LATAR BELAKANG

Bioteknologi adalah penggunaan biokimia, mikrobiologi, dan rekayasa

genetika secara terpadu, untuk menghasilkan barang atau lainnya bagi

kepentingan manusia. Biokimia mempelajari struktur kimiawi organisme.

Rekayasa genetika adalah aplikasi genetik dengan mentransplantasi gen dari

satu organisme ke organisme lain. Ciri utama bioteknologi adalah :1) adanya

benda biologi berupa mikroba, tumbuhan atau hewan; 2) adanya

pendayagunaan secara teknologi dan industri; dan 3) produk yang dihasilkan

adalah hasil ekstraksi dan pemurnian (Octaviani, 2012).

Bioteknologi perikanan adalah bioteknologi yang ditekankan khusus pada

bidang perikanan. Penerapan bioteknologi dalam bidang perikanan sangat luas,

mulai dari rekayasa media budidaya, ikan, hingga pascapanen hasil perikanan.

Pemanfaatan mikroba telah terbukti mampu mempertahankan kualitas media

budidaya sehingga aman untuk digunakan sebagai media budidaya ikan.

Bioteknologi telah menciptakan ikan berkarakter genetis khas yang dihasilkan

melalui rekayasa gen. Melalui rekayasa gen, dapat diciptakan ikan yang tumbuh

cepat, warnanya menarik, dagingnya tebal, tahan penyakit dan sebagainya

(Octaviani, 2012).

Teknologi ikan transgenik mampu menghasilkan benih ikan unggul, yaitu

melalui perbaikan mutu genetik ikan yang akan dipelihara atau dibudidayakan. 

Perbaikan mutugenetik ini bermanfaat untuk  meningkatkan produksi

dan produktivitas ikan. Keunggulan ikan hasil rekayasa ini antara lain

pertumbuhan cepat, tahan terhadap serangan penyakit, dan tahan terhadap

lingkungan yang cukup ekstrem.

Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama,

dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh

pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini

memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan

jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.

Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan

melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu.

tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan

diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai

ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk

menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan

molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan

analisis DNA rekombinan.

Melalui teknologi ini, mampu mendukung peningkatan hasil perikanan

yang sangat baik dan dengan waktu yang cepat. Teknologi ini juga dapat

memudahkan pihak-pihak tertentu khususnya di bidang perikanan untuk

memproduksi hasil perikanan yang berkualitas.

TUJUAN DAN MANFAAT

Praktek Kerja Lapang (PKL) ini bertujuan untuk melihat dan

melaksanakan secara langsung proses pelaksanaan teknologi DNA rekombinan

pada ikan, dengan cara terlibat langsung dalam kegiatan pelaksanaannya di

Balai Riset Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Payau (BRPPBAP).

Manfaat dari Praktek Kerja Lapang (PKL) ini adalah sebagai bahan

informasi dan masukan bagi mahasiswa, masyarakat, serta para pelaku usaha

budidaya perikanan dalam melakukan penanganan dan pengontrolan dalam

peningkatan hasil budidayanya.

RENCANA KEGIATAN

Rencana kegiatan yang kan dilkukan di lokasi Praktek Kerja Lapang adalah

sebagai berikut:

1. Isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon

Alat yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA larva udang yaitu mesin

sentrifugasi, tabung sentrifugasi, pipet mikro, tips, water bath, timer, vorteks, dan

pestle. Bahan yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA larva udang yaitu

larva udang Stomatopoda sp, Nuclei Lysis Solution, RNAse, Protein Precipitation

Solution, isopropanol, rehydration solution, 1,5 ml tube, dan sarung tangan

(gloves).

Cara kerja praktikum isolasi DNA larva udang dibagi menjadi beberapa

tahap yaitu persiapan alat dan bahan, persiapan jaringan, lisis dan presipitasi

protein, serta presipitasi dan rehidrasi DNA.

Pertama, persiapan alat dan bahan. Alat yang akan digunakan disterilisasi

menggunakan alkohol 70%. Alat tersebut meliputi mikropipet, meja kerja, dan

gloves. Reagen – reagen dan bahan lain yang dibutuhkan disiapkan dan

diletakkan di tempat yang terjangkau.

Kedua, persiapan jaringan. Larva udang yang sudah disiapkan diambil

dan dibuang pengawetnya. Selanjutnya, dilakukan penambahan 200 μl Nuclei

Lysis Solution pada larva udang tersebut. Larva tersebut kemudian digerus

hingga halus dengan menggunakan pesrle. Setelah halus, ditambahkan 400 μl

NLS. Sampel diinkubasi pada suhu 65 °C selama 30 menit.

Ketiga, lisis dan presipitasi protein. Setelah 30 menit, 3 μl RNAse Solution

ditambahkan ke dalam sampel. Selanjutnya dilakukan vortexing pada sampel

agar RNAse tercampur. Prosedur selanjutnya yaitu inkubasi sampel pada 37 °C

selama 30 menit. Setelah 30 menit, 200 μl Protein Precipitation Soluton

ditambahkan ke dalam sampel. Tahap selanjutnya.yaitu dilakukan vortexing agar

PPS yang ditambahkan dapat tercampur baik dalam sampel. Sampel tersebut

didinginkan pada es selama lima menit. Selanjutnya, agar terjadi endapan

dilakukan sentrifuge pada sampel selama empat menit dengan kecepatan 13.000

rpm.

Keempat, presipitasi dan rehidrasi DNA. Supernatant yang terbentuk

dipindahkan dalam tube yang baru dan ditambahkan isopropanol. Isopropanol

dan supernatant dicampur dengan cara inverting. Setelah tercampur, dilakukan

sentrifugasi pada sampel selama satu menit dengan kecepatan 13. 000 rpm.

Supernatant yang terbentuk dibuang. 600 μl etanol 70% ditambahkan ke dalam

sampel dan dilakukan sentrifugasi ulang pada sampel. Pellet yang terbentuk

dikeringkan selama sepuluh menit. 20 μl rehydrat ion solution ditambahkan ke

dalam sampel. Selanjutnya, dilakukan rehidrasi DNA pada suhu 65 0C selama

satu jam. Tahap terakhir yaitu sampel disimpan dalam freezer.

2. Pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai

ukuran

Enzim retriksi atau disebut jjuga enzim endonuklease adalah enzim yang

memotong molekul DNA. Enzim retriksi memotong DNA pada rangkaian gula-

fosfat tanpa merusak pasang basa. Enzim retriksi endonuklease mengenali

urutan pasangan basa yang spesifik atau dengan kata lain memotong DNA pada

posisi diantara atau diluar sekuen yang dikenalinya.

Metode kerja dari pemotongan DNA adalah:

a. Enzim EcoRI dimasukkan ke dalam cup 0,5 µl

b. +buffer enzim 2 µl

c. Ditambahkan ddH20 15 µl

d. Tambahkan DNA template 2,5 µl

e. Diinkubasi pada suhu 37oC over night

3. Isolasi DNA vector

Isolasi DNA Vektor ada 3 tahap yaitu sebagai berikut:

a. Isolasi dan pemurnian plasmid DNA

1. Pertama, disiapkan larutan satu, dua, dan tiga. Larutan satu dibuat dari

campuran tris-HCl 25 mM pH 7.5, EDTA 10 mM, dan sukrosa 15%.

Larutan kedua dibuat dari campuran NaOH 0.2 M dan SDS 1%. Larutan

NaOH 0.2 M dibuat dengan dilarutkannya 0.4 gram kristal  NaOH dalam

1000 mL akuades. Sedangkan larutan SDS 1% dibuat sebanyak 50 mL

dengan cara 0.5 gram SDS ditimbang dan dilarutkan dalam 50 mL

akuades. Larutan tiga dibuat dari Na-asetat 3 M pH 4.6. Langkah kedua

yaitu bakteri dibiakkan dalam medium LB. Medium LB ini dibuat dari

campuran 0.5 gram yeast extract, 1 gram tripton, 0.5 gram NaCl, dan

ampicilin sebagai antibiotik. Konsentrasi akhir medium LB dijadikan 50

µg/mL.

2. Langkah selanjutnya, biakan bakteri yang telah disiapkan diambil dan

dipindahkan ke dua tabung Eppendorf, masing-masing sebanyak 1.5 mL.

Tabung kemudian disentrifus pada kecepatan 8000 rpm selama tiga

menit. Supernatan yang terbentuk kemudian dibuang dan ke dalam

masing-masing tabung ditambahkan 100 µL larutan satu. Tabung

kemudian divorteks lalu disimpan dalam es selama lima menit. Berikutnya

200 µL larutan dua ditambahkan pada masing-masing tabung dan tabung

dicampur dengan cara dibolak-balik. Tabung kembali disimpan dalam es

selama lima menit. Selanjutnya, ditambahkan 150 µL larutan tiga ke

dalam masing-masing tabung dan disimpan lagi dalam es selama lima

menit. Langkah berikutnya adalah sentrifugasi tabung dengan kecepatan

8000 rpm selama 10 menit pada suhu 40C. Setelah terpisah antara

supernatan dan  pelet, supernatan dipindahkan ke tabung baru.

3. Larutan fenol/kloroform sebanyak 300 µL dimasukkan ke tabung baru tadi

dan divorteks kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi selama lima

menit.. Supernatan diambil dan dipindahkan ke kuvet baru kemudian

ditambah dengan 1 mL etanol absolut. Kuvet selanjutnya divorteks dan

didiamkan dalam suhu ruang selama 5 menit. Selanjutnya kuvet kembali

divorteks dan supernatannya dibuang. Ke dalam pelet ditambahkan 1 mL

etanol 70% dan divorteks lagi selama 1 menit dan disentrifus. Terakhir,

pelet dikeringkan dan ditambah 30 µL dH2O lalu disimpan dalam lemari

es.

b. Pemotongan DNA plasmid dengan enzim restriksi.

Sebanyak 5-10 mg DNA plasmid, 5 mL buffer enzim (10x), 1 mL

enzim restriksi dan dH2O steril dimasukkan ke dalam erlenmeyer 50 mL

hingga volume larutan mencapai 50 m lalu dimasukkan ke dalam es.

Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 370 C selama 1 jam. Aktivitas

enzim dihentikan dengan memanaskan pada suhu 650-700C.

c. Pembuatan sel kompeten dan transformasi.

Media LB sejumlah 150 mL dibuat dari campuran tripton, NaCl, dan

yeast extract. Bakteri dibiakkan di dalam 100 mL media LB. Dua buah

tabung reaksi bersih disiapkan dan diisi dengan masing-masing 10 mL

media LB. Ke dalam 10 mL media LB dimasukkan  bakteri yang telah

dibiakkan selama satu hari. Tabung kemudian diinkubasi pada suhu 37°C

selama 90 menit. Selanjutnya tabung disentrifus pada kecepatan 8000

RPM, suhu 40C, selama dua menit. Sebelumnya tabung sentrifus

ditimbang dan digunakan tabung berisi air sebagai penyeimbang saat

sentrifugasi. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan ke dalam pelet

ditambahkan 5 mL CaCl2. Tabung kembali disentrifugasi. Supernatan

kembali dibuang dan ditambahkan 5 mL CaCl2 75 mM. Tabung disimpan

dalam es selama 30 menit. Selanjutnya tabung disentrifus, supernatan

dibuang dan ditambahkan 1 mL CaCl2 75 mM. Terakhir, diambil 100 µL

dan disimpan di lemari pendingin untuk transformasi. DNA plasmid

dengan konsentrasi 0.4 µg sebanyak 2 µL dimasukkan ke dalam dua

tabung yang berisi masing-masing 100 µL. Sel kompeten Tabung

disimpan dalam es selama 30 menit. Langkah berikutnya, diberi

perlakuan kejut  panas 420C selama 45 detik. Isi tabung lalu dicampur ke

dalam Erlenmeyer yang  berisi 400 µL agar LB dan diinkubasi selama 30

menit. Agar LB diambil 150 µL dan dituang dalam cawan petri. Cawan

kemudian diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37°C. Pengamatan

dilakukan dengan penghitungan jumlah koloni yang terbentuk.

DAFTAR PUSTAKA

Ayu, R.D. 2012. GENETIKA: DNA Rekombinan. Online pada http://www.blogspot.com. Diakses pada Senin, 08 September 2015, pukul 14:27 Wita. Makassar.

Lyrawati, D. 2004. DNA recombination and genetic techniques, transmission of human disease and computer resources for the clinical and molecular geneticist (transl.Indonesian). Agric. Fac. Unibraw Publ., Indonesia

Octaviani, M. 2012. Bioteknologi Dalam Bidang Budidaya Perikanan dan Perkembangan. online pada https://marthariaoctaviani.wordpress. com. Diakses pada 08 April 2015 pukul 21:25 Wita. Makassar.

SINOPSISPRAKTEK KERJA LAPANG

BIOTEKNOLOGI DNA REKOMBINAN PADA BUDIDAYA UDANG

NAMA : Ika Rahma Dewi STAMBUK      : L 221 12 276

PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRANJURUSAN PERIKANAN

FAKULTAS ILMU KELAUTAN DAN PERIKANANUNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR2015