempeng agar Ouchter/olry. Hasil talnpak pada lempeng imunodifusi presipitat ikatan Ab(T. inak.) dan Ab (T. inak-BSA) dengan wltigen spesifiknya masing-masing dan toksin botulinum tipe A aktif.Antibodi (T. inak-BSA) aviditasnya lebih tinggi dibandingkwi dengan AB (T. inak.) dat1 reaksi silang terjadi antaraantibodi toksin botulinum tipe A yang diproduksl dengan antigen toksin aktifterhadap toksin botulinum tipe A aktif,dan koplu1g antiget1 toksin inaktif (T. inak.) kepada BSA dapat met1ingkatkan antigenesitas antigen toksin inaktifhasil iradiasi gaJruna dosis 20 kGy.

ABSTRACT

mE CROSS-REACTION STUDY OF TYPE A BOTULINUM TOXIN ANTIBODYINACTIVATED BY GAMMA IRRADIATION. The antibodies (polyclonal) do react not only to the spesifictantigen, but also they are possible to react to a group of antigen that has similarity in chemical structure to thespeSitict antigen wich is the 81ltibody produced with. To study the cross-reaction of antibody that was produced bymultiple ilrunwuzation of rabbit and 11!!ce using inactivated type A botululum toxin antigen by ganuna imdiationwith the dose of20 kGY have been reacted the antibodies to spesific mId nonspesific antigens using hnmunodiffusionmethod on auchter/OIlY agar plates. The results showed the precipitation bound of Ab (T. inak) and Ab (T. inak-BSA) to spesitic antigen mId to active toxin either. The conclusion of this experiment was the antibody producedusing the inactivated type A botulinum toxin by gamma irradiation with the dose of 20 kGy (coupling and notcoupling to BSA) to do cross-reaction to active type A botulinwn toxin, and coupling the inactive toxin to BSA canincrease the antigenesity of irrndiated toxin

PENDAHULUAN bentuk imunoglobulin menyerupai huruf Y, rantai Lsebagai tangkai mempunyai dua cabang rantai H yangmasing-masing ujungnya terbuka sebagai tempatpengikatan (binding site) terltadap antigen spesifiknya,sensitivitas (aviditas) antibodi ini ditentukaJl oleh susunankirnia binding site (3,4).Salall salu penentu spesifisitas aJuibodi ialall kemumianantigen pembentuknya. Untuk mendapatkan antigen yangmurni sangat sukar, diperlukan bahan atau sediaan yangbanyak, me lode separasi dan purifikasi yang seringdigunakan ialah krornatografi kolom-sepbadex secarnbertingkat. Suhadi (5) telah me1akukan pemumian toksinClostridium botulinum tipe B basil isolasi melaluikrornatografi kolom Sepbadex G.50 dan Sepbadex G.200,uji elektroforesis fraksi protein toksik, dan uji spesifisitasantigen (protein toksik) dengan metode imunodifusi.Kesimpulan penelitian ini ialah telah diperoleh sejumlahkecil (nukrogram) toksin botulinwn tipc B yang dapatberikatan-'rlengan antiloksin B. tetapi pada penelitian initidak dilakukan uji reaksi silang dengan tipe antitoksin

lairulya.Pada saat ini untuk mengatasi terjadinya reaksi

silaJlg digunakan antibodi monoklonal yang dibuat denganmetode lubridoma (6), yaitu hibridisasi (fusi) Ijrnfositspesifik mencit balb/C yang diimunisasi antigen yang

Reaksi silang mWlgkin akan terjadi aIltarnantibodi (poliklonal) yang diproduksi dari antigen yangtidak munu dengaJl beberapa antigen yang berbeda. Pactaantigen bemlolekul relatif besar terdapat berbagaidetenninaIl atau disebut juga detennilk1n aIltigenik yaitusekelornpok kecil asam amino atau residu karbohidratyang rnenempel di pennukaan antigen berpotensi sebagaipenentu spesifisitas dan aviditas ant ibodi , dan ternpatberikatan antibodi dengan antigen spesifiknya. Suatuantisern (poliklonal) tidak hanya rnengandWlg antiboditerhadap bebernpa detenninan, juga antibodi yangmernpWlyai struktur dan aviditas berbeda, selungga akanterjadi persaingan Wltuk berikataIl dengan setiap individudetenninan (I).

BerdasarkaIl stnlkulr dan susunan kilnianya.antibodi adalah sekelompok protein, disebut jugairnWloglobulin (Ig) terdiri alas 5 kelas yaitu Ig G, 19 M, IgA, Ig D, dan Ig E. Semua kerns imWloglobulin mempWlyaistruktur dasar saJll3. terbentuk dari sepasallg rantaipolipeptida palljang (lleavy chains = H-cllains) tersusun

dari 446 asaIn aInino yang masing-lnasing rantainyaberhubWlgan dengan sepasang rantai pendek (light cllains= L-cI1ains) yang tersusun dari 214 asaJn alnino. Jadi

367

Pene/i/ian don PengembanganAp/ikasi ls%p dan Radiasi, /999

terakhir dikurnpulkan untuk dianalisis mengenai ikatanantibodi dengan antigen spesifiknya dan reaksi silangterhadap toksin botulinwn tipe A aktif, menggunakanmetode imunodifusi di alas lempeng agar ouchterlony.

lmunisasi pada lempeng agar ouchterlony (5).Di alas lempeng agarose (0,8%) dengan ketebalan :t 1 mmdibuat surnuran (ID=2 mm), surnuran di tengah diisi 5 IJ.Iantigen toksin, clan 5 buah surnuran di sekitarnya masing-masing diisi antisera (NS) toksin yang akan diujispesifitasnya clan reaksi silangnya (Skema Garnbar 1).

kurang mumi dengan sel-sel mieloma mencit spesies yangsalua. Hibrid-llibrid yang terbentuk dalron kultur jaringandiseleksi (kloning) Ulltuk mendapatkan klon terpilih yangmemproduksi antibodi monoklonal yang hanya dapatberikatan dengan antigen spesifiknya. UmuDUlya antibodimonoklonal memiliki sensitivitas rendah. makin murniantibodi monoklonal maka sensitivitasnya akan makinrendah.Pada penelitian ini digunakan antisera kelinci dan mencityang telah diimunisasi dengan toksin botulinum tipe A(tanpa pemurnian, dengan pengenceran 10.2) yangdiinaktivasi dengan iradiasi gamma dosis 20 kGy untukdiuji reaksi silangnya dengan toksin botulinum tipe A yangaktif (toksik).

BAHAN DAN METODE

Untuk pembuatan antibodi (poliklonal) toksinbotulinum tipe A diperlukan bal1an-ballan sebagai berikut :

Produksi toksin botulinum tipe A. Stok strainClostridimn botulinum tipe A (A-1323 isolasi lokal)diinokulasi untuk pembiakan dalam media Coocked Meat(CM). Biakan C. botulinum A dipindallkan ke dalammedia TPGYT (tripton, pepton, glukose, yeast extract, daDthioglycolat) untuk memproduksi toksin. Toksin diisolasidan disimpan sebagai stok. Toksisitas toksin iill diuji padamencit, dipilih tokSUl dengan pengenceran terendah (10"1atau kadar protein tertinggi setelah pengenceran.

---~Ketemngan

Gambar Skema imunodifusi lempeng ouchterlony.

Pembuatan antigen toksin. Toksin pengenceran10-2 diinaktivasi dengan iradiasi gamma dosis 20 kGy,maka akan diperoleh toksin inaktif sebagai stok antigen.Mengingat bahwa toksin inaktif ini merupakan fragmen-fragIuen protein toksin aktif yang diradiasi maka be ratmolekulnya menunm sehingga antigenesitasnya punmenunm. Untuk meningkatkan antigenesitas toksin radiasiini menjadi imunogen, dilakukan kon~gasi (coupling)toksin illaktif (T. illak.) kepada protein albumin bovine(BSA) dengall metode EDAC [1-Etilyl-3(3-DimetllylAminopropyl Carbodiimide») (SigIlli'!) atau Morpho CD![1-cyclohexyl-3(2-morpholinoethyl)] carbodiimide metllo-p-toluene sulfonate (Aldrich) lnaka akan terbentukimunogen T. inak-BSA. Separasi T.inak-BSA daTi ballaDdaD sisa-sisa reagen yang tidak terpakai digw1akankrolnatografi kolom sephadex G.200, dan dianalisis dalarukantong selofan yang direndalu dalanl air mengalir.Prinsip dasar kopling metode Carbodiimide ialah denganoksidasi carbodiimide akan terjadi pengikatan BSA pactagugus reaktif protein antigen (- NH2 atau -COOH) menjadiR-CONH-BSA.

Prosedur Imunodifusi. Sumuran lempengagarose setelah diisi antigen dan antisera diinkubasiselama 48 jam pada suhu 4°C, setelah inkubasi selesaikemudian lempeng agar direndam berturut-turnt dalamlarutan garam fisiologis (NaCl 0,85%) dan larutan 0,1%Na-azide masing-masing selama 12 jaIn. Lempeng agardicuci dengan air leding, dikeringkan dalam oven padasubu 37°40°C selaIna tiga jam. Lempeng agar kering inidirendaIn dalam larutan 5% zat WarDa amidoblack lOB,dicuci, maka akan tampak presipitat ikatan Ag.Ab diantara sumuran antigen dan antisera.

HASILDANPEMBAHASAN

Hasil pengukuran dengan spektrofotometerSillMADZU-201 dengan kerapatan optik 280 om terhadapfraksi-fraksi toksin inaktif dan konyugat toksin inaktifkepada BSA setelah separasi melalui Kromatogrnfi kolomSephadex G-25 dilukiskan dengan kurva yang ditunjukkanpada gambar 2. Puncak pertama terdiri atas fraksi-fraksiprotein antigen yang bobot molekulnya besar tampak lebihtinggi dari fraksi-fraksi berikutnya yang puncak-puncaknya jauh lebih rendah yang merupakan pengotorprotein. Fraksi-fraksi dengan kerapatan optik yang lebihtinggi (fraksi konyugat No. 2-5) menunjukkan bahwaprotein toksin inaktif teiall terikat protein BSA sehinggabobot molekulnya menjadi lebih besar danantigenesitasnya teiall meningkat, dibandingkan denganprotein toksin inaktif yang tidak dikonyugasi. Pada proseskonyugasi ini, pengikatan BSA hanya terjadi pada gugus

Produksi antibodi (poliklonal). Enmn ekorkelinci, tiga ekor diimuniSc'\si dengan T inak dan tiga ekorlainnya diimunisasi T. inak-BSA dengan dosis 0,5mg/ekor, dan 10 ekor mencit, masing-masing kelompok 5ekor diimunisasi T.inak. daD 5 ekor laimlya diimunisasiT.inak-BSA dengan dosis 0,2 mg/ekor. Suntikall boosterdiberikan setiap 21 11ari (pad.'\ kelinci) dan 10 lwi (padarnencit) dilakukan 4 kaii booster. Penyuntikan iInunisasidan booster secara subkutan (kelinci) dan intraperitoneal(mencit). Serum kelillci d.'Ul mencit setelah booster

368

Ag: AntigenA/S:AntiseraI. Lempeng agarose, tebaInya lnun2. Lubang agar, diameter 2nun3. Gelas objek

Pene/itian dan Pengembangan Ap/ikasi Isotop don Radiasi, /999

reaktif protein toksin sehingga dengal1 krol1mtografi kolom

bagian pengotor dapat dipisal1kan (pemurnian proteintoksin),

Analisis imunodifusi antisera (poliklonal) mencitterhadap antigen toksin botulinum inaktif (f .inak. danT.inak-BSA) ditampilkan pacta Gambar 4.

Serum mencit

If;;'~..~

A

AQ: T,al.1ifC

A£. T.inak-BSA

Keterangan

e"'" ~ In -;""'\I ., d.,

I, AlS T .inak-BSA2, AlS T.inakK, Serum nonnal

Tabel 2. Pembacaan nilai kualitatif Gambar 4 secara visual

Gambar 2. Fraksi-fmksi toksin inaktif dan konyugattoksin illaktif kepada BSA setelah separasimelalui Kromatografi kolom Sephadex G-25diukur dengan Spektrofotometer pada 280 run.

AntigenAntibodi T.inak-

BSA+++

T .aktif. T.inaktif

T.lllak.-BSA (I)

T.inak (2)

K=Serum Nonnal (3)

++++++

Hasil analisis reaksi aIltisera (poliklonal) kelincidengan antigen spesifik (T. inak. dan T. inak-BSA) dantoksin botulinum tipe A tampak presipitat ikatan komplekAg.Ab pada lempeng agar berupa strip llitam sepertidiperlilmtkan pada ganlbar 3.

Antisera kelinci

5Ag'ii:1ak

CAg Trnak-BSA

ft.~.;: :a"~lt

Pada lempeng agarose lmnya tampak jelaspresipitat ikatan antibodi yang dibuat dengan imunogenT.inaktif-BSA, hal ini membuktikan bahwa respon imunmencit terlmdap antigen T inaktif yang diimunisasikankurnng sensitif sehingga antibodinya tidak rnampuberikat.1fi dengan antigen T.inaktif, T.inaktif-BSA, danT. aktif pada tabel 1 tampak bahwa antibodi yangdiproduksi padc1 kelinci baik dengan antigen T.inaktifmaupun T.inaktif-BSA selalu berikatan dengan ketigajenis antigen, 11al ini membuktikan ballwa respon imunkelinci lebih sensitif sehingga dapat memproduksi antibodidengan aviditas yang berbeda.

Antibodi yang diproduksi dengan antigen Toksininaktif baik pada mencit (T.inaktif-BSA) maupun padakelinci dc1pat berikatan silang dengan toksin aktif, jadireagen antibodi ill dapat digunakan untuk mendeteksitoksin botulinum tipe A yang terdapat pada rnakanan dandarah pasien yang terkontaminasl toksin botulinum tipe A.

PembuataIl antisera pada mencit bertujuan untukmendapatkan liJnfosit speisifik sebagai donor yang akandihibridisasi dengan sel-sel mieloma dalam rangkapembuatan antibodi monoklonal.

1&2, AlS T. inak-BSA3, AlS T.il13kK, Serum nonnal

Keteratlgatl:

Gambar 3. Presipitat ikatan Ab (NS kelinci) dengan Agspesifik daD toksin botulinwn tipe A aktifpada lempeng agarose.

Tabell. Pembacaan ltilai kualitatif garnbar 3 secara ViSllai

AIltigen KESIMPULANAtuibodi T.Ulak-BSA+++

T.aktif T.inaktifAntisera (polik1onaI) yang dapat mengikat toksin

botulinwn tipe A yang toksik tidak perlu dibuat dengantoksin botulinum tipe A yang dilemal1kan (toksoid), tetapidapat dibuat dengaI1 toksin botulinum tipe A yangtoksisitasnya dilulaI1gkan dengan iradiasi gamma dosis 20kGy (toksin diencerkaI1 10-1. Antisera yang dibuat dengan

+++ +++T.Ulak.-BSA (1&2)

T.inak (3)

K =Seruln Nomlal

+++ +++ +++

369

Pene/ilian dan Pengembangan Ap/ikasi J.,otop dan Radiasi, /999

toksin botulinum tipe A non-toksik atau inaktif dapatberaksi silang dengan toksin botulinum tipe A toksik(aktif) yang mungkin terdapat pada ballaD makanan ataudarah pasien yang terkontalninasi toksin botulinum tipe A.

Toksin botulinwn tipe A yang diinaktivasidengan iradiasi gamlna dosis 20 kGy (pengenceran 10-2)adalall benar antigenisitasnya rendall, tetapiantigenesitasnya yang rendall ini dapat ditingkatkandengan cara dikopling kepada protein albulnin yang bobotmolekulnya besar, misalnya albumin bovin (BSA) ataumanusia (HSA) dengan teknik EDAC atau morpho CDI.Separasi llasil kopling dengan teknik kromatografi kolomSephadex G-25 dismnping untuk separasi toksin inaktifyang terkonyugat BSA, tetapi mungkin pula digunakanuntuk pemurnian toksin kasar.

3. THORELL, J.I. AND LARSON, S.M.Radioimmunoassay and Related Techniques(Methodology and Clinical Application), the CV.Mosby Company, Saint Louis (1978) p.ll, 258.

4. EDWARD, R., Immunoassay, An Introduction,William Henemann, Medical Books, London(1985)55.

5. SUHADI, F., Aspek Clostridium botulinum padaPengawetan Ikan dengan Iradiasi danPengembangan metode Penentuan Toksin Secara invitro, Desertasi fakultas Pascasarjana, universitasIndonesia, jakarta (1990) p. 95.

6. GODING, J. W., Monoclonal Antibody: Principle andPractice, 2 nd. Ed. Acad. Press (1986) .

UCAPAN TERIMA KASm7. Komunikasi pribadi dengan Dr. J. Kosowics, Expert

lAEA, Jakarta (1989).Ucapan terillla kasih ini terntama ditujukankepada Sdr. Arief Djmlakmn yang tela11 menyediakan stoktoksin botulinmn tipe A, preparasi toksin' untukdiinaktivasi dengan iradiasi gm11l11a. Terinta kasih ilU kmuisampaikan pula kepada selurnh teknisi yang terlibat daJmupenelitian ini.

80 ROI1T, 10, Essensial Immunology, Blackwell ScioPubl., Oxford. london Edinbrgho Melbourne (1973)790

9. SKULBERG, A., Toxin Produced by C. botulinum andTlleir Radiosensitivity, IAEA-PL-334/3, IAEA,Vielma (1971) 19DAFTARPUSTAKA

CAMBELL, A.M., Monoclonal Antibody Teclmology(laboratory techniques in Biochemistry andmolecular biology), Elsevier, Amsterdam. newYork. Oxford (1987) p.4.101.

10. SKALKA, M.and ANTONY, F., Effect on theBiological Properties of Proteins, lAEA-PL-344/1,lAEA, Vienna (1971) I.

2. BHANDARKHAN, S.D. mId PILLAI, M.R.A.,RadioimmWloassay a laboratory Manual, BARC.,Bombay (1982) 8.

DISKUSI

IKA ROOSTIKA 2. Jadi untuk memproduksi Ab-toksin botulinum A tidakperlu menggunakan toksin butolinum A aktif dan tidakmungkin karena hewan coba akan mati.

3. Peracunan toksin botulinum meskipun sedikit (Jig)-akan menyebabkan kematian.

MARIALINA

1. Sara masih belum jelas tentang lnaksud dari reaksisilang antara antibodi toksin botulinum tipe A dengantoksin botulinum tipe A ? Mohon dijelaskan.

2. Apa manfaat dari diketahuinya reaksi silang antaraantibodi toksin botulinwn tipe A dengan toksinbotulinwn tipe A ?

3. Toksin botulinum tipe A merupakaIl penyebabpenyakit apa ? Seberapa besar arti pentingnya ?

M. INDARWATMI

Reaksi Sil3l1g ditujukan terhadap Ab yang diproduksitoksin botulinum A- illaktif terhadap toksin aktif.

1. Apakah tujuan penelitian ini untuk membuat kit, jikademikian aplikasinya diterapkan untuk produk apa ?

2. Oalam penelitian Anda, toksin botulinum type A diisolasi dari kultur Clostridium botulinum. Apakahdilakukan uji wltuk mengetahui kemumian basilisolasi ? Bagaimana caranya ?

3. Stand.1f apakah yang digunakan untuk uji tersebut ?Bagaintana llasilnya di bandingkan dengan toksin basilisolasi?

370

Penelilian don Pengembangan Aplikasi Isotop dan Radiasi. 1999

M. INDARWATMI ZUBAIDAH IRAWATI

Kami merniliki sarnpel yang terbuat dari ikanyang di proses sebelumnya. Mengingat produk perikananrowan untuk C. botulinum apabila disimpan dalam kondisivakum. Apakall Anda bersedia membantu kami mengujiada/tidaknya C. botulinum di dalam ballaD tersebut ?Kemungkinan pertanyaan saya ini menyimpang dari isimakatah Anda.

M. INDARWATMI

Pengujiall ada/tidaknya C. Botulinum dapatdilakukan di lab. Biologi PAIR-BAT AN.

I. Tujuan penelitiaI1 : Untuk membuat reagen atau kituntltk mendeteksi in vitro secara cepat toksinbotulinwll. Aplikasinya diterapkaI1 pt1da produk ik.1llyang diawetkan.

2. Kami menggw1akaI1 toksin kasar yang diencerkan 10-1daD diiradiasi dengan dosis 20 kGy. Kami tidakmeiakukaI1 lyi kemumian Imsil isolasi toksu]. karenauntltk memurnikan diperlukan pengujian yang pat1jang.Tetapi dengan konyugasi (coupling) dengan BSA dandilakUkan dalaIll krolnatografi kolom splmdex, dapatmemumikan toksin C. botulinum karelm dapatdipisaltkan toksin inaktif-BSA dengan pengotorpengotomya. Untuk pembuatan kitlreagen lebih baikdigunakan toksin yang mumi (dapat dibeli) daripadamemumikan toksin sendiri.

3. Kami tidak/belum membandingkan antara toksinisolasi dengan toksin munu.

371