plagiat merupakan tindakan tidak terpuji sitotoksisitas fraksi protein … · sitotoksisitas fraksi...

SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) FP30, FP40, FP50, dan FP60 TERHADAP

KULTUR SEL MYELOMA

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Anastasia Yuli Ekasaptawati

NIM : 038114016

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2007

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) FP30, FP40, FP50, dan FP60 TERHADAP

KULTUR SEL MYELOMA

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Anastasia Yuli Ekasaptawati

NIM : 038114016

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2007

ii


iiiPERSETUJUAN PEMBIMBING


iv iv


HALAMAN PERSEMBAHAN

“Hal-hal yang benar-benar kau yakini, pasti akan selalu terjadi;

dan keyakinan akan suatu hal, akan menyebabkannya terjadi” -

Frank Lloyd Wright

“You don't have to be afraid of change. You dont have to worry

about what's been taken away. Just look to see what's been added”

- Jackie Greer

Ia membuat segala sesuatu indah pada waktunya, bahkan Ia

memberikan kekekalan dalam hati mereka. Tetapi manusia tidak

dapat menyelami pekerjaan yang dilakukan Allah dari awal sampai

akhir - Pengkhotbah 3:11

Dedicated with love to:

My King who died for me, JESUS

My heroes who fight for me, Mum and Dad

My sisters who cheer up my life, Tia and Tyas

My beloved who always there for me….

v


vi

PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa sehingga atas berkat rahmat

dan anugerahnya penulis bisa menyelesaikan skripsinya yang berjudul

“Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP30,

FP40, FP50,dan FP60 terhadap Kultur Sel Myeloma”.

Selesainya skripsi ini tidak lepas dari bantuan banyak pihak untuk itu

penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata

Dharma, Yogyakarta.

2. Drs. A. Yuswanto, S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah

banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala masukan serta sarannya

dalam penyusunan skripsi ini.

3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji atas segala arahan, kritik,

saran dan waktunya.

4. dr. Luciana Kuswibawati, M.Kes., selaku dosen penguji atas segala arahan,

kritik, saran dan waktunya.

5. Mbak Yuli, Pak Rajiman dan segenap teknisi Laboratorium Ilmu Hayati

Universitas Gadjah Mada yang telah membantu jalannya penelitian sehingga

dapat terselesaikan dengan baik.

6. Bapak, ibu dan adik-adikku tercinta atas kasih sayang, doa dan dukungannya

selama ini.


vii

7. Robertus Bangun Antoro yang senantiasa memberi dorongan motivasi, doa,

serta berbagi suka dan duka.

8. Sari, Melon, Vita, Lusi, Jeny, Ndari, Lea, buat kebersaman dan kerjasamanya

selama penelitian.

9. Uti, Neti, Lina, Sinta, Opunk, Meta, Agung, Widi, Win, Tanti buat

persahabatan yang indah. Aku tak merasa sendiri karena kalian......

10. D’ Sindens (Angger-Tata- Rosa ’sapi’-Vera ’sundes’- Sari ’Sri’- Dita-Dita ’Bu

Man’-Moncee) dan teman-teman kelas A angkatan 2003 buat kebersamaan

yang indah selama ini.

11. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini.

Tidak dapat dipungkiri tulisan ini masih jauh dari sempurna. Maka dari itu

penulis tidak menutup diri untuk koreksi dan saran yang membangun dari

pembaca. Harapan penulis karya ini bermanfaat dan dapat mendorong mahasiswa

angkatan berikutnya untuk berkarya lebih baik bagi kemajuan dunia farmasi di

Indonesia.

Penulis


viiiPERNYATAAN KEASLIAN KARYA


ix

INTISARI

Penyakit kanker merupakan salah satu penyakit yang sangat mematikan

di dunia. Banyak penelitian menggunakan sumber bahan obat dari alam nabati yang digunakan untuk mengobati penyakit tersebut, salah satunya yaitu daun mimba (Azadirachta indica A. Juss). Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP30, FP40, FP50, dan FP60 berpotensi sebagai antikanker.

Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Uji sitotoksisitas dilakukan pada sel Myeloma dan sel Vero dengan menggunakan metode MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Data yang diperoleh berupa persen kematian sel yang kemudian diolah dengan menggunakan analisis probit dan uji T sampel independen. Dari hasil penelitian harga LC50 yang diperoleh dari fraksi protein daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 terhadap sel myeloma berturut-turut adalah sebesar 0,71 μg/ml; 2,04 μg/ml; 1,88 μg/ml; 1,48 μg/ml. Harga LC50 untuk FP30, FP40, FP50, dan FP60 terhadap sel vero berturut-turut adalah 0,01 μg/ml; > 1 g/ml; 0,03 μg/ml; 0,05 μg/ml. Dapat disimpulkan bahwa FP30 berefek paling sitotoksik. Berdasarkan harga LC50; FP30, FP50 dan FP60 tidak berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker. Sedangkan FP40 tidak berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker berdasarkan uji T sampel independen.

Kata kunci: daun mimba, sitotoksisitas, kanker, sel myeloma, sel vero, LC50


x

ABSTRACT

Cancer is one of deadly diseases in the world. Many researchs use natural medicine plant for curing the disease. One of them is neem leaves (Azadirachta indica A. Juss). The purpose of this research was to determine which protein fraction of neem leaves have cytotoxic effect against myeloma cells.. The research is a pure experimental with the complete random- design, one way pattern. Cytotoxicity test was done at Myeloma cell and Vero cell by using MTT method (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Data in percentage of the death cells were analysed by probit and independent-samples T test. The result show that on myeloma cell, the LC50 value of protein fraction PF30, PF40, PF50, PF60 are 0,71 μg/ml; 2,04 μg/ml; 1,88 μg/ml; 1,48 μg/ml. LC50 value of protein fraction PF30, PF40, PF50, PF60 to vero cells are 0,01 μg/ml; > 1 g/ml; 0,03 μg/ml; 0,05 μg/ml. In conclusion, PF30 have the highest cytotoxic effect.The LC50 value, indicate that PF30, PF50, and PF60 doesn’t have anticancer potency. Independent-samples T test, indicate that PF40 doesn’t have anticancer potency. Keyword: neem leaves, cytotoxicity, cancer, myeloma cell, vero cell, LC50.


xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL................................................................................... .. ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN....................................................................... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... v

PRAKATA.................................................................................................... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... viii

INTISARI...................................................................................................... ix

ABSTRACT .................................................................................................... x

DAFTAR ISI................................................................................................. xi

DAFTAR TABEL......................................................................................... xv

DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xvii

DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xviii

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH PENTING..………………………….. xix

BAB I PENGANTAR.................................................................................. 1

A. Latar Belakang ..................................................................................... 1

1. Permasalahan .............................................................................. 3

2. Keaslian penelitian ...................................................................... 3

3. Manfaat penelitian....................................................................... 4

B. Tujuan Penelitian… ............................................................................. 4

1. Tujuan umum…… ...................................................................... 4

2. Tujuan khusus…………………………………………………. 4


xii

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA........................................................... 6

A. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A. Juss)........................................ 6

1. Keterangan botani ....................................................................... 6

2. Deskripsi ..................................................................................... 6

3. Kandungan kimia ........................................................................ 6

4. Khasiat dan penggunaan ............................................................. 7

5. Penelitian mengenai tanaman mimba…………………………... 7

B. Kanker .................................................................................................. 7

C. Protein……………. ............................................................................. 9

D. Sel Myeloma……… ............................................................................ 12

E. Sel Vero................................................................................................ 13

F. Uji Sitotoksisitas .................................................................................. 14

G. Landasan Teori..................................................................................... 15

H. Hipotesis............................................................................................... 15

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ................................................... 16

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................ 16

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ................................... 16

1. Variabel bebas............................................................................. 16

2. Variabel tergantung..................................................................... 16

3. Variabel pengacau terkendali...................................................... 16

4. Variabel pengacau tak terkendali ................................................ 16

5. Definisi operasional .................................................................... 17

C. Alat dan Bahan ..................................................................................... 17


xiii

1. Alat ............................................................................................ 17

2. Bahan .......................................................................................... 17

D. Tata Cara Penelitian ............................................................................. 18

1. Determinasi tanaman................................................................... 18

2. Pengumpulan daun mimba........................................................... 19

3. Sterilisasi alat dan bahan............................................................. 19

4. Preparasi fraksi protein daun mimba .......................................... 19

5. Pengukuran kadar protein dengan spektrofotometri UV ............ 20

6. Propagasi dan panen sel Myeloma.............................................. 21

7. Propagasi dan panen sel Vero…………………………………... 22

8. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Myeloma 23

9. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero......... 24

E. Analisis Hasil....................................................................................... 25

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 27

A. Determinasi Tanaman .......................................................................... 27

B. Pengumpulan Daun Mimba ................................................................. 27

C. Sterilisasi Alat dan Bahan .................................................................... 28

D. Preparasi Sampel Fraksi Protein Daun Mimba .................................... 28

E. Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Spektrofotometri UV ...... 30

H. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba...................................... 31

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN....................................................... 39

A. Kesimpulan .......................................................................................... 39

B. Saran..................................................................................................... 39


xiv

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 40

LAMPIRAN.................................................................................................. 43

BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 89


xv

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan

metode spektrofotometer UV pada

panjang gelombang 280 nm dan 260 nm .............................. 30

Tabel II. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap

sel Myeloma ………………….……………………………. 33

Tabel III. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap

sel Vero.......………………….…………………………….. 35

Tabel IV. Harga LC50 fraksi protein daun mimba terhadap

sel Myeloma………………….…………………………….. 36

Tabel V. Hasil LC50 fraksi protein daun mimba terhadap

sel Vero………………….…………………………………. 36

Tabel VI. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP30

terhadap kultur sel Myeloma................................................... 45

Tabel VII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP40


Tabel VIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP50


Tabel IX. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP60


Tabel X. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP30

terhadap kultur sel Vero........................................................... 47


xvi

Tabel XI. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP40


Tabel XII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP50


Tabel XIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP60


Tabel XIV. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode

spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm dan

260 nm ................................................................................ 50


xvii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Sel Myeloma dan Sel Vero tanpa perlakuan …………..…... 32

Gambar 2 Kultur sel Myeloma dan sel Vero yang diberi

Perlakuan fraksi protein

daun mimba ……………………...………………………… 32

Gambar 3 Persen kematian sel Myeloma vs konsentrasi fraksi protein

daun mimba ……………………...………………………… 34

Gambar 4 Persen kematian sel Vero vs konsentrasi fraksi protein

daun mimba ……………………...………………………… 35

Gambar 5. Foto tanaman mimba …………............................................. 84

Gambar 6. Foto daun mimba …………................................................... 85

Gambar 7. Foto ELISA reader SLT 340ATC…………........................... 86

Gambar 8. Foto Spektrofotometer UV ………….................................... 86

Gambar 9. Foto Sentrifuse KPLC Series …………................................. 87


xviii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Jumlah penambahan amonium sulfat................................. .. 43

Lampiran 2. Absorbansi Sel dengan Metode MTT .................................... 45

Lampiran 3. Cara Perhitungan Konsentrasi Protein ................................... 50

Lampiran 4. Hasil analisis probit fraksi protein daun mimba

(Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel myeloma

dengan metode MTT…………………………………....…… 52

Lampiran 5. Hasil analisis probit fraksi protein daun mimba

(Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel vero

dengan metode MTT…………………………………....…… 64

Lampiran 6. Uji distribusi data dengan Kolmogorov-Smirnov

pada sel myeloma ………….………………………………. 76

Lampiran 7. Uji distribusi data dengan Kolmogorov-Smirnov

pada sel vero ………….……………………………………. 77

Lampiran 8. Perhitungan nilai kolerasi LC50 Sel Myeloma dan Sel Vero

pada Taraf Kepercayaan 95%…………….……………….. 79

Lampiran 9. Hasil Uji Signifikansi LC50 antara Sel Myeloma

dan Sel Vero dengan Analisis Statistik …………………… 80

Lampiran 10. Foto tanaman dan daun mimba.............................................. 84

Lampiran 11. Foto ELISA reader, Spektrofotometer UV, dan Sentrifuge... 86

Lampiran 12. Surat Determinasi Tanaman ………………………………... 88


xix

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING

FBS : Fetal Bovine Serum

FP : Fraksi Protein

LC50 : Lethal Concentration 50%

MTT : 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromid)

reagen Stopper : reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N

RPMI : Rosswell Park Memorial Institute

SDS : Sodium Dodesil Sulfat

tissue culture flask : tempat untuk menumbuhkan sel, berbentuk botol dengan

leher bengkok

96 well plate : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat

menanam sel pada uji sitotoksisitas


BAB I

PENGANTAR

Latar Belakang

Kanker adalah jenis tumor yang ganas. Penderita kanker semakin

meningkat hampir tiap tahunnya. Di negara yang telah berhasil membasmi

penyakit infeksi, kanker merupakan penyebab kematian kedua setelah penyakit

kardiovaskular. Di Amerika Serikat kanker merupakan penyebab utama kematian

pada wanita antara 3-14 tahun (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995). Di Indonesia

kanker masuk urutan ke-6 sebagai penyebab kematian. Penyakit kanker

diperkirakan diidap oleh 15 orang per 100.000 penduduk di dunia (Kuswibawati,

2000).

Obat antikanker yang ideal seharusnya dapat membunuh sel kanker tanpa

membahayakan jaringan sehat. Sampai sekarang belum ditemukan obat-obatan

yang memenuhi kriteria demikian (Katzung, 1989). Pada umumnya antineoplastik

menekan pertumbuhan atau proliferasi sel dan menimbulkan toksisitas, karena

menghambat pembelahan sel normal yang proliferasinya cepat misalnya sumsum

tulang, epitel germinativum, mukosa saluran cerna, folikel rambut dan jaringan

limfosit. Terapi hanya dapat dikatakan berhasil baik, bila dosis yang digunakan

dapat mematikan sel tumor yang ganas dan tidak terlalu mengganggu sel normal

yang berproliferasi (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995).

Kesadaran akan bahaya bahan-bahan kimiawi yang terkandung dalam

obat-obatan modern menyebabkan obat-obatan tradisional yang diwariskan secara

1


2

turun-temurun menjadi lebih penting dan bernilai. Bahan-bahan untuk itupun telah

disediakan secara melimpah oleh alam Indonesia (Soedibyo, 1998).

Kenyataan menunjukkan bahwa penggunaan obat tradisional dan obat dari

alam akhir-akhir ini mengalami peningkatan, misalnya mimba (Azadirachta

indica A. Juss). Tumbuhan ini bisa digunakan mulai dari kulit batang sampai daun

segarnya. Berdasarkan penelitian sebelumnya beberapa khasiat daun mimba

diantaranya, sebagai obat anti diabetes, antibakteri, analgesik, antiinflamasi,

ekspektoran, karminatif, hepatitis, alergi, dan malaria (Keating, 1999). Dewasa

ini, kepopulerannya semakin melambung karena dipercaya dapat digunakan

sebagai antikanker (Kardinan dan Taryono, 2003).

Suatu senyawa dinyatakan memiliki potensi sebagai antikanker jika

memiliki nilai LC50 lebih kecil dari 20 µg/ml (Suffness and Pezzuto, 1991).

Penelitian sebelumnya menggunakan fraksi protein daun mimba hasil

pengendapan ammonium sulfat 30%, 40%, dan 100% jenuh dengan konsentrasi

6,25 μg/ml; 12,5 μg/ml; 25 μg/ml; 50 μg/ml; 100 μg/ml; dan 200 μg/ml (Hariadi,

2006), terbukti memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel myeloma. Dari hasil

penelitian tersebut, pengendapan dengan ammonium sulfat 30% dan 60% dengan

nilai LC50 sebesar 0,5 µg/ml dan 2,6 µg/ml berpotensi untuk dikembangkan

sebagai antikanker. Pada penelitian tersebut, diperoleh persen kematian melebihi

50% yang kemungkinan disebabkan oleh terlalu besarnya fraksi protein yang

digunakan. Didasari oleh penelitian tersebut, maka dilakukan penelitian

menggunakan proses fraksinasi untuk mencari fraksi protein yang memiliki efek


3

sitotoksik dengan menggunakan parameter LC50 dan yang berpotensi untuk

dikembangkan sebagai antikanker.

1. Permasalahan

Permasalahan yang timbul dalam penelitian ini adalah :

a. fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP30, FP40, FP50,dan

FP60, manakah yang mempunyai daya sitotoksisitas paling besar terhadap sel

myeloma?

b. seberapa besar nilai LC50 dari fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica

A. Juss) FP30, FP40, FP50,dan FP60 terhadap sel myeloma?

c. apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP30, FP40,

FP50,dan FP60, juga memiliki daya sitotoksisitas terhadap sel vero?

d. apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP30, FP40,

FP50,dan FP60 berpotensi dikembangkan sebagai antikanker jika dilihat dari

daya sitotoksisitasnya terhadap sel myeloma dan sel vero?

2. Keaslian penelitian

Sebelumnya telah dilakukan penelitian mengenai “Sitotoksisitas Fraksi

Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) Hasil Pengendapan dengan

Amonium Sulfat 30%, 60%, dan 100% Jenuh terhadap Kultur Sel Myeloma

(Hariadi, 2006)”. Sejauh ini, penulis belum menemukan adanya penelitian

mengenai sitotoksisitas fraksi potein daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss)

FP30, FP40, FP50,dan FP60 terhadap kultur sel myeloma.


4

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat melengkapi dan memperkaya teori

yang telah ada mengenai khasiat, penggunaan dan efek sitotoksisitas fraksi

protein daun mimba terhadap kultur sel myeloma dan sel vero.

b. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan alternatif untuk

pengobatan kanker dengan menggunakan bahan dari alam.

Tujuan Penelitian

1. Tujuan Umum

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah fraksi protein daun

Mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP30, FP40, FP50,dan FP60 berpotensi

sebagai antikanker.

2. Tujuan Khusus

a. Untuk mengetahui fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss)

FP30, FP40, FP50,dan FP60 yang mempunyai daya sitotoksisitas paling besar

terhadap sel myeloma.

b. Untuk mengetahui nilai LC50 dari fraksi protein daun mimba (Azadirachta

indica A. Juss) FP30, FP40, FP50,dan FP60 terhadap sel myeloma.

c. Untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica

A. Juss) FP30, FP40, FP50,dan FP60, juga memiliki daya sitotoksisitas

terhadap sel vero.


5

d. Untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica

A. Juss) FP30, FP40, FP50,dan FP60 berpotensi dikembangkan sebagai

antikanker jika dilihat dari daya sitotoksisitasnya terhadap sel myeloma

dan sel vero.


6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Azadirachta indica A. juss

Keterangan Botani

Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) berasal dari genus

Azadirachta, famili Meliaceae, dan ordo Archiclamydae dengan sinonim Melia

azadirachta Linn. Tanaman ini dalam bahasa Inggris dikenal dengan neem.

(Backer dan Backuizen van den Brink, 1965; Hutapea, 1993).

Deskripsi

Tanaman mimba berupa pohon dengan tinggi 10-15 meter. Batang tegak,

berkayu, bulat, permukaan kasar, percabangan simpodial, dan berwarna coklat.

Daun berwarna hijau, majemuk, berhadapan, lonjong, melengkung, tepi bergerigi,

ujung lancip, pangkal meruncing, pertulangan menyirip, panjang 5-7 cm, lebar 3-4

cm, dan tangkai daun panjang 8-20 cm. Bunga berwarna putih, majemuk,

berkelamin dua, terletak di ujung cabang, bertangkai silindris, panjang 8-15 cm,

kelopak hijau, mahkota halus, benang sari silindris berwarna putih kekuningan,

putih lonjong, dan coklat muda. Buah berwarna hijau, berbentuk bulat telur, dan

buni. Biji berbentuk bulat, berwarna putih, dan mempunyai diameter 1 cm.

Tanaman mimba mempunyai akar tunggang yang berwarna coklat (Hutapea,

1993).


7

Kandungan Kimia

Tumbuhan mimba mengandung azadirachtin, aspargin, margosin, asam

glutamat, isolesin, karbohidrat, protein, lemak, kalsium, dan treonin (Anonim,

2004; Anonim, 1985).

Khasiat dan Penggunaan

Mimba banyak digunakan sebagai obat di masyarakat, antara lain

digunakan sebagai penurun panas, pembunuh serangga, pencahar, pemacu enzim

pencernaan, antiinflamasi, antirematik, antipiretik, penurun gula darah, antitukak

lambung, hepatoprotektor, antifertilitas, antivirus, dan antikanker (Anonim, 1985;

Anonim, 2004; Sukrasno, 2003).

Penelitian Mengenai Tanaman Mimba

Penelitian mengenai tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) telah

banyak dilakukan antara lain sitotoksisitas fraksi protein daun mimba

(Azadirachta indica A. Juss) hasil pengendapan dengan ammonium sulfat 30%,

60%, dan 100% jenuh terhadap kultur sel Myeloma (Hariadi, 2006) dengan LC50

sebesar 0,5µg/ml, 2,6µg/ml,dan 25,0 µg/ml; terhadap kultur sel Hela (Suwanto,

2006) dengan LC50 sebesar 1,0µg/ml, 4,1µg/ml, dan 407,7µg/ml; terhadap kultur

sel SiHa (Candra, 2006) dengan LC50 sebesar 1,72µg/ml, 0,04µg/ml, dan 32,56

µg/ml; sedangkan terhadap kultur sel Raji (Robbyono, 2006) dengan LC50 sebesar

15,3µg/ml, 24,0µg/ml.

B. Kanker

Kanker adalah suatu proliferasi sel-sel yang tidak dapat diatur. Kanker

menunjukkan suatu kegagalan morfogenesis normal dan kegagalan diferensiasi


8

normal (Kimball, 1988). Kanker timbul dari sel tunggal yang mengalami mutasi.

Mutasi gen menyebabkan pertumbuhan sel meningkat dibandingkan yang lain dan

membiarkan sel-sel tersebut tidak terkendali perkembangannya (Macdonald and

Ford, 1997).

Agen yang menyebabkan terjadinya kanker disebut karsinogen.

Karsinogen mungkin dapat berupa zat kimia maupun fisika, seperti sinar radiasi

ultraviolet, zat-zat kimia seperti hidrokarbon dan tar. Karsinogen berupa biologis

misalnya virus (Franks and Teich, 1997).

Kanker dapat menyerang berbagai sel pada seluruh organ di dalam tubuh,

dari kepala sampai ujung kaki. Dalam keadaan normal sel hanya akan membelah

diri bila tubuh membutuhkan, misalnya ada sel yang mau diganti karena mati atau

rusak. Sedangkan sel kanker akan membelah meskipun tidak diperlukan, sehingga

terjadi sel-sel baru yang berlebihan. Sel-sel baru mempunyai sifat seperti

induknya yang sakit yaitu sel-sel yang tidak mempunyai daya atur (Kuswibawati,

2000).

Kanker dibedakan menjadi dua macam jenis kanker yaitu kanker jinak

(benigna) dan kanker ganas (maligna) (Macdonald and Ford, 1997). Disebut

kanker jinak apabila kanker membentuk suatu massa sel tunggal dan belum

mempengaruhi sel atau jaringan sekitarnya. Jika sel telah menginvasi jaringan di

sekitarnya danmasuk ke dalam aliran darah atau limfa maka disebut kanker ganas

(Albert et al, 1994).


9

Tingkatan perubahan sel pada pertumbuhan kanker adalah sebagai berikut:

1. hiperplasi adalah pembengkakan organ tubuh akibat pertumbuhan sel-sel baru

yang abnormal karena hilangnya kontrol pertumbuhan.

2. metaplasi yaitu pertumbuhan epitel suatu jenis jaringan dewasa menjadi

jaringan lain yang juga dewasa.

3. displasi yaitu perubahan sel dewasa ke arah kemunduran dalam hal bentuk,

besar dan orientasinya yang masih bersifat reversibel.

4. anaplasi yaitu perubahan serupa displasi yang menyimpang lebih jauh dari

normal. Merupakan suatu ciri tumor ganas yang bersifat ireversibel.

5. karsinoma insitu yaitu gambaran sel menjadi sangat atipik namun belum

terdapat pertumbuhan infiltratif.

6. invasi yaitu sel kanker telah menembus lapisan basal jaringan (Kuswibawati,

2000).

C. Protein

Protein adalah suatu polipeptida yang mempunyai bobot molekul yang

sangat bervariasi, dari 5000 hingga lebih dari satu juta (Poedjiadi, 1994).

Protein dalam tanaman terbagi menjadi dua yaitu protein biji dan protein

daun. Beberapa protein biji memiliki sifat sebagai protein racun. Sebagian

diantaranya mungkin berperan dalam melindungi tumbuhan dari serangan

mikroba. Protein beracun lain memberikan harapan sebagai antikanker dan

penyakit lain yang disebabkan oleh virus (Robinson, 1991).

Cara untuk memisahkan protein dari suatu larutan adalah dengan

mengendapkannya. Proses ini dilakukan dalam beberapa langkah yang kemudian


10

dikenal dengan istilah fraksinasi. Maksud dari langkah-langkah fraksinasi adalah

untuk memisahkan campuran protein ke dalam suatu seri fraksi protein. Fraksinasi

protein dapat dilakukan dengan cara pengendapan dengan garam, misalnya

dengan kalium atau amonium sulfat (Scopes cit Robbyono, 1994).

Keuntungan fraksinasi menggunakan amonium sulfat adalah

keefektifannya yang melebihi garam kation yang lain, selain itu harganya lebih

murah dan ada manfaat yang lebih besar lagi yaitu dapat menstabilkan protein

yang dimurnikan. Pada konsentrasi garam yang tinggi dapat mencegah terjadinya

proteolisis dan juga mencegah pertumbuhan bakteri. Selain itu, amonium sulfat

bersifat inert, tidak bereaksi dengan protein yang dipisahkan. Namun

kelemahannya, amonium sulfat biasanya terkontaminasi oleh logam berat seperti

besi, sehingga dapat mengganggu proses pengendapan. Jumlah amonium sulfat

yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan yang diinginkan dapat ditentukan

dengan rumus yang mudah (Scopes cit Candra, 1994).

Beberapa metode tersedia untuk determinasi protein, antara lain:

1) metode spektrofotometri

Sebagian besar protein memiliki absorbansi maksimal pada panjang

gelombang 280 nm karena adanya residu asam amino tirosin dan triptofan.

Keuntungan metode ini yaitu sensitifitasnya tinggi dan tidak membutuhkan

reagen. Komponen yang mengandung cincin purin dan pirimidin akan menyerap

UV pada panjang gelombang 260 nm. Dengan demikian keberadaan beberapa

komponen tersebut akan mengganggu pengukuran absorbansi protein pada

panjang gelombang 280 nm. Oleh karena itu untuk pengukuran protein dilakukan


11

pada panjang gelombang 260 nm dan 280 untuk mengoreksi adanya komponen-

komponen tersebut (Kerese, 1984).

2) metode biuret

Prinsip dari metode biuret adalah mencampur larutan yang

mengandung protein dengan basa kuat kemudian direaksikan dengan larutan

CuSO4 yang sangat encer, sehingga menghasilkan warna violet kemerahan sampai

biru violet. Warna yang dihasilkan merupakan senyawa kompleks yang dihasilkan

karena reaksi antara Cu2+ dengan 4 atom N. Dua atom N yang berdekatan dari

satu rantai peptida dengan 2 atom N yang berdekatan dari rantai peptida yang lain

berikatan dengan Cu2+ sehingga membentuk kompleks warna biru violet, dimana

semakin lama warna yang terbentuk akan semakin pekat (tua). Reaksi ini tidak

dapat terjadi pada dipeptida dan asam amino bebas (kecuali serin dan Treonin).

Range protein yang dapat dianalisis menggunakan merode biuret yaitu 0,2 sampai

2 mg (Alexander, 1985).

3) metode lowry

Prinsip dari metode Lowry adalah mencampur larutan yang

mengandung protein dengan basa kuat kemudian direaksikan dengan larutan

CuSO4 yang sangat encer, sehingga menghasilkan warna violet kemerahan sampai

biru violet. Warna yang dihasilkan merupakan senyawa kompleks yang dihasilkan

karena reaksi antara Cu2+ dengan 4 atom N. Dua atom N yang berdekatan dari

satu rantai peptida dengan 2 atom N yang berdekatan dari rantai peptida yang lain

berikatan dengan Cu2+ sehingga membentuk kompleks warna biru violet.


12

Kemudian terjadi reduksi reagen fosfomolibdat-fosfotungstat (reagen Folin-

Ciocalteau) oleh tirosin, triptofan, dan sistein (Alexander,1985).

4) metode “dye-binding”

Interaksi antara reagen Coomassie Brilliant Blue G250 dengan protein

memberikan perubahan warna yang teramati, sehingga kadar protein dapat

ditetapkan dengan mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm

(Alexander, 1985).

D. Sel Myeloma

Myeloma adalah tumor yang terdiri dari jenis sel yang biasa ditemukan

dalam sumsum tulang (Katzung, 1989). Multiple myeloma (yang dikenal sebagai

myeloma) merupakan penyakit hematologik progresif. Myeloma merupakan

kanker pada sel plasma, bagian penting dari sistem imun yang menghasilkan

immunoglobulin (antibodi) untuk membantu melawan infeksi dan penyakit.

Multiple myeloma ditandai dengan jumlah yang berlebihan dari sel plasma

abnormal pada sumsum tulang dan produksi berlebihan dari immunoglobulin

monoklonal (IgG, IgA, IgD, atau IgE). Hypercalcemia, anemia, kerusakan ginjal,

meningkatnya kerentanan terhadap infeksi bakteri dan terganggunya produksi

immunoglobulin adalah manifestasi klinis yang umum pada multiple myeloma

(Anonim, 2005).

Myeloma cell line pertama kali diambil pada tahun 1967 oleh R. Laskov

dan MD Scharff dari Merwin Plasma Sel Tumor-11 (MPC-11) yang diisolasi dari

mencit Balb/c yang diperoleh dari J. Fahey. Sel tumor ini diadaptasikan ke dalam

kultur secara terus-menerus sampai 6 kali dan dipelihara dalam flask yang berisi


13

media Dulbecco’s-Eagle’s dengan asam amino non essensial dan 20% serum kuda

yang inaktif (Anonim cit Rahmawati, 1983).

Sel myeloma dapat menimbulkan efek pada tulang, akan tetapi sel

myeloma bukan termasuk ke dalam kanker tulang melainkan sel myeloma

merupakan sel kanker darah atau sel kanker plasma. Pengobatan sel myeloma

tergantung pada stadium yang diderita. Penyakit ini jarang terjadi, akan tetapi

merupakan suatu penyakit yang mematikan (Anonim cit Hariadi, 2003).

E. Sel Vero

Untuk pertama kalinya cell line diambil dari ginjal African Green Monkey

dewasa pada tanggal 27 Maret 1967 oleh Y. Yasamura dan Y. Kawakita dari

Universitas Chiba di Chiba, Jepang. Sel tersebut kemudian ditumbuhkan dalam

media yang berisi 0,5 % laktalbumin hidrosilat, 0,1 % ekstrak yeast dan 0,1 %

polivinilpirolidan dalam 98 % Earle’s BBS dan 2 % calf serum. Konsentrasi calf

serum akhirnya ditingkatkan menjadi 5 %. Kemudian sel di bawa ke laboratorium

Virologi Tropis, Institut Alergi dan Infeksi Nasional Amerika, Institut Kesehatan

Nasional Amerika setelah mencapai keturunan ke-93 dari Universitas Chiba oleh

Dr. B. Simizu pada 15 Juni 1964. Mulai keturunan ke-97 sel vero ditumbuhkan

dalam 95 % FBS (Fetal Bovine Serum), media Morgan, Morton dan Parker dan 95

% MEM (Minimum Essensial Medium) dengan asam amino non essensial dan

Earl’s BSS dan 5% FBS. Sel vero digunakan secara luas pada studi replikasi virus

dan uji penyakit pes. Selain itu juga digunakan untuk uji berbagai penyakit yang

diakibatkan oleh virus. Akhirnya virus cell line diserahkan ke American Type

Cultur Collection pada keturunan ke-113 (Anonim, 1983).


14

F. Uji Sitotoksisitas

Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro dengan menggunakan kultur sel yang

digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan makanan,

pestisida, dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas anti neoplastik

dari suatu senyawa (Freshney, 1986).

Program pengembangan obat baru untuk mengidentifikasi agen

kemoterapetik kanker yang baru melibatkan evaluasi preklinik yang luas dari

sejumlah besar senyawa kimia. Uji tersebut biasanya dilakukan pada hewan

percobaan yang mempunyai kesamaan sifat dengan manusia. Penelitian

menggunakan hewan percobaan memegang peranan penting, namun ada beberapa

pertimbangan yang menyebabkan kecenderungan untuk menggunakan kultur sel.

Pertimbangan tersebut antara lain tes in vitro lebih murah dibanding in vivo, ada

perbedaan proses fisiologi antara hewan percobaan dan manusia, dan ada

pertimbangan moral dalam penggunaan hewan untuk penelitian (Freshney, 1986).

Uji MTT mengindikasikan integritas dan aktivitas mitokondria, yang

diintepretasikan sebagai tolak ukur kelangsungan hidup sel. Pada uji MTT, garam

tetrazolium, 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide secara

aktif diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi dalam mitokondrial membentuk suatu

produk formazan berwarna ungu. Produk tersebut terakumulasi di dalam sel

karena tidak bisa menembus membran sel (Barile cit Robbyono, 1997).


15

G. Landasan Teori

Kanker adalah adalah penyakit pertumbuhan tidak normal dari sel-sel

jaringan tubuh yang berubah menjadi sel kanker dalam perkembangannya, sel-sel

kanker ini dapat menyebar ke bagian tubuh sehingga menyebabkan kematian.

Myeloma adalah tumor yang terdiri dari jenis sel yang biasa ditemukan

dalam sumsum tulang dan sel myeloma telah digunakan sebagai model untuk

mengetahui daya sitotoksik.

Banyak penelitian telah dilakukan untuk mencari alternatif obat antikanker

yang berasal dari bahan alam. Salah satunya yaitu dengan menggunakan daun

mimba. Dari hasil penelitian sitotoksisitas fraksi protein daun mimba hasil

pengendapan dengan amonium sulfat 30%, 60%, dan 100% jenuh terhadap kultur

sel myeloma (Hariadi, 2006), diperoleh harga LC50 sebesar 0,5 µg/ml (fraksi 30%)

dan 2,6 µg/ml (fraksi 60%) yang berarti memikili potensi untuk dikembangkan

sebagai antikanker. Hal tersebut mendasari dilakukannya penelitian dengan

memfraksinasi protein daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60. Diharapkan hasil

penelitian dapat memberikan informasi tentang fraksi protein yang memiliki efek

sitotoksik paling besar dan berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa

antikanker.

H. Hipotesis

Fraksi protein dari daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP30, FP40,

FP50, dan FP60 memiliki efek sitotoksik sehingga berpotensi sebagai antikanker.


16

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian sitotoksisitas fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A.

Juss.) FP30, FP40, FP50, dan FP60 terhadap kultur sel Myeloma ini termasuk

penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel bebas

Kadar fraksi protein daun mimba yaitu 0,20 μg/ml; 0,39 μg/ml; 0,78 μg/ml;

1,56 μg/ml; 3,13 μg/ml; 6,25 μg/ml; 12,5 μg/ml; 25 μg/ml; 50 μg/ml; 100

μg/ml dan 200 μg/ml.

2. Variabel tergantung

Persentase kematian sel myeloma dan sel vero.

3. Variabel pengacau terkendali

a. pH dan suhu pembuatan fraksi protein, dikendalikan pada pH 7,2 dan

suhu 4oC.

b. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI

1640-serum (untuk sel myeloma) dan M199 (untuk sel vero).

c. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun mimba dikendalikan dengan

memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

4. Variabel pengacau tak terkendali

Kematian alami sel myeloma dan sel vero.


17

5. Definisi operasional

a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari fraksi protein daun

mimba terhadap sel myeloma dan sel vero.

b.Fraksi protein ialah fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A.

Juss.) FP30, FP40, FP50, dan FP60, dinyatakan dalam µg/ml.

c. LC50 ialah konsentrasi fraksi protein daun mimba yang mampu membunuh

atau menyebabkan kematian sejumlah 50% sel uji dan dinyatakan dalam

µg/ml.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas,

stamper, mortir, timbangan analitik (AND ER-400 H), alumunium foil, magnetic

stirrer, tabung conical, autoklaf, tissue culture flask, swing rotor sentrifuge

(PLC), inkubator (Nuaire), mikropipet, membran dialisis (Sigma), lemari

pendingin, cell counter (Nunc), 96-well plate (Nunc), spektrofotometer UV (Cecil

CE-292), ELISA reader (SLT 340 ATC), laminar air flow (Nuaire), mikroskop

(Olympus IMT-2), haemocytometer (Nebauer), kain monel, tissue, glove, masker.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah :

a. daun mimba segar

b. kultur sel myeloma yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati

Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.


18

c. kultur sel vero (normal) yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati

Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

d. pereaksi-peraksi yang digunakan untuk preparasi fraksi protein daun

mimba

1) Larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 (Merck)

2) Larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14

M NaCl (Merck)

3) Amonium sulfat p.a. (Merck)

e. pereaksi-pereaksi untuk uji sitotoksisitas

1) Media pencuci: RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat, Hepes

2) Media penumbuh: RPMI 1640, M199, FBS (Foetal Bovine Serum)

10%, Penisilin-Streptomisin 1% (Gibco), dan Fungison 0,5%

(Gibco).

3) Reagen Stopper : Sodium Dodeksil Sulfat (SDS) dalam HCl 0,01 N

(Merck)

4) MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium

bromide) (Sigma)

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun mimba,

telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Farmakognosi Fitokimia,

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga


19

kebenarannya menggunakan acuan baku (Backer dan Backuizen van den Brink,

1965).

2. Pengumpulan daun mimba

Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di

pekarangan Laboratorium Hayati, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada

bulan Juni 2006.

3. Sterilisasi alat dan bahan

Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat

yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat

tersebut dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan, setelah itu dibungkus

dengan kertas payung dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu

1210C (Cook dan Martin cit Candra, 1961).

4. Preparasi fraksi protein dari daun mimba

Daun tanaman mimba dikumpulkan segar, diseleksi, dan ditimbang

sebanyak 400 gram. Daun kemudian dicuci bersih dengan air mengalir, dibungkus

plastik dan disimpan dalam freezer semalam. Bahan ditumbuk halus dalam mortir

bersih dan steril dengan penambahan sedikit demi sedikit dapar natrium fosfat 5

mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu dingin (dengan

penambahan es di sekitarnya). Bahan diperas dan disaring dengan kain monel,

ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang diperoleh

disentrifus dengan 4000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh

merupakan ekstrak gubal, dikumpulkan dalam beaker glass dan diukur

volumenya. Supernatan ekstrak gubal yang diperoleh, diendapkan proteinnya


20

dengan menambahkan amonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 30%.

Penambahan amonium sulfat dilakukan sedikit demi sedikit, diikuti pengadukan

teratur dengan magnetic stirrer pada suhu dingin, dilanjutkan dengan sentrifugasi

ultra dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 4°C selama 25 menit. Supernatan

(1) ditampung dalam labu ukur sedangkan endapan yang diperoleh dilarutkan

dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya

endapan tadi didialisis dengan memasukkan larutan endapan dalam dapar natrium

fosfat ke dalam membran dialisis yang salah satu ujungnya telah dijepit dengan

penjepit khusus membran kemudian ujung membran yang lainnya ditutup dengan

dijepit dengan penjepit khusus membran dengan kuat. Membran dialisis lalu

digantung dalam beaker glass yang berisi dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2

sebanyak 1000 ml. Proses dialisis dilakukan dalam almari es selama semalam

dengan di-stirrer perlahan dan dilakukan penggantian dapar natrium fosfat satu

kali. Hasil dialisis disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 20 menit.

Endapan hasil dialisis dibuang dan supernatan diambil. Supernatan ini merupakan

sampel fraksi protein daun mimba FP30.

Supernatan (1), (2), dan (3) ditampung secara bertahap, kemudian

ditambah amonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 40%, 50%, 60% dengan

menggunakan langkah-langkah yang sama dengan fraksi protein daun mimba

FP30. Hasil yang diperoleh merupakan sampel fraksi protein FP40, FP50 dan FP60.

5. Pengukuran kadar protein dengan spektrofotometri UV

Sampel fraksi protein daun mimba FP30, FP40, FP50 dan FP60, masing-

masing sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml lalu ditambah 990 µl


21

larutan dapar natrium fosfat 5 mM, diukur serapannya dengan spektrofotometer

UV pada panjang gelombang 280 nm dengan blanko larutan dapar natrium fosfat

5 mM. Untuk mengoreksi adanya serapan oleh asam nukleat pada panjang

gelombang tersebut maka pengukuran juga dilakukan pada panjang gelombang

260 nm.

Konsentrasi = ([1,55 x E(280)] – [0,76 x E(260)] x faktor pengenceran) mg/ml

(Layne cit Richterich & Colombo, 1981)

6. Propagasi dan panen Sel Myeloma

a. Propagasi Sel Myeloma

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam

penangas air 37oC, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70%. Ampul dibuka

dan sel myeloma dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium

RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang,

diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan.

Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang

sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang

mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen,

kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan

dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam,

medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya

cukup untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al

cit Candra, 1989).


22

b. Panen Sel Myeloma

Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), media

diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari

dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel

dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai

volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang

dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian

dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium

sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x104/100 μl dan siap dipakai

untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al cit

Candra, 1989).

8. Propagasi dan panen sel Vero

a. Propagasi Sel Vero

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam

penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul

dibuka dan sel vero dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium

M199. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti

dengan medium M199 yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel

lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi.

Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang

mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen,

kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan

dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam,


23

medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya

cukup untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al

cit Candra, 1989).

b. Panen sel Vero

Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), sel dicuci

dengan FBS 10% sebanyak 3 ml. Untuk melepaskan sel-sel dari dinding flask,

diberi tripsin 2,5% sebanyak 1 ml. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril

yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml. Kemudian sel dibilas kembali dengan

FBS 10% sebanyak 3 ml. Hasil bilasan dituang ke dalam tabung conical yang

sama dan disentrifuse selama 5 menit. Untuk menghilangkan sisa tripsin, sel

dicuci sekali lagi dengan menggunakan medium yang sama. Kemudian pelet

ditambah media kultur sebanyak 1 ml. Selanjutnya lakukan perhitungan jumlah

sel dengan menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah

medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x104/100 μl dan siap

dipakai untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et

al cit Candra, 1989).

9. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Myeloma

Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl suspensi sel Myeloma dengan

kepadatan 2,5x104/100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate

yang telah berisi 100 μl fraksi protein daun mimba dengan kadar 200 µg/ml pada

sumuran A1, B1 dan C1 pada kolom 1, kemudian pada sumuran A2, B2 dan C2 di

kolom 2 ditambahkan 100 μl suspensi sel Myeloma pada sumuran yang telah

berisi 100 μl fraksi protein daun mimba dengan kadar 100 µg/ml, demikian


24

seterusnya hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam

penelitian. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran

yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sedangkan

untuk faktor koreksi, 100 µl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi

medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya 96-well

plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan

aliran 5% CO2 (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al cit

Candra, 1989).

Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl

MTT 2,5 μg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu

37oC, dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Sel hidup akan bereaksi dengan

MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 50 μl

reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar.

Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang

550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.

10. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero

Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl suspensi sel vero dengan

kepadatan 2,5x104/100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate

yang telah berisi 100 μl fraksi protein daun mimba dengan kadar 200 µg/ml pada

sumuran A1, B1 dan C1 pada kolom 1, kemudian pada sumuran A2, B2 dan C2 di

kolom 2 ditambahkan 100 μl suspensi sel vero pada sumuran yang telah berisi 100

μl fraksi protein daun mimba dengan kadar 100 µg/ml, demikian seterusnya

hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian.


25

Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi

medium M199 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sedangkan untuk faktor

koreksi, 100 µl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium M199

dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan

selama 24 jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 (Freshney,

1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al cit Candra, 1989).

Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl

MTT 2,5 μg/ml dalam media M199, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37oC,

dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT

dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 50 μl

reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar.

Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang

550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.

E. Analisis Hasil

Pada metode MTT ini, serapan terbaca menunjukkan jumlah sel yang

hidup dan hasil akhir uji sitotoksisitas yaitu persentase kematian sel yang dihitung

menggunakan modifikasi rumus Abbot, dengan persamaan berikut:

% Kematian sel = 100% x A

C)(BA −−

Keterangan : A = Rata-rata absorbansi kontrol B = Rata-rata absorbansi perlakuan C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa sel

(Meyer, Ferrigni, Putnam, Jacobsen, Nochols, Mc Laughlin cit Candra, 1982)


26

Untuk menghitung harga LC50 dilakukan perhitungan secara statistik

menggunakan analisis probit sedangkan untuk menganalisis perbedaan antara

daya sitotoksik fraksi protein daun mimba terhadap sel Myeloma dan sel Vero

dilakukan pengolahan data dengan uji T independen.

.


27

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Penelitian ini menggunakan bahan utama berupa daun mimba. Untuk menghindari

terjadinya kesalahan pada penggunaan tanaman yang digunakan maka dilakukan

determinasi. Determinasi dilakukan di laboratorium Farmakognosi Fitokimia,

Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Dari determinasi

didapat kunci Meliaceae -1b-2b-3b-4b-12b-13b-14b-17b-18b-19b-20b-21b-22b-

23b-24b-25b-26b-27a-28b-29b-30b-31a-32a-33a-34a-35a-36d-37b-38b-39b-41b-

42b-44b-45b-46e-50b-51b-53b-54b-56b-57b-58b-59d-72b-73b-74a-75b-76a-77a-

78b-103c-104b-106b-107a-108b-109a-110b-115b-119b-126a-136. Azadirachta -

1b-3b-4b-7b-10b-13b-15a. Azadirachta indica A. Juss -1a. hasil detrminasi

menyatakan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah benar

Azadirachta indica A. Juss.

B. Pengumpulan Daun Mimba

Daun mimba yang digunakan pada penelitian diambil dari pohon mimba

yang tumbuh di halaman Laboratorium Ilmu Hayati, Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta, pada bulan Juni 2006. Pemanenan daun mimba dilakukan pada

pohon dan waktu pemanenan yang sama. Hal ini dilakukan untuk menghindari

kemungkinan terjadinya perbedaan kualitas dan kandungan kimia yang terdapat

pada daun mimba. Daun mimba yang digunakan dipilih yang tidak terlalu muda

maupun terlalu tua supaya diperoleh kandungan kimia yang optimal.


28

C. Sterilisasi Alat dan Bahan

Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan

terlebih dahulu untuk menghilangkan semua pengotor dan kontaminan yang bisa

mengganggu pada saat proses penelitian. Sterilisasi dilakukan dengan

menggunakan metode uap panas bertekanan yang dilakukan pada suhu 121°C

selama kurang lebih 20 menit. Prinsip kerja dari metode ini yaitu dengan

menaikkan tekanan hingga suhu tinggi sehingga terbentuk uap air panas. Uap air

panas tersebut akan membunuh mikroorganisme dengan menyebabkan terjadinya

koagulasi dan denaturasi protein pada mikroorganisme. Penetrasi uap air panas

yang cepat mengakibatkan perusakan sel mikroorganisme yang lebih cepat.

D. Preparasi Sampel Fraksi Protein Daun Mimba

Pada penelitian ini menggunakan sampel berupa fraksi protein daun

mimba. Sampel dibuat dari daun mimba yang sebelumnya sudah dicuci bersih

yang bertujuan untuk menghilangkan pengotor-pengotor yang menempel pada

daun, kemudian sampel disimpan di dalam freezer semalam agar daun menjadi

lebih kaku sehingga mudah dihaluskan. Daun ditumbuk sampai halus dengan

menggunakan mortir yang dialasi dengan wadah yang berisi es sehingga tercipta

suasana yang dingin di sekitar mortir. Pada saat penumbukan ditambahkan dapar

natrium fosfat 5 mM yang mengandung NaCl. Dapar ini berfungsi untuk

mengeluarkan atau mengekstraksi protein yang terdapat pada daun dan NaCl akan

mempermudah proses ekstraksi tersebut sehingga protein dapat larut dan stabil di

dalam buffer penggerak. Proses tersebut dilakukan pada suhu dingin supaya

protein tidak rusak, karena jika dilakukan pada suhu tinggi protein akan


29

mengalami denaturasi. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak gubal daun

mimba yang kemudian ditambahkan amonium sulfat sampai mencapai kejenuhan

30%. Penambahan amonium sulfat ini bertujuan untuk menarik air yang terdapat

di dalam larutan sehingga akan terjadi penurunan kelarutan protein dan agregasi

molekul protein yang menyebabkan protein terendapkan. Proses di atas disebut

mekanisme salting out. Ion anorganik dari amonium sulfat akan bersaing dengan

protein untuk mengikat air, karena amonium sulfat lebih polar dibanding protein

maka air akan lebih banyak terikat pada amonium sulfat sehingga terjadi

penurunan kelarutan protein dan pada akhirnya protein terendapkan. Pada

mekanisme salting out tersebut, penambahan amonium sulfat dilakukan secara

sedikit demi sedikit agar dapat larut sempurna. Dari proses sentrifugasi akan

diperoleh supernatan dan endapan. Supernatannya ditampung untuk digunakan

pada proses preparasi sampel fraksi berikutnya, sedangkan endapan yang

diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM

pH 7,2. Endapan yang diperoleh didialisis dengan tujuan untuk menghilangkan

amonium sulfat yang masih terikat dengan protein. Amonium sulfat yang

memiliki ukuran molekul lebih kecil dari protein akan menembus membran

dialisis secara difusi pasif, hal tersebut terjadi karena adanya perbedaan gradien

konsentrasi,dimana konsentrasi di tubing lebih tinggi dibanding dengan di luar.

Dialisis dilakukan semalaman supaya amonium sulfat dalam sampel dapat keluar

semua dengan sempurna sehingga diperoleh fraksi protein yang murni. Dapar

natrium fosfat diganti pada jam ke-4, agar gradien konsentrasi di dalam dan di

luar membran dialisis tetap besar sehingga proses dialisis bisa berlangsung dengan


30

baik. Endapan hasil dialisis dibuang dan supernatan diambil. Supernatan ini

merupakan sampel fraksi protein daun mimba FP30.

Pada preparasi sampel fraksi protein daun mimba FP40, FP50 dan FP60

langkah pengerjaannya sama seperti di atas, yaitu dengan menggunakan

supernatan hasil pengendapan amonium sulfat. Jumlah amonium sulfat yang

ditambahkan berturut-turut untuk sampel fraksi protein daun mimba FP30, FP40,

FP50 dan FP60 adalah sebanyak 28,35 gram; 29,29 gram; 30,29 gram; dan 31,36

gram. Sampel fraksi-fraksi protein yang diperoleh berwarna hijau kecoklatan dan

disimpan dalam suhu dingin.

E. Pengukuran Kadar Protein dengan Spektrofotometri UV

Sampel fraksi protein daun mimba yang diperoleh kemudian diukur

kadarnya dengan menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang

280 nm dan 260 nm. Sampel fraksi protein tersebut dapat diukur kadarnya dengan

spektrofotometer UV karena memiliki asam amino aromatik yang dapat menyerap

sinar UV. Asam amino tersebut memiliki panjang gelombang maksimum pada

280 nm. Adanya asam nukleat dan senyawa yang mengandung cincin purin dan

pirimidin yang memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 280 nm

yang terdapat di dalam sampel protein dapat mengganggu dalam pengukuran

absorbansi. Oleh sebab itu, dilakukan pengukuran absorbansi juga pada panjang

gelombang 260 nm untuk mengoreksi adanya senyawa-senyawa tersebut.

Hasil yang diperoleh dari pengukuran menggunakan spektrofotometer

UV ini ialah absorbansi fraksi protein daun mimba (tabel I) dan kadar protein


31

dihitung berdasarkan perhitungan kadar protein dari Layne cit Richterich &

Colombo (1981).

Tabel I. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm

Fraksi protein daun mimba

Absorbansi pada λ 280 nm

Absorbansi pada λ 260 nm

Konsentrasi fraksi protein daun mimba

(mg/ml) FP30 0,223 0,245 15,95

FP40 0,195 0,276 9,25

FP50 0,203 0,214 15,20

FP60 0,542 0,641 35,29

`Pada penelitian ini, pengukuran kadar protein dilakukan dengan

spektrofotometri UV karena protein mengandung beberapa kromofor penting

seperti fenilalanin, tirosin dan triptofan yang mampu menyerap sinar UV. Selain

itu pengukuran kadar protein menggunakan metode spektrofotometri UV mudah

dilakukan, hanya membutuhkan sedikit sampel dan tidak membutuhkan reagen.

F. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba

Uji sitotoksisitas dilakukan untuk mengetahui layak atau tidaknya suatu

senyawa digunakan sebagai senyawa antikanker. Dipilih metode MTT karena

metode ini cukup baik, mudah, cepat, akurat, tidak menggunakan bahan

radioaktif, dan sensitif karena mampu menghitung jumlah sel yang sedikit.


32

sel Myeloma sel Vero

Gambar 1. Sel Myeloma dan Sel Vero tanpa perlakuan

Pada penelitian ini, seri kadar yang digunakan sebanyak 11 konsentrasi

dengan konsentrasi tertinggi 200 µg/ml dan konsentrasi terendah 0,20 µg/ml.

Absorbansi dari sel diukur pada panjang gelombang 550 nm. Semakin banyak sel

yang masih hidup maka akan semakin banyak intensitas warna ungu yang

dihasilkan. Hal ini akan berbanding lurus dengan nilai absorbansi yang terbaca

pada ELISA Reader.

i i

ii

ii

sel Myeloma sel Vero

Gambar 2. Sel Myeloma dan sel Vero yang diberi perlakuan fraksi protein daun mimba keterangan: (i) sel myeloma yang hidup (ii) sel myeloma yang mati


33

Pada penelitian dilakukan pula pengukuran absorbansi pada perlakuan

tanpa sel yang akan digunakan sebagai faktor koreksi untuk mengurangi adanya

pengaruh fraksi protein yang berwarna terhadap absorbansi. Dengan adanya faktor

koreksi ini diharapkan absorbansi yang terbaca merupakan absorbansi yang

sebenarnya yang dihasilkan oleh sel yang tetap hidup setelah pemberian senyawa

uji tanpa adanya pengaruh dari warna senyawa uji yang digunakan. Hasil uji

sitotoksisitas yang diperoleh yaitu berupa persen kematian sel yang didapatkan

dengan menggunakan modifikasi rumus Abbot, tampak pada tabel berikut ini.

Tabel II. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel Myeloma

Rata-rata Persen Kematian Sel ( % ) Konsentrasi fraksi protein daun mimba

(µg/ml) FP30 FP40 FP50 FP60

0,20 46,88 40,40 52,67 48,13

0,39 52,49 45,83 50,62 50,09

0,78 49,76 44,92 47,79 47,26

1,56 51,84 43,84 46,65 48,34

3,13 57,22

49,08 47,48 48,45

6,25 69,25 43,22 45,10 47,95

12,5 52,51 51,70 47,23 50,29

25 62,46 63,85 50,71 55,62

50 82,07 76,51 52,92 69,37

100 91,64 86,99 67,84 75,75

200 90,20 89,52 82,60 85,66


34

Grafik konsentrasi vs % Kematian Sel Myeloma

30

40

50

60

70

80

90

100

0.20 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 100.00 200.00Konsentrasi fraksi protein

% Kematian

fp 30%

fp 40%

fp 50%

fp 60%

FP30 FP60

FP50

FP40

Gambar 3. Persen kematian sel myeloma vs konsentrasi fraksi protein daun mimba

Dari tabel II dan gambar 3 dapat dilihat bahwa terdapat hubungan yang

linier antara konsentrasi fraksi protein daun mimba dengan persen kematian sel

Myeloma. Hal tersebut dapat dibuktikan dengan semakin tingginya konsentrasi

fraksi protein daun mimba maka semakin tinggi pula persen kematian sel

Myeloma. Namun pada grafik FP30, terlihat persen kematian sel yang naik turun

seiring dengan kenaikan konsentrasi fraksi protein daun mimba. Terdapat banyak

kemungkinan yang bisa menyebabkan hal tersebut antara lain yaitu digunakannya

subyek uji berupa sel yang pertumbuhan dan kematiannya dipengaruhi oleh

banyak faktor. Kematian sel tidak hanya disebabkan karena perlakuan dengan

fraksi protein daun mimba, akan tetapi dapat pula disebabkan karena proses

kematian alami sel. Kemungkinan lain yang dapat terjadi yaitu karena pengaruh

kondisi penelitian dimana uji ini sangat rentan terhadap kontaminasi lingkungan.


35

Tabel III. Hasil uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel Vero

Rata-rata Persen Kematian Sel ( % ) Konsentrasi fraksi protein daun mimba

(µg/ml) FP30 FP40 FP50 FP60

0,20 63,66 82,75 56,37 59,73

0,39 68,93 79,64 58,01 65,33

0,78 67,71 85,06 52,51 58,44

1,56 69,34 75,84 64,14 59,39

3,13 76,81 77,03 63,26 68,72

6,25 82,06 70,07 75,08 70,29

12,5 78,38 66,81 85,41 72,59

25 85,49 79,22 76,59 75,00

50 90,60 85,14 72,48 75,29

100 79,88 75,42 73,79 85,57

200 89,50 74,41 71,88 84,35

Grafik konsentrasi vs % Kematian Sel Vero

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

0.20 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.50 25.00 50.00 100.00 200.00

Konsentrasi fraksi protein

% Kematian

fp 30%

fp 40%

fp 50%

fp 60%

FP30

FP50

FP 40

FP 60

Gambar 4. Persen kematian sel vero vs konsentrasi fraksi protein daun mimba


36

Dari tabel III dan gambar 4 dapat dilihat bahwa persen kematian sel naik

turun sehingga tidak dapat ditarik suatu korelasi yang dapat menyatakan aktivitas

sitotoksik dari fraksi protein daun mimba yang digunakan. Seperti halnya yang

terjadi pada sel myeloma, kematian sel vero yang naik turun tersebut

kemungkinan disebabkan karena adanya kematian alami sel dan kondisi

penelitian.

Selanjutnya ditentukan nilai LC50 yang dilakukan dengan analisa probit

menggunakan SPSS 13. Penentuan nilai LC50 ini bertujuan untuk mengetahui

ketoksikan fraksi protein daun mimba terhadap sel myeloma dan sel vero. Dari

hasil pengolahan data, diperoleh harga LC50 sebagai berikut ini.

Tabel IV. Harga LC50 fraksi protein daun mimba pada sel myeloma

Fraksi protein Harga LC50 (µg/ml)

FP30 0,714

FP40 2,040

FP50 1,885

FP60 1,486

Tabel V. Harga LC50 fraksi protein daun mimba pada sel vero

Fraksi protein Harga LC50 (µg/ml)

FP30 0,014

FP40 > 1 g/ml

FP50 0,033

FP60 0,048


37

Semakin kecil harga LC50 maka senyawa semakin bersifat toksik,

sebaliknya semakin besar harga LC50 maka semakin bersifat tidak toksik (Meyer

et al, 1982). Dari data di atas dapat dilihat bahwa pada sel myeloma, nilai LC50

paling kecil dimiliki oleh FP30, yang berarti FP30 bersifat sangat toksik. Suatu

senyawa dikatakan memiliki aktivitas sebagai antikanker bila memiliki nilai LC50

lebih kecil dari 20 µg/ml (Suffness and Pezzuto, 1991). Apabila dilihat dari nilai

LC50; FP30, FP40, FP50 dan FP60 memiliki nilai LC50 lebih kecil dari 20 µg/ml,

sehingga bisa dikembangkan sebagai senyawa antikanker.

Sedangkan untuk sel vero, nilai LC50 paling kecil juga dimiliki oleh

FP30, yang berarti fraksi protein tersebut bersifat sangat toksik. Namun pada FP50

dan FP60 juga memberikan nilai LC50 yang tidak jauh berbeda dengan nilai LC50

FP30. Dari data di atas dapat dilihat bahwa fraksi protein daun mimba juga bersifat

toksik pada sel vero. Hal ini dapat menjadi penghambat untuk mengembangkan

fraksi protein daun mimba sebagai senyawa antikanker. Dilakukan pula uji

Kolmogorov-Smirnov yang bertujuan untuk membandingkan tingkat kesesuaian

sampel dengan suatu distribusi tertentu. Hasil dari uji Kolmogorov-Smirnov

menunjukkan bahwa semua fraksi protein baik pada sel myeloma maupun sel vero

memiliki distribusi normal (α > 0,05).

Selanjutnya dilakukan penghitungan nilai r pada taraf kepercayaan 95%.

Untuk sel myeloma diperoleh hasil bahwa pada semua fraksi (FP30, FP40, FP50 dan

FP60) memiliki kolerasi yang linier antara konsentrasi dengan persen kematian

(rhitung > rtabel), sedangkan pada sel vero hanya FP40 saja yang tidak memiliki

kolerasi yang linier antara konsentrasi dengan persen kematian (rhitung < rtabel).


38

Dilakukan pengolahan data dengan statistik uji T sampel independen

(independent-samples T Test) untuk melihat perbedaan antara persen kematian sel

Myeloma dengan sel Vero karena pemaparan fraksi protein daun mimba. Pada

FP30, FP50, dan FP60 menunjukkan bahwa LC50 sel Myeloma berbeda bermakna

dengan LC50 sel Vero (sig. < 0,05), yang berarti terdapat perbedaan respon antara

sel Myeloma dengan sel Vero karena adanya fraksi protein daun mimba. Hal

tersebut memungkinkan FP30, FP50, dan FP60 untuk dikembangkan sebagai

senyawa antikanker. Akan tetapi apabila membandingkan nilai LC50 antara sel

Myeloma dengan sel Vero, FP30, FP50, dan FP60 tidak memiliki potensi untuk

dikembangkan sebagai senyawa antikanker. Hal tersebut dapat dibuktikan dengan

melihat nilai LC50 pada sel vero yang nilainya lebih kecil daripada pada sel

myeloma yang berarti bahwa FP30, FP50, dan FP60 bersifat lebih toksik terhadap

sel vero (sel normal) daripada terhadap sel myeloma (sel kanker).

FP40 menunjukkan bahwa LC50 sel Myeloma berbeda tidak bermakna

dengan LC50 sel Vero. Hal ini berarti fraksi protein daun mimba FP40 memiliki

kemampuan yang sama untuk menginduksi kematian sel Myeloma dan sel Vero

sehingga FP40 diduga tidak dapat dikembangkan sebagai antikanker.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Harga LC50 fraksi protein daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 terhadap sel

myeloma berturut-turut sebesar 0,71 μg/ml; 2,04 μg/ml; 1,88 μg/ml; dan 1,48

μg/ml.

2. Harga LC50 fraksi protein daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 terhadap sel

vero berturut-turut sebesar 0,014 μg/ml; > 1 g/ml; 0,033 μg/ml; dan 0,048

μg/ml.

3. Fraksi protein daun mimba FP30 memiliki efek sitotoksik paling besar

terhadap sel myeloma.

4. Fraksi protein daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 memiliki daya sitotoksik

terhadap sel vero.

5. Fraksi protein daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 tidak berpotensi untuk

dikembangkan sebagai senyawa antikanker.

B. Saran

1. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui mekanisme kematian sel myeloma.

2. Perlu dilakukan uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba dengan waktu

inkubasi lebih dari 24 jam.

39


DAFTAR PUSTAKA Albert, B., P., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. dan Watson, J.D., 1994, Molecular

Biology of The Cell, Third Edition, Garland Publishing Inc., New York Alexander, Renee R., 1985, Basic Biochemical Method, John Willey & Sons Inc.,

New York Anonim, 1983, American Type Culture Collection Catalogue of Strain II, Fourth

Ed, Liss.Inc., New York, 61,107,145

Anonim, 1985, Tanaman Obat Indonesia, Jilid II, Departemen Kesehatan RI, Jakarta

Anonim, 2003, What You Need to Know About Multiple Myeloma, http://www.cancer.gov/cancerinfo/wyntk/myeloma, November 2006

Anonim, 2004, www.indoneem.com/html/product/index, diakses pada Desember

2005 Anonim, 2005, Multiple Myeloma research foundation,

http://www.multiplemyeloma.org/about_myeloma/indexhtml, diakses November 2006

Anonim, 2006, Methods for Concentrating Protein Solutions,

http://sbio.uct.ac.za/Sbio/documentation/Protein%20Concentration.html, diakses tanggal 22 November 2006

Backer, C.A. dan Bakhuizen Van Den Brink, R.C., 1965, Flora of Java, N.V.P.

Noordhoof, Groningen. Barille, F.A., 1997, In Vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic

Press, Valencia, Spanyol, 2-3, 34-43 Candra, 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A.

Juss) Hasil Pengendapan dengan Amonium Sulfat 30%, 60% dan 100% Jenuh Terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Franks L.M., and Teich N.M., 1997, Introduction to the Cellular Biology of

Cancer, 3 ed, Oxford University Press, Oxford, 1-7 Freshney, R.I, 1986, Animal Cell Culture, a practical approach, second edition,

IRL Press Ltd, Washington DC.

40


41

Ganiswara, S.G dan Nafrialdi, 1995, Antikanker, Farmakologi dan Terapi, Edisi 5, editor Sulistia Gan dkk, Fakultas Kedokteran Umum Universitas Indonesia, Jakarta

Hariadi, A., 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica

A. Juss) Hasil Pengendapan dengan Amonium Sulfat 30%, 60% dan 100% Jenuh Terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Hutapea, J.R., 1993, Inventoris Tanaman Obat Indonesia, Jilid II, Departemen

Kesehatan RI, Jakarta

Jakoby, W.B., and Pastan, I.H., Methods in Enzymology Cell Culture, Vol.LVIII, Academic Press Inc, New York

Kardinan, A dan Taryono, 2003, Tanaman Obat Penggempur Kanker, PT

Agromdia Pustaka, Jakarta, 22-29

Katzung, B.G., 1989, Basic and Clinical Pharmacology, Fourth Ed, Prentice- Hall International Inc, USA

Keating, K., B., 1999, Neem: The Miracolous Healing Herb, http://www.

NEEM.com / Azadirachta indica/ neem.Htm Kerese, Istvan, 1984, Methods of Protein Analysis, John Willey & Sons Inc., New

York Kimball, J.W., 1988, Biologi, diterjemahkan oleh H. Siti Soetarmi Tjitrosomo,

Nawangsari Sugiri, ed 5, Erlangga, Jakarta Kuswibawati, L., 2000, Apa Itu Kanker, Kanker, Universitas Sanata Dharma,

Yogyakarta, 2-5 Macdonald F. and Ford C.H.J., 1997, Molecular Biology of Cancer, edisi I, 1-2

Bios Scientific Publisher Ltd, Oxford OX4 IRE, UK

Meyer, B.N., Ferrigni, N.R, Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nichols, D.E., Mc Laughlin, J.L., 1982, Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituents, Vol. 45, Planta Medica, 31-34

Poedjiadi, A., 1994, Dasar- Dasar Biokimia, Universitas Indonesia Press, Jakarta Rahmawati, N., 2004, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta

indica A. Juss) terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta


42

Richterich, R., Colombo, J.P., 1981, Clinical Chemistry Theory, Practice, and Interpretation, 408, John Wiley & Sons, Ltd., New York

Robbyono, 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica

A. Juss) Hasil Pengendapan dengan Amonium Sulfat 30%, 60% dan 100% Jenuh Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Robinson, T., 1991, Kandungan Kimia Organik Tumbuhan Tinggi, diterjemahkan

oleh Padmawinata, penerbit ITB, Bandung

Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Jilid 1, 2, dan 3, 22nd ed, Cold Spring Harbor laboratory Press

Scopes, R.K., 1994, Protein Purification, Principles and Practice, 2nd edition,

Jeringer- Verleg, New York Soedibyo, M., Alam Sumber Kesehatan, Manfaat dan Kegunaan, cet I, Balai

Pustaka, Jakarta Suffness, M., and Pezzuto, J., 1991, Assay Related to Cancer Drug Discovery

Methods in Plant Biochemistry: Assay aBioactivity, Volume 6, Academic Ress, London

Sukrasno, 2003, Mimba Tanaman Obat Multifungsi, Agromedia Pustaka, Jakarta


43

Lampiran 1 . Jumlah penambahan amonium sulfat pada derajat kejenuhan

tertentu

Penambahan amonium sulfat dihitung dengan menggunakan rumus:

G = ( )S1 0,3-100)1S(S2335

×−×

Dimana:

S1= % kejenuhan dari larutan awal

S2= % kejenuhan dari larutan akhir

G= gram amonium sulfat yang ditambahkan per liter

Rumus penambahan amonium sulfat di atas hanya dapat diaplikasikan ketika

penambahan amonium sulfat dilakukan pada suhu dingin (± 4oC).

(Anonim, 2006)

• Fraksi protein daun mimba FP30

LgG /70,566100

5330)20()3,0(100

)2030(533=

−=

−−

=

Supernatan 500 ml= gmlmlg 35,28500

100070,56

=×


LgG /57,589100

5330)30()3,0(100

)3040(533=

−=

−−

=


100057,58

=×


44


LgG /57,6012100

5330)40()3,0(100

)4050(533=

−=

−−

=


100057,60

=×


LgG /71,6215100

5330)50()3,0(100

)5060(533=

−=

−−

=


100071,62

=×


45

Lampiran 2 . Absorbansi sel dengan metode MTT Tabel VI. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP 30% terhadap kultur sel

Myeloma

perlakuan (B) perlakuan tanpa sel (C) Kadar fraksi

protein (μg/ml)

I II III IV V Rata-rata

I II III Rata-rata

kontrol (A)

200 0,636 0,619 0,600 0,635 0,626 0,623 0,499 0,525 0,516 0,513 1,041 100 0,609 0,567 0,647 0,600 0,615 0,608 0,469 0,508 0,565 0,514 1,092 50 0,687 0,739 0,778 0,706 0,710 0,724 0,480 0,585 0,505 0,523 1,116 25 0,914 0,909 0,966 0,984 0,949 0,944 0,466 0,618 0,489 0,524 1,147

12,5 0,902 0,965 0,990 1,046 1,039 0,988 0,409 0,467 0,495 0,457 1,199 6,25 0,870 0,830 0,845 0,896 0,906 0,869 0,559 0,502 0,515 0,525 3,13 0,960 1,027 0,973 1,021 1,051 1,006 0,524 0,531 0,528 0,528 1,56 1,022 1,027 1,071 1,023 1,070 1,043 0,489 0,500 0,522 0,504 0,78 1,045 1,052 1,100 1,054 1,098 1,070 0,496 0,503 0,524 0,508 0,39 1,060 1,047 1,070 1,085 0,973 1,047 0,516 0,511 0,519 0,515 0,20 1,128 1,055 1,088 1,143 1,148 1,112 0,508 0,521 0,525 0,518

Rata- rata 1,119 Tabel VII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP 40% terhadap kultur sel

Myeloma

Perlakuan (B) Perlakuan tanpa sel (C) Kadar fraksi

protein (μg/ml)


I II III Rata-rata

Kontrol (A)

200 0,598 0,631 0,654 0,612 0,585 0,616 0,477 0,505 0,528 0,503 1,055 100 0,608 0,603 0,588 0,556 0,621 0,595 0,446 0,464 0,456 0,455 1,067 50 0,693 0,711 0,673 0,697 0,727 0,700 0,441 0,449 0,453 0,448 1,064 25 0,805 0,879 0,870 0,791 0,848 0,839 0,436 0,458 0,456 0,450 1,109

12,5 0,919 1,006 0,988 0,954 0,961 0,966 0,444 0,442 0,453 0,446 1,080 6,25 1,047 1,076 1,050 1,045 1,044 1,052 0,430 0,450 0,446 0,442 3,13 0,952 0,975 1,102 0,964 1,049 1,008 0,436 0,462 0,485 0,461 1,56 1,043 1,069 1,089 1,071 1,078 1,070 0,439 0,474 0,486 0,466 0,78 1,041 1,048 1,102 1,119 1,062 1,074 0,469 0,478 0,500 0,482 0,39 1,136 0,997 1,088 1,055 1,104 1,076 0,473 0,498 0,510 0,494 0,20 1,081 1,119 1,183 1,196 1,173 1,150 0,488 0,515 0,526 0,510

Rata- rata 1,075


46

Tabel VIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP 50% terhadap kultur sel Myeloma

Perlakuan (B) Perlakuan tanpa sel (C) Kadar

fraksi protein (μg/ml)


I II III Rata-rata

Kontrol (A)

200 0,699 0,645 0,658 0,621 0,678 0,660 0,456 0,473 0,478 0,469 1,180 100 0,795 0,783 0,824 0,808 0,827 0,807 0,448 0,450 0,464 0,454 1,065 50 0,941 0,971 0,976 0,964 0,985 0,967 0,437 0,453 0,460 0,450 1,125 25 0,984 0,986 1,067 0,978 0,962 0,995 0,446 0,459 0,456 0,454 1,045

12,5 1,030 1,023 1,019 1,055 1,081 1,042 0,446 0,475 0,464 0,462 1,080 6,25 1,053 1,096 1,095 1,054 1,122 1,084 0,458 0,471 0,513 0,481 3,13 1,074 1,098 1,071 1,048 1,090 1,076 0,479 0,494 0,524 0,499 1,56 1,112 1,122 1,000 1,083 1,088 1,081 0,479 0,490 0,515 0,495 0,78 1,077 1,079 1,061 1,124 1,038 1,076 0,487 0,502 0,517 0,502 0,39 1,039 1,054 1,084 1,035 1,035 1,049 0,484 0,507 0,529 0,507 0,20 1,051 1,048 1,074 1,016 1,002 1,038 0,504 0,510 0,540 0,518

Rata- rata 1,099 Tabel IX. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP 60% terhadap kultur sel

Myeloma


protein (μg/ml)


I II III Rata-rata

Kontrol (A)

200 0,678 0,617 0,655 0,584 0,684 0,644 0,471 0,487 0,491 0,483 1,048 100 0,707 0,722 0,735 0,743 0,733 0,728 0,455 0,459 0,455 0,456 1,173 50 0,796 0,773 0,814 0,814 0,795 0,798 0,442 0,463 0,461 0,455 1,104 25 0,905 0,915 0,917 0,965 0,882 0,917 0,451 0,459 0,349 0,420 1,144

12,5 0,996 1,004 1,032 1,066 0,971 1,014 0,442 0,453 0,476 0,457 1,132 6,25 1,058 1,067 1,064 1,021 1,057 1,053 0,457 0,472 0,482 0,470 3,13 1,071 1,070 1,111 1,083 1,074 1,082 0,502 0,491 0,520 0,504 1,56 1,089 1,061 1,138 1,131 1,063 1,096 0,495 0,538 0,520 0,518 0,78 1,091 1,129 1,107 1,072 1,080 1,096 0,497 0,506 0,512 0,505 0,39 1,118 1,105 1,146 0,931 1,107 1,081 0,515 0,520 0,532 0,522 0,20 1,103 1,114 1,106 1,070 1,109 1,100 0,504 0,527 0,527 0,519

Rata- rata 1,120 Keterangan tabel VI, VII, VIII, IX :

A = Sumuran berisi medium RPMI 1640, buffer natrium fosfat 5mM, dan sel

myeloma tanpa perlakuan fraksi protein daun mimba.

B = Sumuran berisi medium RPMI 1640, buffer natrium fosfat 5mM, dan sel

myeloma dengan perlakuan fraksi protein daun mimba.


47

C = Sumuran berisi medium RPMI 1640, buffer natrium fosfat 5mM, dan fraksi

protein daun mimba tanpa adanya sel myeloma.

Persen kematian sel dihitung dengan rumus:

% Kematian = 100% x A

C)(BA −−

Keterangan rumus:

A = Rata-rata absorbansi kontrol

B = Rata-rata absorbansi perlakuan

C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa sel

Tabel X. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP 30% terhadap kultur sel

Vero


protein (μg/ml)


I II III Rata-rata

Kontrol (A)

200 0,847 0,751 0,720 0,700 0,707 0,745 0,601 0,793 0,555 0,650 1,020 100 0,783 0,708 0,835 0,724 0,752 0,760 0,577 0,593 0,563 0,578 0,880 50 0,753 0,785 0,837 0,793 0,779 0,789 0,578 0,811 0,723 0,704 0,811 25 0,749 0,739 0,802 0,773 0,766 0,766 0,699 0,586 0,617 0,634 1,098

12,5 0,776 0,830 0,784 0,793 0,812 0,799 0,566 0,603 0,639 0,603 0,732 6,25 0,824 0,814 0,807 0,746 0,782 0,795 0,557 0,680 0,658 0,632 3,13 1,034 0,798 0,818 0,927 0,796 0,875 0,598 0,604 0,790 0,664 1,56 1,153 0,821 0,851 0,833 0,766 0,885 0,565 0,641 0,613 0,606 0,78 1,097 0,957 0,838 0,772 0,794 0,892 0,558 0,593 0,644 0,598 0,39 0,886 0,796 0,857 1,167 0,798 0,901 0,596 0,648 0,612 0,619 0,20 0,868 0,850 0,840 1,185 0,854 0,919 0,589 0,568 0,593 0,583

Rata- rata 0,908


48

Tabel XI. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP 40% terhadap kultur sel Vero




I II III Rata-rata

Kontrol (A)

200 0,804 0,763 0,737 0,758 0,781 0,769 0,562 0,550 0,551 0,554 0,843 100 0,754 0,753 0,782 0,746 0,709 0,749 0,515 0,553 0,561 0,543 0,834 50 0,696 0,671 0,818 0,691 0,693 0,714 0,640 0,549 0,579 0,589 0,866 25 0,759 0,727 0,905 0,599 0,695 0,737 0,552 0,562 0,575 0,563 0,833

12,5 0,791 0,780 1,091 0,768 0,713 0,829 0,522 0,549 0,581 0,551 0,811 6,25 0,762 0,790 1,027 0,764 0,730 0,815 0,541 0,554 0,579 0,564 3,13 0,786 0,741 0,764 0,755 0,744 0,758 0,548 0,582 0,567 0,566 1,56 0,822 0,753 0,721 0,757 0,742 0,759 0,524 0,568 0,578 0,557 0,78 0,815 0,783 0,856 0,753 0,767 0,795 0,679 0,561 0,769 0,670 0,39 0,813 0,762 0,759 0,815 0,770 0,784 0,552 0,560 0,728 0,613 0,20 0,799 0,788 0,768 0,776 0,788 0,784 0,489 0,831 0,598 0,639

Rata- rata 0,837

Tabel XII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP 50% terhadap kultur sel Vero




I II III Rata-rata

Kontrol (A)

200 0,845 0,766 0,750 0,744 0,790 0,779 0,570 0,505 0,486 0,520 1,058 100 0,742 0,751 0,767 0,772 0,847 0,776 0,552 0,572 0,480 0,535 0,911 50 0,788 0,746 0,736 0,763 0,743 0,755 0,529 0,486 0,491 0,502 0,901 25 0,747 0,771 0,787 0,726 0,736 0,753 0,540 0,481 0,593 0,538 0,849

12,5 0,779 0,764 0,757 0,724 0,744 0,754 0,544 0,665 0,649 0,619 0,881 6,25 0,878 0,794 0,803 0,886 0,792 0,831 0,594 0,500 0,710 0,601 3,13 1,020 0,833 0,810 0,866 0,796 0,865 0,548 0,515 0,518 0,527 1,56 0,956 0,851 0,832 0,707 0,822 0,834 0,486 0,518 0,507 0,504 0,78 1,114 0,834 0,870 1,134 0,786 0,948 0,504 0,518 0,510 0,511 0,39 0,810 0,890 0,871 1,177 0,847 0,919 0,522 0,550 0,526 0,533 0,20 0,859 0,849 0,824 1,132 0,828 0,898 0,497 0,496 0,498 0,497

Rata- rata 0,920


49

Tabel XIII. Hasil Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP 60% terhadap kultur sel Vero




I II III Rata-rata

Kontrol (A)

200 0,714 0,760 0,743 0,719 0,718 0,731 0,469 0,551 0,722 0,581 1,160 100 0,778 0,769 0,767 0,751 0,694 0,752 0,435 0,707 0,698 0,613 0,940 50 0,763 0,742 0,746 0,750 0,683 0,737 0,454 0,514 0,531 0,500 0,938 25 0,770 0,739 0,713 0,717 0,702 0,728 0,458 0,478 0,529 0,488 0,900

12,5 0,800 0,798 0,765 0,683 0,704 0,750 0,447 0,466 0,548 0,487 0,860 6,25 0,799 0,745 0,786 0,846 0,721 0,779 0,463 0,458 0,562 0,494 3,13 0,830 0,869 0,806 0,949 0,697 0,830 0,483 0,503 0,604 0,530 1,56 0,862 0,834 0,881 1,218 0,745 0,908 0,472 0,504 0,579 0,518 0,78 1,109 0,870 0,915 0,987 0,813 0,939 0,491 0,525 0,604 0,540 0,39 1,118 0,870 0,818 0,855 0,856 0,903 0,540 0,563 0,609 0,571 0,20 1,086 0,864 0,886 0,948 0,788 0,914 0,490 0,510 0,584 0,528

Rata- rata 0,960

Keterangan tabel X, XI, XII, XIII:

A = Sumuran berisi medium M199, buffer natrium fosfat 5mM, dan sel Vero

tanpa perlakuan fraksi protein daun mimba.

B = Sumuran berisi medium M199, buffer natrium fosfat 5mM, dan sel Vero

dengan perlakuan fraksi protein daun mimba.

C = Sumuran berisi medium M199, buffer natrium fosfat 5mM, dan fraksi protein

daun mimba tanpa adanya sel Vero.

Persen kematian sel dihitung dengan rumus:

% Kematian = 100% x A

C)(BA −−

Keterangan rumus dan tabel:

A = Rata-rata absorbansi kontrol

B = Rata-rata absorbansi perlakuan

C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa sel


50

Lampiran 3. Cara Perhitungan Konsentrasi Protein

Konsentrasi protein dihitung dengan menggunakan rumus:

Konsentrasi = ([1,55 x E(280)] – [0,76 x E(260)] x faktor pengenceran) mg/ml

Keterangan: E(280) = absorbansi pada λ 280 nm

E(260) = absorbansi pada λ 260 nm

(Layne cit Richterich & Colombo, 1981)

Tabel XIV. Data absorbansi fraksi protein dengan menggunakan metode spektrofotometer UV dan rasio serapan pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm

Fraksi

protein daun mimba

Absorbansi pada λ 280

nm

Absorbansi pada λ 260

nm FP30 0,223 0,245 FP40 0,195 0,276 FP50 0,203 0,214 FP60 0,542 0,641

a. Fraksi protein daun mimba FP30

Konsentrasi protein = [([1,55 x 0,223] – [0,76 x 0,245]) x 100] mg/ml

= 15,95 mg/ml

b. Fraksi protein daun mimba FP40


= 9,25 mg/ml


51

c. Fraksi protein daun mimba FP50


= 15,20 mg/ml

d. Fraksi protein daun mimba FP60


= 35,29 mg/ml


52

Lampiran 4. Hasil analisis probit fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel myeloma dengan metode MTT

FP30 myeloma Probit * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 1 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 8 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr ,42034 ,04351 9,66106 Intercept Standard Error Intercept/S.E. ,06143 ,04958 1,23905 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 36,729 DF = 9 P = ,000 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies


53

Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -,71 100,0 46,9 40,644 6,237 ,40644 -,41 100,0 52,5 45,614 6,874 ,45614 -,11 100,0 49,8 50,653 -,888 ,50653 ,19 100,0 51,8 55,682 -3,844 ,55682 ,49 100,0 57,2 60,620 -3,403 ,60620 ,80 100,0 69,3 65,394 3,858 ,65394 1,10 100,0 52,5 69,934 -17,423 ,69934 1,40 100,0 62,5 74,185 -11,724 ,74185 1,70 100,0 82,1 78,100 3,967 ,78100 2,00 100,0 91,6 81,650 9,985 ,81650 2,30 100,0 90,2 84,818 5,382 ,84818 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper ,01 ,00000 3,81896E-012 ,00025 ,02 ,00001 6,44265E-011 ,00069 ,03 ,00002 3,86540E-010 ,00131 ,04 ,00005 1,48685E-009 ,00214 ,05 ,00009 4,44593E-009 ,00319 ,06 ,00014 ,00000 ,00447 ,07 ,00022 ,00000 ,00603 ,08 ,00032 ,00000 ,00787 ,09 ,00046 ,00000 ,01004 ,10 ,00064 ,00000 ,01256 ,15 ,00244 ,00000 ,03190 ,20 ,00711 ,00002 ,06727 ,25 ,01775 ,00010 ,12839 ,30 ,04039 ,00045 ,23110 ,35 ,08653 ,00185 ,40225 ,40 ,17829 ,00695 ,68976 ,45 ,35884 ,02450 1,18557 ,50 ,71425 ,08203 2,08602 ,55 1,42167 ,26005 3,87685


54

,60 2,86131 ,76367 8,00341 ,65 5,89563 2,00460 19,63716 ,70 12,62998 4,65274 60,23986 ,75 28,73865 9,97282 233,74484 ,80 71,79161 21,13312 1166,87294 ,85 208,70532 47,59239 8101,11125 ,90 799,23009 126,28080 97093,25508 ,91 1105,39476 159,15529 177660,59975 ,92 1572,26948 204,36777 342946,15267 ,93 2316,16354 268,68024 707742,68155 ,94 3570,01009 364,20253 1591803,07821 ,95 5847,50544 514,48408 4017936,97866 ,96 10441,11676 770,77097 11943906,2021 ,97 21294,81784 1264,45890 45672744,7683 ,98 54920,70692 2435,42500 272339863,758 ,99 244484,57035 6814,02658 4562144281,41 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.0

0.5

0.0

Prob

it

Probit Transformed Responses

R Sq Linear = 0.754


55

Probit FP40 myeloma * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 7 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .45379 .04304 10.54430 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -.14332 .05004 -2.86413 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 34.636 DF = 9 P = .000 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob


56

-.70 100.0 40.4 32.258 8.139 .32258 -.40 100.0 45.8 37.301 8.529 .37301 -.10 100.0 44.9 42.572 2.352 .42572 .20 100.0 43.8 47.979 -4.134 .47979 .49 100.0 49.1 53.237 -4.158 .53237 .80 100.0 43.2 58.622 -15.404 .58622 1.10 100.0 51.7 63.850 -12.154 .63850 1.40 100.0 63.9 68.831 -4.979 .68831 1.70 100.0 76.5 73.489 3.020 .73489 2.00 100.0 87.0 77.764 9.225 .77764 2.30 100.0 89.5 81.617 7.902 .81617 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 .00002 1.37911E-009 .00072 .02 .00006 .00000 .00193 .03 .00015 .00000 .00360 .04 .00029 .00000 .00576 .05 .00049 .00000 .00846 .06 .00078 .00000 .01172 .07 .00116 .00000 .01562 .08 .00166 .00000 .02020 .09 .00230 .00001 .02554 .10 .00310 .00001 .03170 .15 .01076 .00010 .07791 .20 .02892 .00056 .16040 .25 .06753 .00233 .30059 .30 .14462 .00836 .53407 .35 .29289 .02687 .92305 .40 .57217 .07972 1.58445 .45 1.09372 .22096 2.76065 .50 2.06929 .57237 5.01987 .55 3.91506 1.36988 9.87970 .60 7.48371 2.99254 21.84140 .65 14.61985 6.01573 55.32118 .70 29.60943 11.49616 160.89812 .75 63.41293 21.74939 541.43536 .80 148.07478 42.43601 2179.86137


57

.85 397.90885 89.76916 11388.48048 .90 1380.20677 224.91025 93423.54239 .91 1863.84288 280.06526 155705.82538 .92 2583.10440 355.12794 271433.68124 .93 3698.15077 460.69502 500511.67925 .94 5521.23769 615.55049 992204.10653 .95 8720.54186 855.80774 2167526.30392 .96 14919.82331 1259.03314 5434386.15795 .97 28872.09378 2021.04622 16845264.1675 .98 69440.90745 3784.62496 75926557.7191 .99 276907.45166 10141.21679 817313047.233 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.5

1.0

0.5

0.0

Prob

it


R Sq Linear = 0.787


58

FP50 myeloma Probit * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 1 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 5 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .18675 .04032 4.63113 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -.05143 .04928 -1.04360 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 32.567 DF = 9 P = .000 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob


59

-.71 100.0 52.7 42.705 9.961 .42705 -.41 100.0 50.6 44.921 5.695 .44921 -.11 100.0 47.8 47.152 .637 .47152 .19 100.0 46.6 49.392 -2.744 .49392 .49 100.0 47.5 51.635 -4.155 .51635 .80 100.0 45.1 53.872 -8.770 .53872 1.10 100.0 47.2 56.097 -8.866 .56097 1.40 100.0 50.7 58.302 -7.596 .58302 1.70 100.0 52.9 60.482 -7.561 .60482 2.00 100.0 67.8 62.630 5.214 .62630 2.30 100.0 82.6 64.739 17.863 .64739 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 6.57906E-013 5.87071E-183 .00000 .02 1.89621E-011 2.38333E-162 .00001 .03 1.59969E-010 2.83160E-149 .00002 .04 7.95682E-010 1.93794E-139 .00005 .05 2.93397E-009 1.93777E-131 .00010 .06 8.90880E-009 1.24815E-124 .00018 .07 .00000 1.16458E-118 .00029 .08 .00000 2.57806E-113 .00047 .09 .00000 1.87185E-108 .00071 .10 .00000 5.57981E-104 .00104 .15 .00001 1.85796E-085 .00511 .20 .00006 9.67222E-071 .01832 .25 .00046 4.02943E-058 .05557 .30 .00293 8.51012E-047 .15336 .35 .01629 2.57339E-036 .40523 .40 .08294 2.13501E-026 1.08214 .45 .40039 7.24411E-017 3.25886 .50 1.88530 .00000 18.28174 .55 8.87719 .24568 48308.75833 .60 42.85604 5.68308 2.13390E+013 .65 218.12627 21.09998 1.27335E+023 .70 1211.87845 62.17783 3.45275E+033


60

.75 7711.92108 180.29987 6.94054E+044 .80 60551.45050 561.58267 2.81524E+057 .85 668824.28771 2048.37831 1.44200E+072 .90 13736626.6767 10201.29474 4.74990E+090 .91 28503950.8864 14999.23962 1.41340E+095 .92 62995514.1787 22783.84298 1.02452E+100 .93 150661019.023 36052.39302 2.26442E+105 .94 398969528.932 60142.98405 2.10959E+111 .95 1211444952.56 107718.07780 1.35682E+118 .96 4467033934.04 213416.08527 1.35474E+126 .97 22218973982.7 494037.56253 9.25834E+135 .98 187444016406 1505380.05500 1.09830E+149 .99 5402500285022 8691847.82760 4.45097E+169 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

-0.2

Prob

it


R Sq Linear = 0.407


61

FP60 myeloma Probit * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 1 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 6 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .29645 .04122 7.19109 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -.05101 .04939 -1.03267 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 26.594 DF = 9 P = .002 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob


62

-.71 100.0 48.1 39.694 8.434 .39694 -.41 100.0 50.1 43.171 6.921 .43171 -.11 100.0 47.3 46.701 .558 .46701 .19 100.0 48.3 50.257 -1.921 .50257 .49 100.0 48.4 53.812 -5.362 .53812 .80 100.0 47.9 57.336 -9.386 .57336 1.10 100.0 50.3 60.803 -10.508 .60803 1.40 100.0 55.6 64.185 -8.564 .64185 1.70 100.0 69.4 67.460 1.914 .67460 2.00 100.0 75.7 70.606 5.143 .70606 2.30 100.0 85.7 73.603 12.061 .73603 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 .00000 2.38467E-018 .00002 .02 .00000 2.37854E-016 .00008 .03 .00000 4.40626E-015 .00020 .04 .00000 3.95775E-014 .00038 .05 .00000 2.35889E-013 .00065 .06 .00001 1.07739E-012 .00103 .07 .00002 4.07941E-012 .00153 .08 .00003 1.34328E-011 .00220 .09 .00004 3.96938E-011 .00306 .10 .00007 1.07579E-010 .00414 .15 .00047 6.64658E-009 .01455 .20 .00215 .00000 .03983 .25 .00789 .00000 .09532 .30 .02530 .00003 .21112 .35 .07452 .00035 .44856 .40 .20771 .00300 .94224 .45 .55997 .02301 2.02967 .50 1.48612 .15424 4.77776 .55 3.94401 .83227 13.97287 .60 10.63289 3.19020 60.13941 .65 29.63658 8.99536 386.60263 .70 87.29257 21.98050 3352.05192


63

.75 280.06769 52.31796 37995.31396 .80 1025.73742 130.46161 597613.96251 .85 4657.82010 366.40579 15324503.0144 .90 31262.45466 1311.44700 930439780.947 .91 49514.23589 1780.18523 2514501813.51 .92 81598.95893 2479.21234 7410239399.67 .93 141331.10611 3565.70706 24337628253.9 .94 261014.26468 5346.43508 91922632222.4 .95 525442.32098 8478.43477 418835216039 .96 1195425.15203 14559.63472 2490420019292 .97 3284015.79449 28270.04484 2.23158E+013 .98 12584139.3765 68187.25302 4.12369E+014 .99 104559366.354 272380.56327 4.10129E+016 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

-0.2

Prob

it


R Sq Linear = 0.674


64

Lampiran 5 . Hasil analisis probit fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel vero dengan metode MTT

Probit vero FP30 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 9 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .29311 .04576 6.40487 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .54472 .05200 10.47543 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 9.858 DF = 9 P = .362 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies


65

Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.70 100.0 62.1 63.301 -1.201 .63301 -.40 100.0 68.9 66.570 2.360 .66570 -.10 100.0 67.7 69.718 -2.008 .69718 .20 100.0 69.3 72.726 -3.386 .72726 .49 100.0 76.8 75.451 1.359 .75451 .80 100.0 82.1 78.201 3.859 .78201 1.10 100.0 78.4 80.682 -2.302 .80682 1.40 100.0 85.5 83.008 2.482 .83008 1.70 100.0 90.6 85.146 5.454 .85146 2.00 100.0 79.9 87.096 -7.216 .87096 2.30 100.0 89.5 88.861 .639 .88861 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 1.60248E-010 3.85485E-015 .00000 .02 1.36401E-009 8.41197E-014 .00000 .03 5.30747E-009 5.94631E-013 .00000 .04 .00000 2.58879E-012 .00000 .05 .00000 8.56426E-012 .00000 .06 .00000 2.37080E-011 .00000 .07 .00000 5.78870E-011 .00001 .08 .00000 1.28727E-010 .00001 .09 .00000 2.66256E-010 .00002 .10 .00000 5.19763E-010 .00003 .15 .00000 8.28322E-009 .00011 .20 .00002 .00000 .00036 .25 .00007 .00000 .00099 .30 .00023 .00000 .00246 .35 .00067 .00001 .00572 .40 .00189 .00006 .01277 .45 .00516 .00024 .02789


66

.50 .01385 .00096 .06037 .55 .03718 .00391 .13149 .60 .10137 .01604 .29300 .65 .28587 .06769 .68400 .70 .85245 .29554 1.74574 .75 2.77159 1.29923 5.35607 .80 10.30220 5.33166 23.65380 .85 47.59584 21.15872 174.54042 .90 326.46514 102.23061 2530.17301 .91 519.78153 148.01014 4876.93100 .92 861.48764 220.69896 9973.27566 .93 1501.48892 341.64945 21951.35133 .94 2792.45614 555.37360 53096.81572 .95 5666.45876 964.51118 145714.99179 .96 13013.06170 1840.78104 478142.66998 .97 36163.16206 4064.93775 2065410.01960 .98 140713.80502 11619.20705 14486351.2203 .99 1197734.46689 60565.10860 313433106.367 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

Prob

it


R Sq Linear = 0.801


67

Probit vero FP40* * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 10 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr -.06301 .04458 -1.41353 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .80380 .05602 14.34897 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 17.188 DF = 9 P = .046 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.70 100.0 82.8 80.174 2.576 .80174


68

-.40 100.0 79.6 79.641 -.001 .79641 -.10 100.0 85.1 79.100 5.960 .79100 .20 100.0 75.8 78.551 -2.711 .78551 .49 100.0 77.0 78.019 -.989 .78019 .80 100.0 70.1 77.441 -7.371 .77441 1.10 100.0 66.8 76.873 -10.063 .76873 1.40 100.0 79.2 76.292 2.928 .76292 1.70 100.0 85.1 75.702 9.438 .75702 2.00 100.0 75.4 75.104 .316 .75104 2.30 100.0 74.4 74.499 -.089 .74499 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 4.74176E+049 . . .02 2.23744E+045 . . .03 4.02647E+042 . . .04 3.46815E+040 . . .05 7.25306E+038 . . .06 2.69735E+037 . . .07 1.50478E+036 . . .08 1.13538E+035 . . .09 1.08250E+034 . . .10 1.24412E+033 . . .15 1.60250E+029 . . .20 1.29748E+026 . . .25 2.88867E+023 . . .30 1.19883E+021 . . .35 7.43938E+018 . . .40 5.98548E+016 . . .45 5.63257E+014 . . .50 5707447644009 . . .55 57833183809.9 . . .60 544232632.790 . . .65 4378719.00662 . . .70 27172.23893 . . .75 112.76809 . . .80 .25106 . . .85 .00020 . .


69

.90 .00000 . . .91 3.00922E-009 . . .92 2.86907E-010 . . .93 2.16477E-011 . . .94 1.20767E-012 . . .95 4.49120E-014 . . .96 9.39260E-016 . . .97 8.09020E-018 . . .98 1.45590E-020 . . .99 6.86981E-025 . . Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.1

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

Prob

it


R Sq Linear = 0.103

Probit vero FP50 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested.


70

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 7 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .21055 .04186 5.02950 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .31225 .05026 6.21318 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 20.687 DF = 9 P = .014 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.70 100.0 56.4 56.556 -.186 .56556 -.40 100.0 58.0 59.036 -1.026 .59036 -.10 100.0 52.5 61.480 -8.970 .61480 .20 100.0 64.1 63.879 .261 .63879 .49 100.0 63.3 66.119 -2.859 .66119 .80 100.0 75.1 68.458 6.622 .68458 1.10 100.0 85.4 70.650 14.760 .70650


71

1.40 100.0 76.6 72.793 3.797 .72793 1.70 100.0 72.5 74.856 -2.376 .74856 2.00 100.0 73.8 76.832 -3.042 .76832 2.30 100.0 71.9 78.719 -6.839 .78719 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 2.93630E-013 9.98834E-042 .00000 .02 5.78800E-012 1.16743E-037 .00000 .03 3.83700E-011 4.44407E-035 .00000 .04 1.59201E-010 3.88004E-033 .00000 .05 5.06530E-010 1.47092E-031 .00001 .06 1.35658E-009 3.24517E-030 .00001 .07 3.21796E-009 4.88934E-029 .00002 .08 6.97377E-009 5.54535E-028 .00003 .09 .00000 5.04699E-027 .00005 .10 .00000 3.85309E-026 .00007 .15 .00000 1.73678E-022 .00034 .20 .00000 1.38738E-019 .00123 .25 .00002 4.27107E-017 .00370 .30 .00011 7.29667E-015 .01002 .35 .00049 8.49872E-013 .02535 .40 .00206 7.69813E-011 .06168 .45 .00832 5.94746E-009 .14767 .50 .03288 .00000 .35626 .55 .12995 .00003 .89668 .60 .52510 .00185 2.54069 .65 2.22363 .09872 10.51373 .70 10.17729 1.96991 155.27678 .75 52.54019 11.00901 12842.70136 .80 326.80935 42.42086 3092176.27550 .85 2751.49448 170.76687 2209797860.21 .90 40158.25548 906.83851 9361122076136 .91 76730.12693 1348.85698 7.08038E+013 .92 155039.31091 2072.79892 6.38870E+014 .93 335992.02298 3318.98385 7.18782E+015 .94 797007.26006 5605.61000 1.07479E+017 .95 2134537.51110 10173.76798 2.35422E+018 .96 6791449.95417 20455.62220 8.86304E+019 .97 28178475.6219 48173.75699 7.68528E+021 .98 186801772.470 150024.06753 2.90503E+024 .99 3682214953.45 895131.95606 3.36861E+028 Abbreviated Extended


72

Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

Prob

it


R Sq Linear = 0.497

Probit vero FP60 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 8 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX):


73

Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .26180 .04324 6.05385 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .34429 .05048 6.82077 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 6.649 DF = 9 P = .674 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.70 100.0 59.7 56.407 3.323 .56407 -.40 100.0 65.3 59.488 5.842 .59488 -.10 100.0 58.4 62.510 -4.070 .62510 .20 100.0 59.4 65.458 -6.068 .65458 .49 100.0 68.7 68.187 .533 .68187 .80 100.0 70.3 71.006 -.716 .71006 1.10 100.0 72.6 73.613 -1.023 .73613 1.40 100.0 75.0 76.123 -1.123 .76123 1.70 100.0 75.3 78.497 -3.217 .78497 2.00 100.0 85.6 80.727 4.843 .80727 2.30 100.0 84.4 82.810 1.540 .82810 * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * *


74

Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 6.29293E-011 3.68099E-016 .00000 .02 6.92010E-010 1.27171E-014 .00000 .03 3.16780E-009 1.20312E-013 .00000 .04 9.94800E-009 6.52164E-013 .00000 .05 .00000 2.57852E-012 .00000 .06 .00000 8.30735E-012 .00001 .07 .00000 2.31689E-011 .00001 .08 .00000 5.80363E-011 .00001 .09 .00000 1.33765E-010 .00002 .10 .00000 2.88481E-010 .00003 .15 .00001 6.94263E-009 .00016 .20 .00003 .00000 .00060 .25 .00013 .00000 .00183 .30 .00048 .00001 .00501 .35 .00163 .00003 .01277 .40 .00521 .00017 .03114 .45 .01603 .00090 .07419 .50 .04841 .00449 .17578 .55 .14619 .02208 .42258 .60 .44940 .10813 1.06074 .65 1.43463 .52214 2.93788 .70 4.87518 2.32911 10.12850 .75 18.25131 8.89055 50.66104 .80 79.37686 31.75945 378.47478 .85 440.37952 125.82323 4392.22007 .90 3802.91444 673.50426 101380.24151 .91 6401.16218 1005.81837 217279.60808 .92 11270.20192 1553.30450 497922.61824 .93 20992.40420 2502.14256 1240592.90248 .94 42048.99396 4256.88911 3442623.42927 .95 92862.11113 7795.04979 11038491.2220 .96 235554.67383 15848.08902 43444039.6261 .97 739723.83705 37864.90007 234430132.805 .98 3386219.68728 120318.94483 2207618362.90 .99 37236961.2382 742223.85024 75874183110.4 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi


75

210-1

Log of konsentrasi

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

Prob

it


R Sq Linear = 0.854


76

Lampiran 6 . Uji distribusi Data dengan Kolmogorov-Smirnov pada Sel Myeloma

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test myeloma FP30 LC50 N 5

Mean .7277Normal Parameters(a,b) Std. Deviation .14754

Absolute .193Positive .193

Most Extreme Differences

Negative -.192Kolmogorov-Smirnov Z .432Asymp. Sig. (2-tailed) .992

a Test distribution is Normal. b Calculated from data. One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test myeloma FP40 LC50 N 5

Mean 2.0703Normal Parameters(a,b) Std. Deviation .51499




a Test distribution is Normal. b Calculated from data. One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test myeloma FP50 LC50 N 5





a Test distribution is Normal. b Calculated from data.


77

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test myeloma FP60 LC50 N 5





a Test distribution is Normal. b Calculated from data. One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test vero FP30 LC50 N 5






Mean 3891451956754500

00000000.0000Normal Parameters(a,b) Std. Deviation 77670401

3732445000000000.

00000Absolute .441Positive .441





78

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test vero FP50 LC50 N 5












79

Lampiran 8. Perhitungan Nilai Korelasi LC50 Sel Myeloma dan Sel Vero pada Taraf Kepercayaan 95%

Diketahui nilai korelasi (r) pada tabel untuk taraf kepercayaan 95%:

r = 0,576

• Nilai korelasi FP pada sel myeloma

FP30 r2 = 0,754 r = 0,868

r hitung > r tabel, sehingga kolerasinya linier

FP40 r2 = 0,787 r = 0,887


FP50 r2 = 0,407 r = 0,638


FP60 r2 = 0,674 r = 0,821


• Nilai korelasi FP pada sel Vero

FP30 r2 = 0,801 r = 0,895


FP40 r2 = 0,103 r = 0,321

r hitung < r tabel, sehingga kolerasinya tidak linier

FP50 r2 = 0,497 r = 0,705

t hitung > t tabel, sehingga kolerasinya linier

FP60 r2 = 0,854 r = 0,924

t hitung > t tabel, sehingga kolerasinya linier


80

Lampiran 9 . Hasil Uji Signifikansi LC50 antara Sel Myeloma dan Sel Vero dengan Analisis Statistik T-Test FP30

Group Statistics

5 .0693 .11406 .051015 .7277 .14754 .06598

ve-mye1.002.00

LC50N Mean Std. Deviation

Std. ErrorMean

Independent Samples Test

.826 .390 -7.894 8 .000 -.65841 .08340 -.85073 -.46608

-7.894 7.523 .000 -.65841 .08340 -.85288 -.46394

Equal variancesassumedEqual variancesnot assumed

LC50F Sig.

Levene's Test forEquality of Variances

t df Sig. (2-tailed)Mean

DifferenceStd. ErrorDifference Lower Upper

95% ConfidenceInterval of the

Difference

t-test for Equality of Means


81

T-Test FP40

Group Statistics

5 7E+069 1.5693E+070 7E+0695 2.0703 .51499 .23031

ve-mye1.002.00


Std. ErrorMean


7.111 .029 1.000 8 .347 7.02E+069 7.02E+069 -9E+069 2E+070

1.000 4.000 .374 7.02E+069 7.02E+069 -1E+070 3E+070


LC50F Sig.





Difference



82

T-Test FP50

Group Statistics

5 .2228 .44626 .199575 1.8860 .31545 .14107

ve-mye1.002.00


Std. ErrorMean


.234 .641 -6.805 8 .000 -1.66322 .24440 -2.22681 -1.09963

-6.805 7.199 .000 -1.66322 .24440 -2.23791 -1.08852


LC50F Sig.





Difference



83

T-Test FP60

Group Statistics

5 .2053 .31094 .139065 1.5170 .49606 .22185

ve-mye1.002.00


Std. ErrorMean


.307 .595 -5.010 8 .001 -1.31174 .26183 -1.91551 -.70797

-5.010 6.723 .002 -1.31174 .26183 -1.93607 -.68741


LC50F Sig.





Difference



84

Lampiran 10. Foto tanaman dan daun mimba (Azadirachta indica A. Juss)

Gambar 5. Foto tanaman mimba


85

Gambar 6. foto daun mimba


86

Lampiran 11. foto ELISA reader, Spektrofotometer UV, dan Sentrifuge

Gambar 7. Foto ELISA reader SLT 340ATC

Gambar 8. Foto Spektrofotometer UV


87

Lampiran 9. Foto Sentrifuge K PLC Series


88

88


89

BIOGRAFI PENULIS

Penulis bernama Anastasia Yuli Ekasaptawati

yang lahir pada tanggal 17 Juli 1985 di Cilacap, Jawa

Tengah. Penulis merupakan anak pertama dari pasangan

Bapak Julius Muryanto dan Ibu Aloysia Endang

Susilowati. Tahun 1990 menempuh pendidikan di TK

Maria Immaculata Cilacap kemudian melanjutkan ke

SD Maria Immaculata Cilacap pada tahun 1991 dan

lulus pada tahun 1997. Tahun 1997 sampai tahun 2000

menempuh pendidikan di SLTP Negeri 4 Cilacap. Setelah menyelesaikan

pendidikan SLTP, tahun 2000 melanjutkan ke SMU Negeri 1 Cilacap dan lulus

pada tahun 2003. Tahun 2003 penulis melanjutkan pendidikan S1 di Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji sitotoksisitas fraksi protein … · sitotoksisitas fraksi...

Documents