UJI SITOTOKSISITAS ELLAGIC ACID DALAM EKSTRAK KULIT DAN

BIJI DELIMA DENGAN TIGA VARIASI PELARUT PADA VERO CELL

LINE (PENGEMBANGAN TERAPI DIABETES MELITUS TIPE 2)

SKRIPSI

Untuk Memenuhi Persyaratan

Gelar Sarjana Kedokteran

SURYANINGTYAS MARGI UTAMI

G0014225

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2017

ii

PENGESAHAN

Uji Sitotoksisitas Ellagic Acid dalam Ekstrak Kulit dan Biji Delima

dengan Tiga Variasi Pelarut pada Vero Cell Line (Pengembangan Terapi

Diabetes Melitus Tipe 2)

Suryaningtyas Margi Utami, NIM: G0014225, Tahun: 2017

Telah diuji dan sudah disahkan dihadapan Dewan Penguji Skripsi

Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret

Pembimbing Utama

Nama : Dono Indarto, dr., M. Biotech., St., Ph.D., St.AIFM (……………)

NIP : 196701041996011001

Pembimbing Pendamping

Nama : Ratih Dewi Yudhani, dr., M.Sc. (……………)

NIP : 198407072009122002

Penguji Utama

Nama : Yuliana Heri Suselo, dr., M.Sc. (……………)

NIP : 198007182006042001

Surakarta, ..................

Ketua Tim Skripsi Kepala Program Studi

Kusmadewi Eka Damayanti, dr., M.Gizi Sinu Andhi Jusup, dr., M.Kes.

NIP : 1980509 2008 01 2 005 NIP : 19700607 2001 12 1 002

iii

PERNYATAAN

Dengan ini menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah

diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan

sepanjang pengetahuan saya tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah

ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam

naskah dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Surakarta, Desember 2017

Suryaningtyas Margi Utami

NIM. G0014225

iv

ABSTRAK

Suryaningtyas Margi Utami, G0014225, 2017. Uji Sitotoksisitas Ellagic Acid

dalam Ekstrak Kulit dan Biji Delima dengan Tiga Variasi Pelarut pada Vero Cell

Line (Pengembangan Terapi Diabetes Melitus Tipe 2). Skripsi. Fakultas

Kedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

Latar Belakang: Sodium Glucose Co-transporter 2 (SGLT2) inhibitor

merupakan salah satu terapi alternatif untuk pasien DM tipe 2 yang tidak responsif

terhadap terapi standar. SGLT2 adalah protein transporter yang berperan

mereabsorbsi 90% glukosa di tubulus ginjal. Penelitian in silico melaporkan

bahwa ellagic acid dari buah delima berpotensi sebagai SGLT2 inhibitor. Sebagai

dasar pengembangan potensi SGLT2 inhibitor dari ellagic acid diperlukan

penelitian tentang sitotoksisitas ellagic acid pada sel normal. Penelitian ini

bertujuan untuk mengetahui tingkat sitotoksisitas ekstrak ellagic acid dengan tiga

variasi pelarut terhadap sel Vero.

Metode Penelitian: Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen laboratorium

dengan post test only control group design. Kulit dan biji delima diekstrak

menggunakan etanol, dietil eter, dan air (KEDA dan BEDA), metanol dan air

(KMA dan BMA), serta etil asetat (KEa dan BEa). Kontrol positif menggunakan

dapagliflozin. Uji LC-MS/MS digunakan untuk menentukan konsentrasi ellagic

acid dalam masing-masing ekstrak dan uji 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazolium bromid (MTT) digunakan untuk menentukan sitotoksisitas

masing – masing ekstrak terhadap sel Vero dengan delapan dosis berbeda mulai

dari 0,98 sampai 125 ppm. Analisis probit kemudian digunakan untuk

menentukan IC50.

Hasil Penelitian: Konsentrasi ellagic acid dalam ekstrak kulit dan biji delima

berkisar antara 1,34-1,68 ppm dengan konsentrasi tertinggi pada KMA dan

terendah pada BMA. Ekstrak KEDA memiliki nilai IC50 terendah (527 µM) dan

ekstrak BMA memiliki nilai IC50 tertinggi (231 mM). Ekstrak KMA dan KEa

memiliki konsentrasi ellagic acid paling tinggi, tetapi hanya ekstrak KEa yang

memiliki IC50 setara dengan konsentrasi ellagic acid di dalamnya. Ekstrak KEa

dan BEa memiliki konsentrasi ellagic acid yang berbeda (1,55 dan 1,42 ppm),

tetapi memiliki nilai IC50 yang hampir sama (648 dan 644 µM). KEDA dan

BEDA memiliki konsentrasi ellagic acid yang sama (1,4 ppm) tetapi hanya

KEDA yang memiliki IC50 mendekati IC50 dapagliflozin (406 µM).

Simpulan: Ellagic acid dalam ekstrak delima tidak toksik terhadap sel Vero.

Pelarut etil asetat meningkatkan sitotoksisitas ellagic acid terhadap sel Vero.

Pelarut terbaik untuk ekstraksi delima adalah kombinasi etanol, dietil eter, dan air.

Kata Kunci : diabetes melitus tipe 2, ellagic acid, LC – MS/MS, sitotoksisitas,

ekstrak kulit dan biji delima

v

ABSTRACT

Suryaningtyas Margi Utami, G0014225, 2017. Cytotoxicity Test of Ellagic

Acid in Pomegranate Peels and Seeds Extract with Three Variation of Solvents on

Vero Cell Line (Type 2 Diabetes Mellitus Treatment Development). Mini Thesis.

Faculty of Medicine, Sebelas Maret University, Surakarta.

Background: Sodium Glucose Co-transporter 2 (SGLT2) inhibitor is one of the

alternative therapies for patients with type 2 DM who are unresponsive to the

standard therapy. SGLT2 is a protein transporter that reabsorb 90% glucose in the

renal tubules. In silico study found that ellagic acid in pomegranate is potential as

SGLT2 inhibitor. As a basis for developing the potential of SGLT2 inhibitors

from ellagic acid a study of the cytotoxicity of ellagic acid in normal cells is

needed. The aim of this study to determine the cytotoxicity level of ellagic acid

extract with three variations of solvent to Vero cells.

Methods: This study was an experimental laboratory with post-test only control

group design. Pomegranate peels and seeds were extracted using ethanol, diethyl

ether, and water (KEDA and BEDA), methanol and water (KMA and BMA), and

ethyl acetate (KEa and BEa). The positive control using dapagliflozine. The LC-

MS/MS test was used to determine the concentration of ellagic acid in each

extract and the 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT) test

was used to determine the cytotoxicity of each extract on Vero cells with eight

different doses ranging from 0.98 to 125 ppm. The probit analysis was used to

determine IC50.

Results : The concentration of ellagic acid in pomegranate peels and seeds extract

ranged from 1.34 to 1.68 ppm with the highest concentration in KMA and the

lowest in BMA. KEDA extract had the lowest IC50 value (527 μM) and BMA

extract had the highest IC50 value (231 mM). KMA and KEa extracts had the

highest concentrations of ellagic acid but only the IC50 of KEa extracts that

equivalent to the concentrations of ellagic acid. KEa and BEa extracts had

different concentrations of ellagic acid (1.55 and 1.42 ppm), but had similar IC50

values (648 and 644 μM). KEDA and BEDA had the same concentration of

ellagic acid (1.4 ppm) but only KEDA had IC50 approaching the IC50 of

dapagliflozine (406 μM).

Conclusion : Ellagic acid in pomegranate extract is not toxic to Vero cells. The

ethyl acetate solvent increases the cytotoxicity of ellagic acid against Vero cells.

The best solvent for pomegranate extraction is a combination of ethanol, diethyl

ether, and water.

Keywords : type 2 diabetes mellitus, ellagic acid, LC - MS/MS, cytotoxicity,

pomegranate peels and seeds extract

vi

PRAKATA

Alhamdulillahirobbil’aalaamiin, puji syukur kehadirat Allah SWT, yang

telah memberikan kenikmatan dan kemudahan kepada peneliti sehingga peneliti

dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Sitotoksisitas Ellagic Acid dalam

Ekstrak Kulit dan Biji Delima dengan Tiga Variasi Pelarut pada Vero Cell

Line (Pengembangan Terapi Diabetes Melitus Tipe 2)”. Peneliti menyadari

bahwa skripsi ini tidak dapat terselesaikan tanpa adanya bantuan dari berbagai

pihak. Oleh karena itu, dengan penuh rasa hormat peneliti mengucapkan terima

kasih yang dalam kepada:

1. Prof. Dr. Hartono, dr., M.Si., selaku Dekan Fakultas Kedokteran

Universitas Sebelas Maret

2. Sinu Andhi Jusup, dr., M.Kes., selaku Kepala Program Studi

Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret.

3. Kusmadewi Eka Damayanti, dr., M.Gizi, selaku Ketua Tim Skripsi FK

UNS beserta staf Bapak Nardi yang telah memberikan arahan dalam

penyusunan skripsi ini.

4. Prof. Dr. Achmad Arman Subijanto, dr., M.S. selaku dosen

pembimbing akademik.

5. Dono Indarto, dr., M. Biotech., St., Ph.D., St., AIFM. selaku

pembimbing utama dan Ratih Dewi Yudhani, dr., M.Sc. selaku

pembimbing pendamping yang telah menyediakan waktu untuk

membimbing dan memberikan nasihat hingga terselesaikannya skripsi ini.

6. Yuliana Heri Suselo, dr., M.Sc. selaku penguji utama yang telah

memberikan kritik dan saran yang membangun dalam penyusunan skripsi

ini.

7. Keluarga tercinta, Ayahanda Mukhtahudin, Ibunda Riyati, dan adik

Sulaksono Aji Damarjati serta keluarga besar yang telah memberi banyak

inspirasi, motivasi, semangat, dan doa hingga skripsi ini dapat

terselesaikan.

8. Para staf Laboratorium Kimia Fakultas Farmasi UMS dan Laboratorium

Parasitologi UGM yang telah memberikan arahan dan bantuan selama

peneliti melakukan pengambilan data.

9. Sahabat sahabat peneliti terutama Bias yang telah menjadi teman berjuang

selama penelitian, Mbak Adit, Mbak Mila, Mbak Ifah, Calvaria, kelompok

A4, keluarga Kastrat de Geneeskunde, Penumbra, LKMI, dan Kesuma

Fakultas Kedokteran UNS yang telah membantu serta memberi motivasi

dan doa kepada peneliti.

10. Semua pihak yang secara langsung maupun tidak langsung membantu

proses penyelesaian skripsi.

Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih jauh dari kata sempurna,

namun dengan sepenuh hati peneliti berharap skripsi ini dapat bemanfaat bagi

pembaca.

Surakarta, Desember 2017

Suryaningtyas Margi Utami

vii

DAFTAR ISI

Halaman

JUDUL .......................................................................................................... i

PENGESAHAN ............................................................................................ ii

PERNYATAAN ............................................................................................ iii

ABSTRAK .................................................................................................... iv

ABSTRACT .................................................................................................. v

PRAKATA .................................................................................................... vi

DAFTAR ISI ................................................................................................. vii

DAFTAR TABEL ......................................................................................... ix

DAFTAR GAMBAR .................................................................................... x

DAFTAR SINGKATAN .............................................................................. xi

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xiii

BAB I. PENDAHULUAN ............................................................................ 1

A. Latar Belakang Masalah ............................................................ 1

B. Rumusan Masalah ....................................................................... 4

C. Tujuan Penelitian ........................................................................ 4

D. Manfaat Penelitian ...................................................................... 5

BAB II. LANDASAN TEORI ...................................................................... 6

A. Tinjauan Pustaka ........................................................................ 6

1. Diabetes Melitus Tipe 2......................................................... 6

2. Konsumsi Glukosa Sel Ginjal pada DM Tipe 2 .................... 13

3. Ellagic Acid dalam Ekstrak Delima (Punica granatum) ....... 15

4. Uji Kromatografi Ellagic Acid .............................................. 19

5. Uji Sitotoksisitas .................................................................... 24

6. Sel Vero ................................................................................. 26

7. Macam – macam Pelarut ....................................................... 27

B. Kerangka Pemikiran ................................................................... 29

C. Hipotesis Penelitian .................................................................... 30

BAB III. METODE PENELITIAN............................................................... 31

viii

A. Jenis dan Desain Penelitian ......................................................... 31

B. Lokasi Penelitian ......................................................................... 31

C. Sampel Penelitian ........................................................................ 31

D. Teknik Sampling ......................................................................... 31

E. Rancangan Penelitian .................................................................. 32

F. Identifikasi Variabel Penelitian ................................................... 33

G. Definisi Operasional Variabel Penelitian ................................... 34

H. Alat dan Bahan ........................................................................... 35

I. Dosis ........................................................................................... 36

J. Cara Kerja ................................................................................... 36

K. Alur Penelitian ............................................................................ 40

L. Teknik Analisis Data ................................................................... 41

BAB IV. HASIL PENELITIAN ................................................................... 42

A. Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry ................. 42

B. Uji Sitotoksisitas Ellagic Acid dalam Ekstrak Kulit dan Biji

Delima ......................................................................................... 49

BAB V. PEMBAHASAN ............................................................................. 57

A. Analisis Hasil ............................................................................. 58

B. Keterbatasan Penelitian .............................................................. 65

BAB VI. PENUTUP ..................................................................................... 66

A. Simpulan ..................................................................................... 66

B. Saran ............................................................................................ 66

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 67

LAMPIRAN .................................................................................................. 74

ix

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 SGLT2 inhibitor dalam tahap pengembangan atau telah

disetujui ................................................................................. 12

Tabel 2.2 Perbedaan karakteristik SGLT1 dan SGLT2 ........................ 14

Tabel 4.1 Peak area dan konsentrasi senyawa ellagic acid di dalam

standar dan sampel ................................................................ 46

Tabel 4.2 Konversi dosis ekstrak kulit dan biji delima menjadi dosis

ellagic acid ............................................................................ 50

Tabel 4.3 Nilai IC50 kelompok perlakuan dan kelompok kontrol .......... 55

x

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Transpor glukosa pada tubulus proksimal ginjal .................. 14

Gambar 2.2 Struktur dua dimensi ellagic acid ........................................ 15

Gambar 2.3 Skema pembentukan ellagic acid ......................................... 16

Gambar 2.4 Buah delima (Punica granatum) .......................................... 17

Gambar 2.5 Instrumentasi TLC ................................................................. 20

Gambar 2.6 Uji TLC ekstrak delima ......................................................... 21

Gambar 2.7 Instrumen HPLC .................................................................... 22

Gambar 2.8 Instrumentasi LC-MS ............................................................ 23

Gambar 2.9 Komponen tandem mass spectrometer .................................. 24

Gambar 2.10 Sel Vero pada fase kultur awal (24 jam) ............................... 26

Gambar 2.11 Kerangka pemikiran .............................................................. 29

Gambar 3.1 Skema rancangan penelitian .................................................. 32

Gambar 3.2 Perhitungan sel menggunakan hemositometer ...................... 38

Gambar 3.3 Pemetaan well-plate............................................................... 39

Gambar 3.4 Alur penelitian ....................................................................... 40

Gambar 4.1 Peak area ellagic acid pada senyawa standar ....................... 44

Gambar 4.2 Peak area ellagic acid dalam ekstrak kulit dan biji delima .. 45

Gambar 4.3 Grafik konsentrasi senyawa ellagic acid dalam ekstrak kulit

dan biji delima ....................................................................... 47

Gambar 4.4 Kromatogram ekstrak kulit dan biji delima ........................... 48

Gambar 4.5 Gambaran sel Vero secara mikroskopis ................................ 51

Gambar 4.6 Persentase proliferasi sel dosis 125 ppm ............................... 52

Gambar 4.7 Persentase proliferasi sel dosis 0,98 ppm .............................. 53

Gambar 4.8 Grafik hubungan antara dosis dan persentase proliferasi sel. 54

xi

DAFTAR SINGKATAN

AMPK : Adenosin Monophosphat Kinase

BEa : fraksi etil asetat biji delima

BEDA : ekstrak etanol, dietil eter, air biji delima

BMA : ekstrak metanol, air biji delima

DM : Diabetes Melitus

DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

DMSO : Dimethyl Sulfoxide

DPP-IV : Dipeptidyl Peptidase IV

EA : Ellagic Acid

FGF23 : Fibrobblast Growth Factor 23

GLP-1 : Glucagon Like Peptide 1

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

KATP : ATP – sensitive potassium

KEa : fraksi etil asetat kulit delima

KEDA : ekstrak etanol, dietil eter, air kulit delima

KKn1 : Kelompok kontrol negatif 1

KKn2 : Kelompok kontrol negatif 2

KKp : Kelompok kontrol positif

KMA : ekstrak metanol, air kulit delima

LAF : Laminar Flow

LC – MS/MS : Liquid Chromatography – tandem Mass Spectrometry

LC-MS : Liquid Chromatography – Mass Spectrometry

xii

Mr : massa molekul relatif

MTT : 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid

OAD : Obat Anti Diabetes

OCT-1 : Organic Cation Transporter-1

PBS : Phosphate Buffer Saline

PPAR-γ : Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ

ppm : part per million

PTH : Parathormon

Riskesdas : Riset Kesehatan Dasar

RXR : Retinoid X Receptor

SGLT : Sodium Glucose Co-transporter

TLC : Thin Layer Chromatography

TZD : Thiazolidinediones

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat Ijin Penelitian ............................................................... 74

Lampiran 2. Peak Area Ellagic Acid ........................................................ 76

Lampiran 3. Kromatogram Ekstrak Kulit dan Biji Delima ........................ 79

Lampiran 4. Nilai Absorbansi Sel Vero pada Uji Sitotoksisitas ................ 85

Lampiran 5. Grafik Persentase Proliferasi Sel Vero pada Uji Sitotoksisitas 87

Lampiran 6. Analisis Probit Ekstrak Kulit dan Biji Delima ...................... 90

Lampiran 7. Dokumentasi Kegiatan .......................................................... 99