SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) FP30, FP40, FP50, DAN FP60 TERHADAP

KULTUR SEL HeLa

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Lucia Endar Puspitaningrum

NIM: 038114092

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2007

SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) FP30, FP40, FP50, DAN FP60 TERHADAP

KULTUR SEL HeLa

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Lucia Endar Puspitaningrum

NIM: 038114092

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2007

ii

iii

iv

Dunia mengatakan bahwa aku hanyalah percikan api kecil Tetapi Yesus mengajariku yakin bahwa aku adalah api

Dunia mengatakan bahwa aku hanyalah seutas senar

Tetapi Yesus mengajariku yakin bahwa aku adalah sebuah harpa

Dunia mengatakan bahwa aku hanyalah sebuah bukit kecil Tetapi Yesus mengajariku yakin bahwa aku adalah sebuah

gunung

Dunia mengatakan bahwa aku hanyalah setetes air

Tetapi Yesus mengajariku yakin bahwa aku adalah sumber air

Dunia mengatakan bahwa aku hanyalah sehelai bulu Tetapi Yesus mengajariku yakin bahwa aku adalah sebuah sayap

Dunia mengatakan bahwa aku hanyalah seorang pengemis

Tetapi Yesus mengajariku yakin bahwa aku adalah seorang raja

Anonim

Kupersembahkan karyaku ini kepada:

Yesus Kristus, Tuhan dan Gembalaku Yang Maha Kasih

Papi Mami,

Adikku yang kusayangi,

Sahabat dan almamaterku yang kubanggakan

v

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkahNya yang

melimpah sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul

“Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP30,

FP40, FP50, dan FP60 terhadap Kultur Sel HeLa” sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar sarjana pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Dalam menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis tidak

lepas dari bantuan dan dorongan dari berbagai pihak yang senantiasa meluangkan

waktu dan pikirannya. Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima

kasih kepada :

1. Drs. A. Yuswanto, Ph.D., S.U., Apt. yang telah memberikan bimbingan,

pengarahan, dan semangat selama penelitian dan penyusunan skripsi.

2. Drs. Mulyono, Apt. yang bersedia meluangkan waktu dan memberikan

saran sebagai dosen penguji skripsi.

3. dr. Luciana Kuswibawati, M.Kes yang bersedia meluangkan waktu dan

memberikan saran sebagai dosen penguji skripsi.

4. Mr. J, yang telah mengajari bermacam-macam hal dalam hidup dan

membentuk penulis menjadi seperti sekarang ini.

5. Papi, Mami dan Simbrot atas doa, semangat, dan perhatian kepada penulis.

6. Saudara-saudaraku yang tersebar di seluruh penjuru dunia, yang telah

memberi pelajaran berharga tentang kehidupan kepada penulis.

7. Ndari, sebagai teman yang senantiasa rela berbagi kebingungan dan

keceriaan dengan penulis dalam proses penyusunan skripsi.

vi

8. Anak-anak Che-Mistry yang senantiasa menebar kegilaan dan kebahagiaan

di sekitar penulis.

9. Dosen dan karyawan Fakultas Farmasi yang telah banyak memberikan

sumbangan ilmu dan tenaga.

10. Pak Rajiman, Mbak Yuli, Mbak Istini, Heni dan seluruh staf, atas

bimbingan dan masukannya selama penelitian di Laboratorium Ilmu

Hayati UGM.

11. Lucy, Jenny, Melon, Vita, Sari, Ana (kelompok Mimba) dan Agnes, Mila,

Wati, Ratih (kelompok Teki) sebagai teman seperjuangan suka maupun

duka dalam menyelesaikan skripsi.

12. Semua pihak yang telah memberikan dukungan baik moral maupun

material yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan baik dalam isi, bahasa maupun

penulisan skripsi ini. Untuk itu, penulis membuka diri terhadap saran dan kritik

dari seluruh pembaca untuk lebih menyempurnakan tulisan ini. Penulis berharap

agar skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi ilmu pengetahuan. Semoga skripsi

ini dapat mendorong mahasiswa angkatan berikutnya untuk berkarya lebih baik

lagi demi majunya dunia kefarmasian di Indonesia, khususnya dalam

perkembangan obat antikanker, agar di masa depan obat antikanker yang murah

bukan lagi impian.

Yogyakarta, Maret 2007

Penulis

vii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ………………………………………………………. ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING…………………………… iii

HALAMAN PENGESAHAN……………………………………………… iv

HALAMAN PERSEMBAHAN…………………………………………… v

KATA PENGANTAR……………………………………………………... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA…………………………………… viii

DAFTAR ISI……………………………………………………………….. ix

DAFTAR TABEL………………………………………………………….. xiii

DAFTAR GAMBAR………………………………………………………. xv

DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………. xvi

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING …………………………….. xvii

INTISARI……………………………………………………..…………… xviii

ABSTRACT…………………………………………………..………...…. xix

BAB I PENGANTAR……………………………………………………… 1

A. LATAR BELAKANG ………………………………………………… 1

1. Permasalahan………………………………………………………. 3

2. Keaslian penelitian…………………………………………………. 4

3. Manfaat penelitian…………………………………………………. 4

B. TUJUAN PENELITIAN………………………………………………. 4

1. Tujuan umum………………………………………………………. 4

2. Tujuan khusus……………………………………………………… 5

ix

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA………………………………………. 6

A. Azadirachta indica A. Juss…………………………………................... 6

1. Keterangan Botani…..………………………………………………. 6

2. Sinonim……………..………………………………………………. 6

3. Morfologi tanaman…..……………………………………………… 6

4. Kandungan Kimia…….…………...………………………………... 7

5. Penelitian Mengenai Tanaman Mimba…………………………….. 7

B. Kanker………………………………………………………………….. 8

1. Tinjauan umum .................................................................................. 8

2. Proses terjadinya kanker..................................................................... 10

3. Siklus sel .............................................................................................. 11

4. Terapi Kanker...................................................................................... 12

5. Kanker leher rahim .............................................................................. 15

C. Protein…………………………………………………………………... 17

D. Kultur sel .........……………………………………………………......... 20

1. Sel HeLa....... ...................................................................................... 21

2. Sel Vero.. ............................................................................................ 21

E. Uji sitotoksisitas…………………………………………………………. 21

F. Landasan teori............................................................................................. 24

G. Keterangan empiris...…………………………………………………….. 26

BAB III METODOLOGI PENELITIAN……………………………………. 27

A. Jenis Rancangan Penelitian………………………………………………. 27

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional………..…………………... 27

x

1. Variabel penelitian ……………………………………………………. 27

2. Definisi Operasional ………………………………………………… 28

C. Bahan atau Materi Penelitian…………………………………………… 28

D. Alat-alat Penelitian……………………………………………………... 30

E. Tatacara Penelitian……………………………………………………... 30

1. Determinasi Tanaman………………………………………..…….. 30

2. Pengumpulan Daun Mimba………………………………………… 30

3. Sterilisasi Alat dan Bahan.................................................................. 31

4. Pembuatan Fraksi Protein.................................................................. 31

5. Pengukuran Konsentrasi Fraksi Protein ............................................ 35

6. Propagasi dan Panen sel HeLa dan sel Vero....................................... 36

7. Uji Sitotoksitas terhadap Sel HeLa dan sel Vero ................................ 37

F. Analisis Hasil …………………………………………………………... 38

BAB IV PEMBAHASAN …………………………………………………. 39

A. Sterilisasi Alat ………………………………………………………….. 39

B. Preparasi Fraksi Protein Daun Mimba………………………………….. 40

C. Penetapan Konsentrasi Fraksi Protein Daun Mimba …………………… 44

D. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein daun Mimba…………………………... 45

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN …………………………………… 58

A. Kesimpulan …………………………………………………………….. 58

B. Saran …………………………………………………………………… 58

DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………… 60

LAMPIRAN ……………………………………………………………….. 64

xi

BIOGRAFI PENULIS …………………………………………………… 111

xii

DAFTAR TABEL Tabel I. Beberapa jenis protein globuler dan kelarutannya…...….... 18

Tabel II. Hasil uji sitotoksik fraksi protein terhadap

sel Hela dengan metode MTT……………………………... 50

Tabel III. Hasil uji sitotoksik fraksi protein terhadap

sel Vero dengan metode MTT.............................................. 52

Tabel IV. Nilai LC50 pada sel Hela dan sel Vero.................................. 54

Tabel V. Volume larutan ektrak gubal protein daun

mimba.................................................................................... 64

Tabel VI. Absorbansi fraksi protein pada panjang gelombang

280 nm dan 260 nm............................................................... 67

Tabel VII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP30

terhadap kultur sel HeLa........................................................ 68

Tabel VIII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP40

terhadap kultur sel Hela......................................................... 68

Tabel IX. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP50

terhadap kultur sel Hela......................................................... 69

Tabel X. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP60

terhadap kultur sel HeLa........................................................ 69

Tabel XI. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP30

terhadap kultur sel Vero........................................................ 70

Tabel XII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP40

terhadap kultur sel Vero........................................................ 70

xiii

Tabel XIII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP50

terhadap kultur sel Vero........................................................ 71

Tabel XIV. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP60

terhadap kultur sel Vero........................................................ 71

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Fase kehidupan sel ............................................................... 11

Gambar 2. Protein yang terlarut dalam air.............................................. 42

Gambar 3. Protein dalam air dengan penambahan ammonium sulfat ..... 42

Gambar 4. Reaksi MTT menjadi formazan oleh enzim dehidrogenase.... 46

Gambar 5. Kristal formazan ..................................................................... 47

Gambar 6. Sel HeLa................... ……………...………………………… 49

Gambar 7. Sel Vero …………...……………………….....................…... 49

Gambar 8. Grafik persen kematian sel HeLa vs kadar fraksi

protein daun mimba..................................................……….… 51

Gambar 9. Grafik persen kematian sel Vero vs kadar fraksi

protein daun mimba..............................................................… 53

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Jumlah penambahan amonium sulfat pada derajat

kejenuhan tertentu ................................................................. 64

Lampiran 2. Cara perhitungan kadar protein ..... ...................................... 67

Lampiran 3. Absorbansi sel dengan metode MTT .................................... 68

Lampiran 4. Uji Kolmogorov-Smirnov ……….……………….……....... 72

Lampiran 5. Analisis probit.............................................. .......................... 76

Lampiran 6 Uji t-independent..................................................................... 103

Lampiran 7. Perhitungan nilai korelasi kadar fraksi protein dengan

persen kematian sel Hela dan sel Vero pada taraf

kepercayaan 80% ................................................................... 105

Lampiran 8. Tanaman Azadirachta indica A. Juss ………….……………107

Lampiran 9. Daun Azadirachta indica A. Juss …………….……………..107

Lampiran 10. Hi-Mac Sentrifuge HITACHI SCP85H …………………….108

Lampiran 11. Laminar Air Flow Labconco Seri 226356 …………….…….108

Lampiran 12. Spektrofotometer UV CECIL Series 2………………….…...109

Lampiran 13. ELISA reader SLT 340ATC ……………………………….109

Lampiran 14. Surat Determinasi ..................................................................110

xvi

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING

FP30 (PF30) : fraksi protein (protein fraction) daun mimba hasil

pengendapan dengan amonium sulfat 10% jenuh

FP40(PF40) : fraksi protein (protein fraction) daun mimba hasil

pengendapan dengan amonium sulfat 20% jenuh

FP50(PF50) : fraksi protein (protein fraction) daun mimba hasil

pengendapan dengan amonium sulfat 30% jenuh

FP60(PF60) : fraksi protein (protein fraction) daun mimba hasil

pengendapan dengan amonium sulfat 40% jenuh

continous cell lines : sel yang berasal dari sel primer yang ditumbuhkan terus

menerus

FBS : Foetal Bovine Serum

MTT : 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide)

reagen stopper : reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N

RPMI : Rosswell Park Memorial Institute

SDS : Sodium Dodesil Sulfat

tissue culture flask : tempat untuk menumbuhkan sel, berbentuk botol dengan

leher bengkok

96 well plate : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat menanam

sel pada uji sitotoksisitas

xvii

INTISARI

Kanker merupakan salah satu penyakit yang paling mematikan di dunia. Ada banyak penelitian mengenai antikanker. Beberapa diantaranya menyebutkan bahwa tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) memiliki aktivitas biologis yang potensial sebagai senyawa antikanker. Dalam penelitian kali ini, fraksi protein daun mimba 30%, 40%, 50%, dan 60% dujicobakan terhadap sel HeLa dan sel Vero untuk mengetahui fraksi protein mana yang memiliki potensi untuk dikembangkan menjadi senyawa antikanker.

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Uji sitotoksisitas dilakukan secara in vitro terhadap sel HeLa dan sel Vero menggunakan metode MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromid). Fraksi protein diperoleh dengan pengendapan menggunakan ammonium sulfat dengan konsentrasi 30%, 40%, 50%, dan 60% jenuh. Hasil uji dinyatakan dalam persentase kematian sel HeLa dan sel Vero, yang selanjutnya diolah dengan analisis statistika analisis probit dan analisis t-test. Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa harga LC50 untuk fraksi protein 30%, 40%, 50%, dan 60% jenuh terhadap sel HeLa berturut-turut adalah 3,72.10-13 µg/ml; 1,8.10-2 µg/ml; 1,5.1023 µg/ml; dan 173,49 µg/ml. Walaupun nilai LC50 untuk FP30 dan FP40 ≤ 20 µg/mL, hasil uji t-test menunjukkan bahwa perbedaan antara sitotoksisitasnya dengan sel Vero tidak bermakna, sehingga tidak ada yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker.

Kata kunci : daun mimba, sel HeLa, sitotoksisitas, sel Vero, selektif

xviii

ABSTRACT

Cancer is one of the most deadly disease in the world. There are so many researchs on anticancer. Some of them stated that neem tree (Azadirachta indica A. Juss) has a potential biological activity as anticancer. In this research, protein fraction of neem leaves with concentration of 30%, 40%, 50%, and 60% were applied to Hela Cell and Vero Cell Lines to identify which protein fractions to have potency to be developed as anticancer.

This study was pure experimental research with complete random design. The cytotoxicity test was carried out in vitro using HeLa Cell and Vero Cell Lines by MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromid) method. In this research, protein of neem leaves were fractionated using ammonium sulfate of 30%, 40%, 50%, and 60% saturated. The data shown as a percentage of cell death, statistically analyzed with probit analyse and t-test. The result indicated that LC50 values of protein fraction of 30%, 40%, 50%, and 60% for HeLa Cell Line were 3,72.10-13 µg/ml; 1,8.10-2 µg/ml; 1,5.1023

µg/ml; dan 173,49 µg/ml, respectively. Although LC50 value of FP30 dan FP40 ≤ 20 µg/mL, none of them were supposed to be potential to be developed as an anticancer due to poor selectivity.

Keywords: neem leaves, Hela Cell Line, cytotoxicity, Vero Cell Line, selective

xix

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Kanker merupakan salah satu penyakit yang paling ditakuti karena banyak

menimbulkan kematian di seluruh dunia. Di Amerika Serikat, kanker merupakan

penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskuler (Balmer, Valley, dan

Ianucci, 2005). Di Indonesia sendiri diperkirakan ada 100 orang penderita kanker

baru setiap 100.000 orang penduduk tiap tahunnya (Anonim, 2001a). Menurut hasil

Survei Kesehatan Rumah Tangga (SKRT) Depkes RI, jumlah penderita kanker di

Indonesia pada tahun 1981 adalah sekitar 3,4% dan meningkat menjadi 6% pada

tahun 2001. Ada 5 besar kanker di Indonesia, yaitu kanker leher rahim, kanker

payudara, kanker kelenjar getah bening, kanker nasofaring, dan kanker kulit

(Anonim, 2001a).

Ada 3 standar utama terapi kanker, yaitu pembedahan, radiasi, dan

kemoterapi. Pemilihannya tergantung pada jenis tumor dan tingkat keparahannya

(Rang, Dale, Ritter, Moore, 2003). Selain itu, dikenal juga terapi imun dan terapi

hormon (Anonim, 2004b). Namun selain mahal, terapi kanker juga dikenal memiliki

efek samping merugikan yang dapat mempengaruhi kualitas hidup pasien. Karena itu,

banyak orang mulai beralih ke pengobatan tradisional, salah satunya penggunaan

tanaman obat, yang relatif lebih murah dan dipercaya memiliki efek samping yang

lebih sedikit dibandingkan obat-obatan konvensional.

1

2

Selama berabad-abad, bahan-bahan herbal telah menjadi bagian dari pengobatan

tradisional dan diwariskan secara turun temurun. Peranannya dalam pengobatan

modern tidak dapat diremehkan. Lebih dari 92% obat-obatan antikanker yang tersedia

secara komersial di Amerika Serikat antara tahun 1983-1994 dan sudah terbukti

khasiat penggunaannya, sekitar 62%nya berasal dari bahan alam. Obat antikanker

paling dikenal yang berasal dari tanaman sejauh ini adalah vinkristin dan vinblastin,

yang diisolasi dari tanaman asal Madagaskar, Catharanthus roseus (Newman dan

Cragg, 2002). Sampai saat ini, pencarian obat antikanker masih terus dilakukan.

Mimba (Azadirachta indica A. Juss) yang digunakan dalam penelitian ini

telah lama dikenal dalam dunia pengobatan sebagai tanaman yang berkhasiat

sehingga sangat berpotensi untuk diteliti lebih lanjut. Semua bagian dalam tanaman

mimba memiliki efek farmakologis, antara lain sebagai antiinflamasi, antipiretik,

antibakteri, spermicidal, antifungal, dan antikanker (Biswas, Chattopadhyay,

Banerjee, Bandyopadhyay, 2002).

Telah banyak dilakukan penelitian tehadap tanaman mimba terkait dengan

aktivitasnya sebagai antikanker. Salah satunya adalah penelitian yang dilakukan oleh

Suwanto pada tahun 2006. dalam penelitiannya, Suwanto menggunakan fraksi protein

daun mimba 30%, 60%, dan 100% jenuh hasil pengendapan dengan menggunakan

ammonium sulfat terhadap kultur sel HeLa. Penelitian tersebut menyatakan bahwa

yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker adalah fraksi

protein 30% dan 60% jenuh. Menurut National Cancer Institute (NCI), suatu

3

senyawa dikatakan bersifat antikanker jika memiliki harga LC50 ≤ 20 µg/ml (Suffness

& Pezzuto, 1991). Namun, penelitian tersebut belum memberikan informasi

mengenai selektivitas fraksi protein daun mimba terhadap sel normal.

Suatu antikanker diharapkan memiliki toksisitas selektif, artinya dapat

menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal. Terapi hanya dapat

dikatakan berhasil dengan baik apabila pada dosis terapi yang digunakan dapat

mematikan sel kanker tanpa terlalu mengganggu sel jaringan normal yang

berproliferasi (Nafrialdi dan Gan, 1995). Terkait dengan hal tersebut, maka dalam

penelitian kali ini digunakan sel Vero (sel normal) sebagai pembanding. Agar dapat

diketahui dengan lebih jelas fraksi protein mana yang paling optimal efek

sitotoksisitasnya, range fraksinasi dipersempit menjadi 30%, 40%, 50%, dan 60%

jenuh.

1. Permasalahan

a. Diantara daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60, manakah yang memiliki

daya sitotoksisitas yang paling besar terhadap sel Hela?

b. Berapa nilai LC50 yang didapatkan dari perlakuan daun mimba FP30, FP40,

FP50, dan FP60 terhadap kultur sel Hela?

c. Apakah daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 memiliki daya sitotoksisitas

terhadap sel Vero?

4

d. Apakah daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 jenuh berpotensi untuk

dikembangkan sebagai suatu senyawa antikanker jika dilihat dari daya

sitotoksisitasnya terhadap sel Vero?

2. Keaslian penelitian

Banyak penelitian mengenai daun mimba terkait dengan aktivitasnya sebagai

antikanker, namun sejauh yang diketahui penulis, belum pernah dilakukan penelitian

mengenai sitotoksisitas daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 terhadap sel HeLa

yang dibandingkan dengan sel Vero.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini dapat memberikan tambahan pengetahuan mengenai khasiat,

penggunaan, dan sitotoksisitas fraksi protein daun terhadap sel Hela dibanding sel

Vero yang berguna dalam penemuan obat antikanker.

b. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan khasiat dan selektivitas daun

mimba sebagai antikanker.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan umum:

mengetahui apakah daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 memiliki potensi untuk

dikembangkan sebagai senyawa antikanker.

5

Tujuan khusus:

a. mengetahui manakah daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 yang memiliki

sitotoksisitas paling besar terhadap kultur sel Hela.

b. mengetahui seberapa besar nilai LC50 daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60

terhadap kultur sel HeLa.

c. mengetahui apakah daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 juga memiliki

daya sitotoksisitas terhadap sel Vero.

d. mengetahui apakah daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 berpotensi untuk

dikembangkan sebagai suatu senyawa antikanker jika dilihat dari daya

sitotoksisitasnya terhadap sel Vero.

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman mimba (Azadirachta indica A.Juss)

1. Keterangan botani

Tanaman mimba (Azadirachta indica A.Juss) termasuk dalam suku

Meliaceae. Penyebaran mimba di Indonesia yang cukup luas menyebabkan mimba

dikenal dengan berbagai nama daerah. Di wilayah Pasundan (Sunda) mimba lebih

dikenal dengan nama nimba. Sementara di Bali dan Nusa Tenggara, mimba dikenal

dengan nama intaran. Di Madura, nama lain tanaman ini adalah mimba, membha,

atau mempheuh. Nama yang kemudian berkembang di masyarakat adalah mimba.

Namun ada juga yang menyebutnya nimba (Sukrasno dan Tim Lentera, 2003).

2. Sinonim tanaman

Melia azadirachta L. (Hutapea, 1993).

3. Morfologi tanaman

Tanaman mimba berupa pohon dengan tinggi 10-15 meter. Batang tegak,

berkayu, bulat, permukaan kasar, percabangan simpodial, coklat. Daun majemuk,

berhadapan, lonjong, melengkung, tepi bergerigi, ujung lancip, pangkal meruncing,

pertulangan menyirip, panjang 5-7 cm, lebar 3-4 cm, tangkai panjang 8-20 cm, hijau.

Bunga majemuk, berkelamin 2, di ujung cabang, tangkai silindris, panjang 8-15 cm,

kelopak hijau, benang sari silindris, putih kekuningan, putik lonjong, coklat muda,

6

7

mahkota halus, putih. Buah buni, bulat telur, hijau. Biji bulat, diameter kurang lebih 1

cm, putih. Akar tunggang, coklat (Hutapea, 1993).

1. Kandungan kimia

Daun mimba mengandung beberapa zat aktif, antara lain : 3-asetil-7-tigloil-

lakton-vilasinin, 3 desasetil-3-cinnamoil-azadirachtin, 3-desasetil-salanin, 6-

desasetilnimbinen, azadirachtin, azadirachtin-A, beta-sitosterol, hiperoksid,

isoazadirolid, isonimbosinolid, nimbaflavon, nimbandiol, nimbinen, nimbolid,

kuesertin, kuersitrin, rutin, dan vilasanin (Anonim, 2004a).

2. Penelitian terhadap tanaman mimba

Tanaman mimba telah lama digunakan dalam pengobatan tradisional. Konon,

mimba juga dapat digunakan sebagai antikanker, sehingga banyak dilakukan

penelitian untuk membuktikannya. Fraksi total protein daun mimba pernah diujikan

efek sitotoksisitasnya terhadap 4 jenis sel kanker, yakni sel HeLa (Febriani, 2004),

SiHa (Lusia, 2004), Myeloma (Rahmawati, 2004), dan Raji (Ariyani, 2004).

Semuanya menyimpulkan bahwa fraksi total protein daun mimba memiliki efek

sitotoksik terhadap ketiga sel kanker tersebut meskipun belum memenuhi syarat

untuk dikembangkan menjadi senyawa antikanker karena harga LC50 yang didapatkan

pada masing-masing penelitian tersebut > 20 μg/ml. Penelitian selanjutnya dilakukan

oleh Robbyono (2006), Suwanto (2006), Hariadi (2006), dan Candra (2006) berturut-

turut terhadap sel Raji, HeLa, Myeloma, dan Siha dengan menggunakan fraksi

protein daun mimba 30%, 60%, dan 100% jenuh. Dari penelitian-penelitian tersebut,

8

didapatkan kesimpulan bahwa yang memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai

senyawa antikanker adalah fraksi protein 30% jenuh untuk sel Raji, fraksi protein

30% dan 60% jenuh untuk sel HeLa, fraksi protein 30% dan 60% jenuh untuk sel

Myeloma, dan fraksi protein 30% dan 60% jenuh untuk sel Siha. Sebagai penelitian

lanjutan, dilakukan juga penelitian dengan menggunakan fraksi protein daun mimba

dengan konsentrasi yang dipersempit, yakni FP10, FP20, FP30, FP40, FP50, dan FP60,

terhadap 4 jenis sel kanker dibandingkan dengan sel normal (sel Vero). Penelitian

tersebut dilakukan oleh Lahrita (2006) dan Jenny (2006) terhadap kultur sel Raji,

Purnamasari (2007) dan Ekasaptawati (2007) terhadap kultur sel Myeloma, serta

Harsono (2006) dan Mellina (2007) terhadap kultur sel SiHa. Masing-masing dibagi

menjadi 2 kelompok, yakni fraksi kecil (FP10, FP20, FP30, dan FP40) dan fraksi besar

(FP30, FP40, FP50, dan FP60). Hasil yang didapatkan dari penelitian-penelitian tersebut

menunjukkan bahwa yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa

antikanker adalah FP20 dan FP60 untuk sel Raji, FP20 dan FP40 untuk sel SiHa, dan

tidak ada FP yang berpotensi untuk sel Myeloma.

B. Kanker

1. Tinjauan umum

Kanker merupakan nama umum untuk lebih dari 100 jenis penyakit yang

bervariasi, ditandai dengan adanya pertumbuhan sel-sel yang tidak terkontrol, invasi

jaringan lokal, dan kemampuan untuk menyebar luas (distant metastases) (Balmer et

al, 2005). Sel tumor ganas pada kanker tumbuh menyusup ke jaringan sehat di

9

sekitarnya, sehingga dapat digambarkan seperti kepiting (cancer) dengan kaki-

kakinya mencengkeram alat tubuh yang terkena (Anonim, 2006a).

Sel-sel normal dapat menjadi sel kanker karena adanya satu atau lebih mutasi

yang terjadi pada DNA sel. Perkembangan penyakit kanker merupakan suatu proses

rumit yang melibatkan tidak hanya satu perubahan genetik namun juga faktor-faktor

epigenetik (misalnya aksi hormonal tubuh, paparan bahan-bahan karsinogen, dan

lain-lain) yang tidak berkembang menjadi kanker itu sendiri namun dapat

meningkatkan kemungkinan terjadinya mutasi pada DNA sel yang pada akhirnya

menyebabkan terjadinya kanker (Rang et al, 2003).

Ada 2 macam tumor, yakni benigna dan malignant. Tumor benigna

terlokalisasi dan lambat pertumbuhannya. Tumor ini menyerupai sel-sel dimana

mereka berkembang dan jarang bermetastasis. Tumor benigna juga jarang tumbuh

kembali bila sudah dihilangkan (Balmer et al, 2005).

Tumor malignant bersifat sebaliknya. Jenis tumor ini tidak stabil secara

genetis, bentuknya sudah tidak menyerupai sel atau jaringan tempat mereka berasal.

Sel malignant tidak memiliki kemampuan sel normal, mengalami metastasis, dan

sering tumbuh kembali setelah dihilangkan/ dihancurkan. (Balmer et al, 2005).

Penyebarannya sangat cepat, bersifat merusak, dan penghilangan tumor tidak dapat

memulihkan fungsi sel, jaringan, atau organ yang sudah dirusaknya. Pada umumnya,

yang dimaksud dengan kanker adalah tumor malignant.

10

2. Proses Terjadinya Kanker

Proses terjadinya kanker (karsinogenesis) terdiri dari beberapa tahapan, yakni

inisiasi, promosi, konversi, dan progresi. Inisiasi merupakan tahapan pertama

terjadinya kanker, prosesnya membutuhkan paparan bahan-bahan yang bersifat

karsinogenik terhadap sel normal. Bahan-bahan karsinogenik ini akan menyebabkan

kerusakan genetik pada sel, yang berujung pada mutasi sel yang sifatnya ireversibel.

Tahapan selanjutnya, yang disebut promosi, bersifat reversibel. Karena sifatnya ini,

tahap promosi biasanya menjadi target strategi kemoterapi, disamping perubahan

gaya hidup dan diet. Dalam banyak kasus, sel-sel yang bermutasi berubah menjadi sel

kanker. Proses ini disebut dengan konversi/ transformasi. Pada tahapan terakhir,

progresi, terjadi peningkatan proliferasi sel. Pada fase ini, tumor menyebar ke

jaringan lokal dan terjadi metastasis (Balmer et al, 2005).

Ada 2 gen utama yang terlibat dalam karsinogenesis, yakni onkogen dan gen

penghambat pertumbuhan tumor (tumor-supressor genes). Onkogen merupakan

perkembangan dari sel normal yang disebut protoonkogen. Protoonkogen merupakan

pengatur fungsi seluler normal yang penting, termasuk diantaranya siklus sel.

Beberapa kejadian seperti mutasi sel atau perubahan susunan pada kromosom akibat

paparan bahan-bahan karsinogenik akan mengaktivasi protoonkogen menjadi

onkogen. Akibatnya, terjadi kekacauan pada pengaturan proliferasi dan pertumbuhan

pada sel normal. Proses ini dapat dihambat oleh gen penghambat pertumbuhan tumor

(tumor-supressor genes) yang terdapat pada setiap sel normal. Pada penyakit kanker,

terjadi inaktivasi pada gen jenis ini. Gen lain yang juga berperan dalam

11

karsinogenesis adalah gen yang dapat memperbaiki DNA. Gen ini juga termasuk

dalam kategori gen penghambat pertumbuhan tumor (tumor-supressor genes)

(Balmer et al, 2005).

3. Siklus Kehidupan Sel

Go G 1

M

G2

S

Gambar 1. Fase kehidupan sel

Sel tumor dapat berada dalam 3 keadaan yakni yang sedang membelah (siklus

proliferatif), yang dalam keadaan istirahat (tidak membelah, G0), dan yang secara

permanen tidak membelah. Sel kanker yang sedang membelah terdapat dalam

beberapa fase yaitu fase mitosis (M), pascamitosis (G1), fase sintesis DNA (S), dan

fase pramitosis (G2) (Nafriadi dan Gan, 1995).

Pada akhir fase G1 terjadi peningkatan RNA disusul dengan fase S yang

merupakan saat terjadinya replikasi DNA. Setelah fase S berakhir, sel masuk dalam

fase pramitosis (G2) dengan ciri : sel berbentuk tetraploid, mengandung DNA dua

kali lebih banyak daripada sel lain dan masih berlangsungnya sintesis RNA dan

protein. Sewaktu mitosis berlangsung (fase M), sintesis protein dan RNA berkurang

secara tiba-tiba, dan terjadi pembelahan menjadi 2 sel. Setelah itu sel dapat memasuki

12

interfase untuk kembali memasuki fase G1, saat sel berproliferasi, atau memasuki fase

istirahat (G0). Sel dalam fase G0 yang masih potensial untuk berproliferasi disebut sel

klonogenik atau sel induk (stem cell). Jadi yang menambah jumlah sel kanker ialah

sel yang dalam siklus proliferasi dan dalam fase G0 (Nafriadi dan Gan, 1995).

4. Terapi kanker

Ada 3 standar terapi kanker, yaitu pembedahan, radiasi, dan kemoterapi (Rang

et al, 2003). Selain itu, dikenal juga terapi imun dan terapi hormon. Keberhasilan

pengobatan kanker sangat dipengaruhi oleh jenis kanker, stadium kanker, keadaan

umum penderita, serta kepekaan terhadap pengobatan (Sumarny, 2004).

a. Pembedahan

Pembedahan dapat menjadi terapi pilihan jika sel kanker yang

terdiagnosa masih berada dalam tahap awal dan belum bermetastasis. Contoh

pembedahan untuk penanganan kanker misalnya mastectomy untuk kanker

payudara dan prostatectomy untuk kanker prostat (Anonim, 2006b).

b. Radiasi

Radiasi adalah penggunaan radiasi ionisasi untuk membunuh sel

kanker dan mengecilkan tumor. Terapi dengan radiasi dapat melukai atau

menghancurkan sel di area yang ditangani (jaringan target) dengan membuat

kerusakan pada materi genetik pada sel-sel tersebut. Tujuan terapi ini adalah

untuk menghancurkan sel kanker sebanyak mungkin dengan membatasi

kerusakan pada jaringan di sekitarnya (Anonim, 2006b).

c. Kemoterapi

13

Pembedahan dan radiasi merupakan terapi yang bersifat lokal.

Keduanya dapat menyembuhkan pasien yang kankernya masih terlokalisasi,

namun seringkali pasien pengidap kanker sudah sampai pada tahap metastasis

saat diagnosa. Karena itu dibutuhkan suatu terapi yang bersifat sistemik.

Kemoterapi dapat menjangkau sirkulasi sistemik dan secara teori mampu

mengatasi kanker yang sudah bermetastasis (Balmer et al, 2005).

d. Terapi imun

Dalam terapi imun, sistem kekebalan tubuh sendiri digunakan untuk

melawan sel kanker atau melindungi tubuh dari efek samping kemoterapi

(Anonim, 2004b). Jenis terapi ini dikembangkan karena penderita kanker

biasanya memiliki masalah-masalah seperti gangguan daya tahan tubuh, nyeri,

penurunan fungsi utama tubuh, serta stress kejiwaan. Tujuannya adalah untuk

memperkuat tubuh penderita kanker dalam melawan penyakit dan

meningkatkan kualitas hidup (Sumarny, 2004).

e. Terapi hormon

Beberapa jenis kanker, seperti kanker prostat dan kanker payudara,

pertumbuhannya sangat tergantung hormon. Dengan demikian, jenis-jenis

kanker ini dapat dihambat dengan menggunakan antagonis hormon atau

dengan menggunakan suatu zat yang menghambat sintesis hormon yang

bersangkutan (Rang et al, 2003).

14

Pada umumnya, kerja antikanker berdasarkan atas gangguan pada salah satu

proses sel yang esensial. Karena tidak ada perbedaan kualitatif antara sel kanker

dengan sel normal, maka semua antikanker bersifat mengganggu sel normal, bersifat

sitotoksik, dan bukan kankerosid atau kankerotoksik yang selektif (Nafrialdi dan Gan,

1995).

Ditinjau dari siklus sel, obat kanker dapat dibedakan menjadi 2 golongan.

Yang pertama adalah yang memperlihatkan toksisitas selektif terhadap fase-fase

tertentu dari siklus sel dan disebut zat cell cycle-specific (CCS), misalnya vinkristin

dan vinblastin. Zat CCS ini terbukti untuk kanker yang berproliferasi tinggi, misalnya

kanker sel darah. Golongan kedua adalah zat cell cycle non-specific (CCNS),

misalnya zat alkilator atau antibiotik kanker (Nafrialdi dan Gan, 1995).

Pada penyakit kanker, terjadi inaktivasi pada gen penghambat pertumbuhan

tumor (tumor-supressor genes). Yang paling dikenal adalah p53 dan pRb. Protein

retinoblastoma (pRb) berfungsi untuk membantu mengatur siklus sel. Bentuk aktif

pRb dapat bertindak sebagai penghambat replikasi DNA. Pada 40% kanker yang

terjadi pada manusia, mutasi pada gen pRb akan menyebabkan sel membelah tanpa

henti. Anggota gen penghambat pertumbuhan tumor yang lain, p53, bertugas

melindungi genome, sehingga seringkali disebut juga sebagai guardian. Gen ini

mampu mencegah replikasi DNA yang rusak pada sel normal dan mendorong sel

yang mengandung DNA yang tidak normal untuk menghancurkan dirinya sendiri.

Kebanyakan kanker yang terjadi pada manusia disebabkan karena adanya cacat pada

gen p53 ini (Sofyan, 2000).

15

Salah satu strategi terapi kanker yang saat ini sedang giat dikembangkan

adalah terapi yang dapat memperbaiki kesalahan fungsi dari gen p53 dan pRb ini.

Secara konseptual, hal yang paling penting adalah mengganti gen yang rusak dengan

yang normal (normal counterpart) (Sofyan, 2000).

Ada dugaan bahwa virus yang lemah dapat membawa gen yang normal dan

meneruskannya hanya pada sel tumor. Namun, sampai saat ini belum ada vektor virus

yang mampu mendahului sistem imun. Artinya, sistem imun tubuh telah lebih dahulu

membunuh virus sebelum virus yang membawa gen p53 tersebut mendapat

kesempatan untuk mencapai sel tumor. Karena adanya rintangan ini, maka para

onkolog juga melakukan pendekatan lain, yakni dengan mengkaji peristiwa

pengaturan produk gen, yakni peristiwa yang menjadi awal kerusakannya secara

genetik, kemudian mengembangkan obat yang menghambat peristiwa tersebut.

Misalnya, pada jaringan normal pRb memblok aktivitas protein lain yang bernama

E2F, yang pada keadaan bebas akan memacu sintesis DNA. Jika tidak ada pRb,

aktivitas E2F menjadi tidak terkontrol dan pada akhirnya menyebabkan pembelahan

sel yang tidak terkendali. Untuk kanker yang disebabkan oleh ianktivasi p53, harapan

utama adalah menemukan terapi yang dapat memulihkan atau mengaktivasi p53

kembali pada fungsi normalnya (Sofyan, 2000).

5. Kanker Leher Rahim

Kanker leher rahim merupakan salah satu tumor malignan pada saluran

genital penyebab kematian terbesar akibat kanker terutama pada wanita-wanita di

negara berkembang. Penyakit ini paling umum ditemukan diantara tumor ganas

16

ginekologik dan umumnya paling banyak ditemukan pada wanita berusia 31-60 tahun

(Lee dan Seo, 2002). Di Indonesia, kanker leher rahim menempati urutan pertama

dalam 5 besar kanker (Anonim, 2001a).

Human Papiloma Virus (HPV) yang ditemukan pada tahun 1990, khususnya

tipe 16 dan 18 diduga sebagai etiologi kanker leher rahim. Wanita yang terinfeksi

HPV beresiko mengalami kanker leher rahim 50-100 kali lebih besar dibandingkan

yang tidak terinfeksi (Anonim, 2006d).

Virus HPV merupakan virus DNA yang sangat kecil, namun bersifat sangat

infektif dan dapat menimbulkan lesi pada kulit maupun pada epitel sel pipih. Infeksi

HPV merupakan jenis penyakit yang menular secara seksual. Faktor seluler dalam

HPV yang bertanggungjawab atas munculnya kanker leher rahim adalah bagian

onkoprotein dari HPV, yakni viral E6 dan E7 yang mampu menyebabkan kekacauan

pada siklus dan proliferasi sel akibat inaktivasi pada gen penekan pertumbuhan tumor

(tumor-supressor genes) p53 dan pRb pada sel normal. Pada kanker leher rahim,

DNA E6 akan mengikat kuat p53 sedangkan pRb akan diikat kuat oleh DNA E7

(King, 2000).

Kanker leher rahim selalu diawali dengan keadaan yang disebut Cervical

Intra-epithelial Neoplasia (CIN), namun tidak semua wanita yang mengalaminya

akan berakhir dengan kanker leher rahim (Cervical Intra epithelial Carcinoma).

Pendeteksian CIN sejak dini dapat mencegah munculnya kanker leher rahim

pada wanita (Anonim, 2003). Cara ini sangat membantu untuk mengurangi angka

kematian akibat kanker leher rahim (Lee dan Seo, 2002).

17

C. Protein

Protein adalah suatu polipeptida yang memiliki bobot molekul yang sangat

bervariasi, mulai dari 5000 hingga lebih dari satu juta. Di samping berat molekul

yang berbeda-beda, protein juga memiliki sifat yang berbeda-beda. Ada protein yang

mudah larut dalam air, tetapi ada juga yang sukar larut dalam air (Poedjiadi, 1994).

Ditinjau dari strukturnya, protein dapat dibagi menjadi 2 golongan besar, yaitu

golongan protein sederhana dan protein gabungan. Yang dimaksud dengan protein

sederhana adalah protein yang hanya terdiri dari molekul-molekul asam amino,

sedangkan protein gabungan adalah protein yang terdiri dari protein dan gugus bukan

protein. Gugus ini disebut gugus prostetik dan terdiri atas karbohidrat, lipid, atau

asam nukleat (Poedjiadi, 1994).

Protein sederhana dapat dibagi menjadi 2 bagian menurut bentuk molekulnya,

yaitu protein fiber dan protein globuler. Protein fiber memiliki bentuk molekul

panjang seperti serat atau serabut, sedangkan protein globuler pada umumnya

berbentuk bulat atau elips. Protein globuler pada umumnya memiliki sifat larut dalam

air, dalam basa atau dalam etanol. Beberapa jenis protein globuler yaitu albumin,

globulin, histon, dan protamin (Poedjiadi, 1994).

18

Tabel I. Beberapa jenis protein globuler dan kelarutannya

Albumin Merupakan protein yang dapat larut dalam air. Larutan albumin

dalam air dapat diendapkan dengan penambahan ammonium sulfat

hingga jenuh. Albumin antara lain terdapat dalam serum darah serta

bagian putih telur.

Globulin Merupakan protein yang sukar larut dalam air murni, tetapi dapat

larut dalam larutan garam netral, misalnya dalam larutan NaCl

encer. Globulin antara lain terdapat dalam serum darah, pada otot,

dan pada jaringan lain.

Protamin Merupakan suatu protein yang bersifat basa seperti histon, tidak

mengandung tirosin atau triptofan, tetapi mengandung banyak

arginin sehingga memiliki kadar nitrogen 25-30%. Protamin

berikatan dengan asam nukleat dan terdapat dalam sel sperma ikan.

Larut dalam etanol 70-80% tetapi tidak larut dalam air dan dalam

etanol absolut.

Histon Merupakan protein yang bersifat basa dan dapat larut dalam air.

Pada proses hidrolisis histon menghasilkan banyak histidin dan

lisin. Histon terdapat dalam inti sel dalam bentuk berikatan dengan

asam nukleat.

(Poedjiadi, 1994)

Beberapa protein mempunyai pengaruh fisiologi terhadap hewan. Daya

racunnya disebabkan oleh antaraksi dengan sub unit ribosom 60s mamalia,

19

mengakibatkan terjadinya hidrolisis beberapa ikatan glikosida-N dengan akibat

penghambatan sintesis protein. Beberapa protein beracun ini mempunyai peran dalam

melindungi tumbuhan dari serangan mikroba. Protein ini memberi banyak harapan

pada pengobatan kanker dan penyakit yang disebabkan oleh virus (Robinson, 1991).

Protein-protein tersebut antara lain :

1. alergen, disebut juga proteon.

Protein ini tersebar luas dalam biji (terutama dalam biji yang banyak

mengandung lemak) dan memiliki pengaruh sensitisasi pada orang-orang

tertentu yang peka. Contohnya proteon yang terdapat pada biji jarak.

2. inhibitor enzim

Inhibitor enzim dari tumbuhan yang paling dikenal adalah inhibitor protease

yang berasal dari biji kacang polong. Beberapa bersifat alergen.

3. protein beracun

Beberapa biji mengandung protein yang mempunyai pengaruh fisiologi yang

kuat terhadap hewan. Contohnya adalah risin yang berasal dari biji jarak.

Contoh lainnya adalah protein yang menunjukkan daya racunnya sebagai

inhibitor ribosom (Robinson, 1991).

Fraksinasi bertujuan untuk memisahkan campuran protein ke dalam suatu seri

fraksi protein (Scopes, 1994). Ada dua macam cara yang biasa digunakan dalam

proses fraksinasi yakni, dengan jalan pengendapan dan kromatografi. Fraksinasi

protein dengan jalan pengendapan dapat dilakukan dengan menggunakan amonium

20

sulfat dalam konsentrasi tertentu (Poedjiadi, 1994). Hasil pengendapan kemudian

didialisis untuk menghilangkan amonium sulfat yang sebelumnya digunakan untuk

mengendapkan protein. Dasar dari metode dialisis ini adalah adanya gradien

konsentrasi antara dua permukaan membran dialisis. Molekul kecil, dalam hal ini

adalah amonium sulfat, akan keluar dari kantong dialisis dan protein yang

mempunyai bobot molekul besar akan tetap tertinggal di dalam kantong dialisis. Hal

ini juga dapat terjadi karena membran dialisis bersifat semi permeabel (Kerese,

1984).

D. Kultur Sel

Kultur sel primer adalah sel yang disolasi dari suatu jaringan dan kemudian

ditumbuhkan secara in vitro, sedangkan subkultur dapat diartikan sebagai

pemindahan sel ke flask baru dengan medium yang baru. Hal ini memungkinkan

terjadinya perluasan kultur yang dikenal dengan cell line.

Setiap kultur sel akan memasuki periode laten (lag phase), diikuti dengan

pertumbuhan secara eksponensial (log phase), dan pada akhirnya akan mencapai

plateau phase. Medium yang berubah warna menjadi kuning menandakan nutrisi

dalam medium telah habis, sehingga perlu dilakukan penggantian medium atau

subkultur (Mahardika, 2003).

Sel yang dipilih dalam uji sitotoksisitas tergantung pada tujuan yang ingin

dicapai. Umumnya, sel yang dipilih adalah sel yang cepat pertumbuhannya dan

21

mudah penanganannya, misalnya Chinese Hamster Ovary Cell (CHO), HeLa, Baby

Hamster Kidney cell (BHK), atau L929.(Widiyani, 2005).

1. Sel HeLa

HeLa Cell line merupakan cell line cervix intraepitel (Cervical Intraepithelial

Carcinoma) akibat infeksi HPV 18. Sel ini diisolasi dari seorang wanita penderita

kanker yang berusia 31 tahun bernama Henrietta Lacks di Baltimore, USA. HeLa

Cell line ini cukup aman dan umum digunakan untuk kepentingan kultur sel

(Widiyani, 2005).

Hela Cell line dapat digunakan untuk uji antitumor, uji sitotoksisitas, biologi

sel, dan kemampuan invasi bakteri. Sel ini diketahui dapat hidup dan berkembang

biak dengan sangat baik dalam kultur buatan di laboratorium sehingga banyak

digunakan dalam penelitian-penelitian di seluruh dunia. (Widiyani, 2005). Sel HeLa

dapat dikultur dengan menggunakan medium RPMI 1640 (Freshney, 1986).

2. Sel Vero

Epithelial sel Vero ditemukan pada tahun 1962 oleh Y. Yasumura dan Y.

Kawakita dari Universitas Chiba, Jepang. Sel tersebut didapatkan dari ginjal monyet

hijau Afrika dewasa yang sehat. Selain kegunaannya sebagai sel substrat bagi vaksin,

sel Vero juga sering digunakan untuk studi replikasi virus (Anonim, 2002).

E. Uji Sitotoksisitas

Program pengembangan obat untuk identifikasi agen kemoterapeutik kanker

yang baru melibatkan evaluasi preklinik yang luas dan sejumlah besar senyawa

22

kimia. Uji tersebut biasanya dilakukan pada hewan percobaan yang memiliki

persamaan sifat dengan manusia. Penelitian menggunakan hewan uji memegang

peranan penting, namun ada beberapa pertimbangan yang menyebabkan

kecenderungan untuk menggunakan kultur sel. Pertimbangan tersebut antara lain, tes

invitro lebih murah dibanding in vivo, ada perbedaan proses fisiologis antar hewan

percobaan dan manusia, dan adanya pertimbangan moral di dalam penggunaan hewan

untuk penelitian (Freshney, 1986).

Penggunaan kultur sel memungkinkan mekanisme toksisitas dapat dikerjakan

lebih efektif karena kondisi sel lebih mudah dikontrol maupun dimodifikasi. Di

bawah ini merupakan beberapa metode yang dapat digunakan untuk uji sitotoksik:

a. Metode Haemocytometer Counting

Metode ini merupakan metode yang paling sederhana, paling langsung dan

paling murah untuk menghitung jumlah sel yang tersuspensi. Penentuan jumlah sel

yang hidup dengan dye exclusion melibatkan pencampuran suspensi sel dengan

sejumlah tertentu buffer atau larutan saline yang mengandung pewarna larut air

(erythrocin B atau trypan blue). Penunjuk sitotoksisitas berdasarkan pada kerusakan

membran. Sel yang tidak berwarna merupakan sel yang hidup sedangkan sel yang

berwarna merupakan sel yang mati (Sadarum, 2006). Sebagai contoh dengan

menggunakan trypan blue, dimana sel yang mati akan tercat biru gelap sedangkan sel

yang hidup akan berwarna terang dan transparan. Jumlah sel yang mati dihitung

dengan bantuan haemocytometer (Prabaningdyah, 2002).

23

b. Menggunakan senyawa radioaktif

Biasanya digunakan timidin yang dilabel dengan tritium. [3H]-thymidin akan

berinkorporasi dengan DNA seluler. Metode ini akurat, tetapi membutuhkan waktu

yang lama dan melibatkan penanganan senyawa radioaktif. Selain itu dapat

digunakan isotop 51Cr dimana pelepasannya dari sel yang mengalami lisis dapat

dikuantifikasi (ATCC, 2001).

c. Efisiensi pembentukan koloni

Metode ini benar-benar mengukur viabilitas sel, dimana suatu sel tunggal

ditumbuhkan dalam waktu yang cukup untuk membelah diri sampai membentuk

koloni yang dapat dilihat mata dan dapat dihitung. Permasalahan dari metode ini

adalah pengenceran yang dilakukan untuk mengisolasi suatu sel tunggal dapat

menyebabkan stress pada sel, selain itu metode ini membutuhkan waktu yang lama

(Sadarum, 2006).

d. Metode MTT

Pada uji MTT, garam tetrazolium, (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-

dipheniltetrazolium bromid), secara aktif diabsorbsi ke dalam sel hidup dan direduksi

dalam mitokondrial membentuk suatu produk formazan berwarna ungu. Produk

tersebut terakumulasi di dalam sel karena tidak dapat keluar menembus membran sel

(Barile, 1997). Setelah diinkubasi selama 2-4 jam, dengan penambahan suatu deterjen

kristal tersebut akan terlarut. Warna yang terbentuk dapat ditentukan secara

kuantitatif dengan ELISA plate reader pada panjang gelombang 550 nm. Intensitas

24

warna yang terbentuk berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup (ATCC,

2001).

F. Landasan teori

Kanker merupakan nama umum untuk lebih dari 100 jenis penyakit yang

bervariasi, ditandai dengan adanya pertumbuhan sel-sel yang tidak terkontrol, invasi

jaringan lokal, dan kemampuan untuk menyebar luas (distant metastases) (Balmer et

al, 2005). Perkembangan penyakit kanker merupakan suatu proses rumit yang

melibatkan tidak hanya satu perubahan genetik namun juga faktor-faktor epigenetik

(misalnya aksi hormonal tubuh, paparan bahan-bahan karsinogen, dan lain-lain) yang

tidak berkembang menjadi kanker itu sendiri namun dapat meningkatkan

kemungkinan terjadinya mutasi pada DNA sel yang pada akhirnya menyebabkan

terjadinya kanker (Rang et al, 2003).

Pada umumnya, kerja antikanker berdasarkan atas gangguan pada salah satu

proses sel yang esensial. Karena tidak ada perbedaan kualitatif antara sel kanker

dengan sel normal, maka semua antikanker bersifat mengganggu sel normal, bersifat

sitotoksik, dan bukan kankerosid atau kankerotoksik yang selektif (Nafrialdi dan Gan,

1995). Karena hal itulah maka pencarian obat antikanker masih terus dilakukan

sampai sekarang.

Menurut National Cancer Institute (NCI), suatu senyawa dikatakan bersifat

antikanker apabila memiliki harga LC50 ≤ 20 µg/ml (Suffness dan Pezzuto, 1991).

Suatu antikanker diharapkan memiliki toksisitas selektif, artinya dapat

25

menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal. Terapi hanya dapat

dikatakan berhasil dengan baik bila dosis yang digunakan dapat mematikan sel

kanker tanpa terlalu mengganggu sel normal yang berproliferasi (Nafrialdi dan Gan,

1995).

Mimba telah lama dikenal dalam dunia kesehatan sebagai tanaman yang

memiliki banyak khasiat. Setiap bagiannya memiliki aksi farmakologis sehingga

dapat digunakan sebagai obat. Salah satu khasiat mimba yang banyak menarik minat

khalayak saat ini adalah aktivitasnya sebagai antikanker. Fakta bahwa mimba telah

digunakan untuk mengobati kanker sejak lama dalam pengobatan tradisional

membuat penelitiannya sebagai antikanker menjadi semakin menarik untuk

dilakukan.

Penelitian terhadap daun mimba terkait dengan aktivitasnya sebagai

antikanker telah banyak dilakukan. Salah satunya adalah penelitian yang dilakukan

oleh Febriani pada tahun 2004 yang menyatakan bahwa fraksi total protein daun

mimba memiliki daya sitotoksik terhadap sel HeLa, namun tidak berpotensi untuk

dikembangkan menjadi senyawa antikanker karena harga LC50 yang didapatkan

masih terlalu besar. Dari hal ini, muncul dugaan bahwa protein yang berperan sebagai

antikanker masih terlalu kecil jumlahnya dibandingkan dengan jumlah total protein

yang ada, sehingga aktifitas farmakologisnya tidak seperti yang diharapkan.

Berdasarkan dugaan tersebut, fraksi total protein daun mimba kemudian difraksinasi

menjadi 30%, 60%, dan 100% dengan harapan akan didapatkan titik terang menuju

ditemukannya senyawa antikanker baru.

26

Dalam penelitian tersebut (Suwanto, 2006), diketahui bahwa ternyata yang

memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker adalah fraksi

protein 30% dan 60%. Agar dapat diketahui fraksi protein berapakah yang memiliki

daya sitotoksik optimal, fraksinasi dipersempit lagi menjadi 30%, 40%, 50%, dan

60%.

Fraksi protein daun mimba sudah dipastikan memiliki daya sitotoksisitas

terhadap sel HeLa, maka langkah selanjutnya adalah ujicoba terhadap sel normal

(Vero Cell Line). Diharapkan fraksi protein daun mimba bersifat sitotoksik dan

selektif terhadap sel HeLa, sehingga dapat dipertimbangkan sebagai senyawa

antikanker.

G. Keterangan empiris

Fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) bersifat sitotoksik

dan selektif terhadap kultur sel HeLa.

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan penelitian

acak lengkap pola searah.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas

Konsentrasi FP30, FP40, FP50, dan FP60 jenuh. Ada 11 konsentrasi yang

digunakan, yaitu 0,2 µg/mL, 0,4 µg/mL, 0,8 µg/mL, 1,6 µg/mL, 3,13 µg/mL,

6,25 µg/mL, 12,5 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL,. 100 µg/mL, dan 200 µg/mL.

b. Variabel tergantung

Persentase kematian sel HeLa dan sel Vero pada kultur sel.

c. Variabel pengacau terkendali

Suhu, pH, waktu pemanenan daun mimba, dan media yang digunakan untuk

menumbuhkan sel. Suhu pembuatan dan penyimpanan fraksi protein dikendalikan

pada suhu 4oC, pH dikendalikan dengan penggunaan larutan dapar natrium fosfat

5mM pH 7,2 yang mengandung dan tidak mengandung 0,14 M NaCl, waktu

pemanenan daun mimba dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan

waktu yang sama, sedangkan media tumbuh sel dikendalikan dengan medium

27

28

RPMI untuk sel HeLa dan M199 untuk sel Vero. Masing-masing mengandung

Foetal Bovine Serum (FBS) 10%.

a. Variabel pengacau tak terkendali

Kematian sel HeLa dan sel Vero secara alami

2. Definisi operasional

a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari fraksi protein daun mimba

terhadap sel HeLa dan sel normal.

b. Uji sitotoksisitas adalah uji toksisitas secara in vitro menggunakan kultur sel.

c. FP30, FP40, FP50, dan FP60 adalah fraksi protein daun mimba yang diperoleh

dari hasil pengendapan dengan garam amonium sulfat pada konsentrasi 30%,

40%, 50% dan 60%, dinyatakan dalam µg/ml.

d. Sel HeLa adalah sel kanker leher rahim akibat infeksi HPV tipe 18.

e. Sel Vero adalah derivat sel epitel dari ginjal kera hijau Afrika (Cercopithecus

aethiops) yang sehat.

f. LC50 ialah konsentrasi fraksi protein daun mimba yang mampu membunuh

atau menyebabkan kematian sejumlah 50% sel HeLa atau 50% sel Vero dan

dinyatakan dalam µg/ml.

B. Bahan atau Materi Penelitian

1. Daun segar tanaman mimba yang tumbuh di halaman LPPT unit III UGM, yang

terletak di Jalan Kaliurang, Sleman, pada bulan Juni 2006.

29

2. Kultur sel HeLa dari stok Laboratorium Ilmu Hayati Universitas Gadjah Mada

Yogyakarta.

3. Kultur sel Vero yang diambil dari stok Laboratorium Ilmu Hayati Universitas

Gadjah Mada.

4. Pereaksi yang digunakan untuk isolasi dan penetapan konsentrasi protein daun

mimba dengan bahan grade pro analys (Merck):

a. Larutan dapar Natrium Fosfat 5mM pH 7,2

b. Larutan dapar Natrium Fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl

c. Ammonium Sulfat

5. Pereaksi untuk uji toksisitas pada sel HeLa:

a. Media pencuci : RPMI 1640 (Sigma), Natrium bikarbonat, Hepes (Sigma).

b. Media penumbuh sel HeLa : RPMI 1640 (Sigma), Foetal Bovine Serum

(FBS) 10% (Gibco), Penisilin-Streptomisin 1% (Gibco), dan Fungison

0,5% (Gibco).

c. Media penumbuh sel Vero : M199, Foetal Bovine Serum (FBS) 10%

(Gibco), Penisilin-Streptomisin 1% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco).

d. Reagen Stopper : natrium dodeksil sulfat 10% dalam HCl 0,01 N.

e. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)

(Sigma).

f. Bahan untuk isolasi sel Vero : tripsin 0,25 %.

30

C. Alat-alat Penelitian

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas,

stamper, mortir, timbangan analitik (AND ER-400 H), alumunium foil, magnetic

stirrer dan pH meter (TOA electronic HM-5S), tabung conical, mesin vortex

(Thermolyne Maximi), autoklaf, Hi-Mac Sentrifuge (HITACHI SCP85H), tissue

culture flask, inkubator (Nuaire), mikropipet (Finnpipet campus), membran dialisis

(Sigma), lemari pendingin, 96-well plate (Nunc), spektrofotometer UV (Cecil CE-

292), ELISA reader (SLT 340 ATC), laminar air flow (Nuaire), mikroskop

(Olympus IMT-2), haemocytometer (Nebauer), kain monel, tissue, glove, dan masker.

D. Tatacara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun mimba,

telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Farmakognosi Fitokimia,

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga

kebenarannya dengan menggunakan acuan baku (Backer dan Backuizen van den

Brink, 1965).

2. Pengumpulan daun mimba

Daun mimba yang digunakan untuk penelitian ini diambil dari pohon

mimba yang tumbuh di halaman LPPT unit III UGM, yang terletak di Jalan

Kaliurang, Sleman, pada bulan Juni 2006.

31

3. Sterilisasi alat dan bahan

Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat

yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat

tersebut dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan, setelah itu dibungkus

dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada

suhu 121°C.

4. Pembuatan fraksi protein

Daun segar tanaman mimba dikumpulkan, diseleksi, kemudian dicuci

bersih dengan air mengalir. Setelah dipotong kecil-kecil, 400 gram daun tanaman

mimba dibungkus dengan kantong plastik bersih dan disimpan di dalam freezer

selama semalam bersama dengan mortir, stamper, dan reagen-reagen yang akan

digunakan untuk proses selanjutnya, dimana bahan-bahan tersebut sudah

disterilkan sebelumnya dengan menggunakan autoklaf.

Daun ditumbuk halus dengan ditambahkan sesedikit mungkin larutan

dapar Natrium Fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl dalam mortir

yang ditempatkan dalam baskom berisi air es. Hasil tumbukan kemudian diperas

dengan menggunakan kain monel, cairan hasil perasan ditampung dalam tabung

conical yang bersih dan steril.

Cairan tersebut kemudian disentrifus pada 8000 rpm selama 20 menit.

Supernatan yang diperoleh, disebut ekstrak gubal, dikumpulkan dalam labu ukur

yang bersih dan steril dan diukur volumenya. Protein dalam supernatan

kemudian diendapkan dengan menggunakan ammonium sulfat sebanyak 27,45 g

32

gram perlahan-lahan sambil terus diaduk dengan magnetic strirrer selama

semalam dalam lemari es, dilanjutkan dengan sentrifugasi 8000 rpm selama 20

menit. Hasilnya berupa supernatan (1) dan pellet. Pellet yang diperoleh

dilarutkan dengan sesedikit mungkin larutan dapar Natrium Fosfat 5mM pH 7,2

hingga volumenya mencapai 3 ml, kemudian didialisis selama semalam dalam

larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Hasil dialisis disentrifus 8000 rpm

selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang didapatkan dari proses ini

merupakan sampel fraksi protein dengan konsentrasi 10% jenuh.

Supernatan (1) kemudian ditambah dengan amonium sulfat sebanyak

27,47 gram, di-stirrer semalam, kemudian disentrifus lagi dengan kecepatan

8000 rpm selama 20 menit pada suhu 4oC. Supernatan (2) ditampung dan pelet

yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat

5 mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3ml, kemudian didialisis selama

semalam dalam larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Hasil dialisis

disentrifus 8000 rpm selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang

didapatkan dari proses ini merupakan sampel fraksi protein dengan konsentrasi

20% jenuh.

Supernatan (2) kemudian ditambah dengan amonium sulfat sebanyak

28,35 gram, di-stirrer semalam, kemudian disentrifus lagi dengan kecepatan

8000 rpm selama 20 menit pada suhu 4oC. Supernatan (3) ditampung dan pelet

yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat

5 mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3ml, kemudian didialisis selama

33

semalam dalam larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Hasil dialisis

disentrifus 8000 rpm selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang

didapatkan dari proses ini merupakan sampel fraksi protein dengan konsentrasi

30% jenuh.

Supernatan (3) kemudian ditambah dengan amonium sulfat sebanyak

29,3 gram, di-stirrer semalam, kemudian disentrifus lagi dengan kecepatan 8000

rpm selama 20 menit pada suhu 4oC. Supernatan (3) ditampung dan pelet yang

diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM

pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3ml, kemudian didialisis selama semalam

dalam larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Hasil dialisis disentrifus 8000

rpm selama 20 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang didapatkan dari proses ini

merupakan sampel fraksi protein dengan konsentrasi 40% jenuh.

Langkah yang sama dilakukan untuk mendapatkan fraksi protein 50%

dan 60% jenuh. Fraksi protein 50% jenuh didapatkan dengan menambahkan

ammonium sulfat sebanyak 30,3 gram, sedangkan fraksi protein 60% jenuh

didapatkan dengan menambahkan ammonium sulfat sebanyak 31,35 gram. Bila

diringkas dalam bentuk bagan, maka proses pembuatan fraksi protein dapat

dituliskan sebagai berikut:

daun dipanen kemudian dicuci dengan air mengalir

↓ daun dipotong kecil-kecil, kemudian ditaruh dalam freezer -20º C

sedangkan alat-alat dan reagen yang akan digunakan ditaruh dalam refrigerator

pada suhu 4º C

34

↓ daun ditumbuk dengan mortir dan stamper pada suhu rendah (sekitar 4º C)

↓ diperas dengan kain monel

↓ cairan yang didapatkan disentrifus 8000 rpm selama 20 menit

pellet dibuang, supernatan yang diambil berupa ekstrak gubal

↓ ekstrak gubal ditambah dengan ammonium sulfat 27,45 gram, distirrer semalam

dalam refrigerator

↓ disentrifus 8000 rpm selama 20 menit

Pellet (1) + larutan dapar Na Phospat, didialisis selama semalam, kemudian

disentrifus 8000 rpm selama 20 menit, supernatan diambil → FP10

↓ Supernatan (1) + ammonium sulfat 27,47 gram, kemudian distirrer semalam

dalam refrigerator

Pellet (2) + larutan dapar Na Phospat, didialisis selama semalam, disentrifus

8000 rpm selama 20 menit, kemudian diambil supernatannya → FP20

↓ Supernatan (2) + ammonium sulfat 28,35 gram, distirrer semalam dalam

refrigerator

Pellet (3) + larutan dapar Na Phospat, didialisis selama semalam, disentrifus

8000 rpm selama 20 menit, kemudian diambil supernatannya → FP30

↓

35

Supernatan (3) + ammonium sulfat 29,3 gram, distirrer semalam dalam

refrigerator

↓ Pellet (4) + larutan dapar Na Phospat, didialisis selama semalam, disentrifus

8000 rpm 20 menit, kemudian diambil supernatannya → FP40

↓ Supernatan (4) + ammonium sulfat 30,3 gram, distirrer semalam dalam

refrigerator

↓ Pellet (5) + larutan dapar Na Phospat, didialisis selama semalam, disentrifus

8000 rpm 20 menit, kemudian diambil supernatannya → FP50

↓ Supernatan (5) + ammonium sulfat 31,35 gram, distirrer semalam dalam

refrigerator

↓ Pellet (6) + larutan dapar Na Phospat, didialisis selama semalam, disentrifus

8000 rpm 20 menit, kemudian diambil supernatannya → FP60

5. Pengukuran konsentrasi fraksi protein

Fraksi protein yang diendapkan dengan amonium sulfat (FP30, FP40, FP50,

dan FP60), masing-masing sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml lalu

ditambah 990 µl larutan dapat natrium fosfat 5mM pH 7,2. Diukur serapannya

dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm.

Sebagai kontrol digunakan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2.

36

Menurut Layne, konsentrasi protein yang diperoleh dapat dihitung dengan

rumus:

Concentration = [1.55E(280)] – [0.76E(260)] mg ml-1

(Layne cit Richterich dan Colombo, 1981).

6. Propagasi dan panen sel HeLa dan sel Vero

a. Propagasi sel HeLa dan sel Vero

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, lalu dengan segera dicairkan

diatas penangas air 37°C. Ampul disemprot dengan etanol 70% kemudian

dibuka. Sel dipindahkan lagi ke dalam tabung conical steril yang berisi

medium. Untuk sel HeLa, medium berisi RPMI 1640, sedangkan untuk

sel Vero, mediumnya berisi M199. Suspensi sel disentrifus lagi selama 5

menit. Supernatan dibuang, sedangkan pellet ditambah dengan 1 ml

medium penumbuh yang mengandung 20% FBS. Disuspensikan perlahan

hingga homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam 3-4 buah tissue

culture flask kecil, diinkubasi dalam incubator 37°C dengan aliran 5%

CO2. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan hingga

konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian (Freshney, 1986).

b. Panen sel HeLa dan sel Vero

Setelah jumlah sel cukup untuk penelitian, medium diganti

dengan yang baru sebanyak 5 ml. Sel dilepaskan dari dinding flask

dengan cara disuspensikan dengan menggunakan pipet Pasteur. Sel

37

kemudian dipindahkan ke dalam tabung conical steril, medium ditambah

sampai volume 10 ml kemudian disentrifus 3000 rpm selama 5 menit.

Supernatan yang didapat dibuang sedangkan pellet disuspensikan

kembali secara perlahan dengan 1 ml media. Jumlah sel dihitung dengan

menggunakan haemocytometer. Suspensi sel kemudian ditambahkan

dengan sejumlah medium sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 5 x 104

sel/ 200 μl yang akan digunakan untuk penelitian (Freshney, 1986).

7. Uji sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan sel Vero

Seratus μl suspensi sel HeLa dengan konsentrasi 104 sel/ 200 μl

dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran pada 96-well plate dan diinkubasi

bersama dengan fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi dilakukan

selama 5 kali dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 11 baris

sumuran. Sebagai kontrol, 100 μl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran

yang berisi medium dan larutan dapar Natrium Fosfat 5mM pH 7,2. Sedangkan

untuk faktor koreksi, 100 μl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi

medium dan larutan dapar Natrium Fosfat 5mM pH 7,2. Selanjutnya, sel

diinkubasikan dengan aliran 5% CO2 pada suhu 37°C. pada akhir inkubasi,

masing-masing sumuran ditambahkan dengan 10 μl MTT 2,5 μl/ml, dan

diinkubasi lagi selama semalam pada 37° C. Sel yang hidup akan bereaksi

dengan MTT membentuk kristal formazan yang berwarna ungu. Reaksi MTT

dihentikan dengan penambahan reagen stopper, kemudian diinkubasikan lagi

38

selama semalam pada suhu kamar. Kemudian, serapan dibaca dengan ELISA

Reader pada panjang gelombang 550 nm.

E. Analisis hasil

Pada metode MTT ini, serapan yang terbaca menunjukkan jumlah sel

yang hidup. Hasil akhir uji sitotoksisitas yaitu persentase kematian sel yang

dihitung menggunakan modifikasi rumus Abbot, dengan persamaan berikut:

% Kematian sel = 100% x A

C)(BA −−

Keterangan :

A = Rata-rata absorbansi kontrol

B = Rata-rata absorbansi perlakuan

C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa sel (Meyer, 1982)

Perhitungan LC50 dilakukan secara statistik menggunakan analisis probit.

Untuk mengetahui jenis distribusi data, dilakukan uji Kolmogorov-Smirnov.

Setelah itu, sitotoksisitas sel Hela dan sel Vero dibandingkan dengan uji T-test.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Sterilisasi Alat

Istilah sterilisasi yang digunakan pada sediaan-sediaan farmasi berarti

penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya atau

penghancuran secara lengkap mikroba dari sediaan. Dalam penelitian ini, alat-alat

yang akan digunakan disterilkan terlebih dahulu dengan menggunakan metode

sterilisasi uap (panas lembab). Sterilisasi uap dilakukan dengan autoklav dan

menggunakan uap air dengan tekanan. Cara diakui sebagai cara yang terpilih pada

hampir semua keadaan. Metode ini biasa digunakan pada bahan-bahan yang dapat

tahan terhadap penembusan uap air dan temperatur yang digunakan (Ansel, 1989).

Sterilisasi perlu dilakukan untuk menghilangkan mikroorganisme agar tidak

mengganggu penelitian.

Prinsip dari metode panas lembab adalah terjadinya koagulasi dan denaturasi

pada protein esensial mikroorganisme akibat penetrasi uap panas ke dalam membran

sel mikroorganisme. Metode panas lembab membunuh mikroorganisme lebih cepat

dan efisien dibandingkan dengan metode lain, karena uap air panas lebih mudah

melakukan penetrasi ke dalam membran sel mikroorganisme. Metode ini juga mampu

membunuh mikroorganisme pada suhu yang relatif rendah dan hanya membutuhkan

waktu yang singkat tergantung pada tekanan yang digunakan (Ansel, 1989).

39

40

B. Preparasi Fraksi Protein Daun Mimba

Setiap tempat memiliki karakteristik yang berbeda sehingga spesies tanaman

yang sama dapat memiliki kualitas kandungan kimia yang berbeda bila ditanam di

tempat yang berbeda. Untuk menghindari hal ini, daun mimba yang digunakan

diambil dari 1 pohon dalam sekali panen. Daun yang dipilih tidak terlalu tua atau

terlalu muda sehingga diharapkan memiliki kandungan senyawa aktif yang optimal.

Untuk preparasi fraksi protein, daun mimba segar yang telah dipetik dicuci

terlebih dahulu dengan air mengalir untuk membersihkan kotoran yang melekat.

Setelah dipotong kecil-kecil, 400 gram daun mimba digerus dalam mortir dengan

penambahan sesedikit mungkin larutan dapar Na fosfat 5mM pH 7,2. Larutan dapar

berfungsi untuk menjaga stabilitas, dengan menciptakan kondisi yang isotonis dengan

cairan dalam tanaman. NaCl yang terkandung dalam larutan dapar berfungsi untuk

mempermudah kelarutan protein dan menjaga stabilitas, sedangkan pemotongan daun

mimba menjadi bagian-bagian kecil bertujuan untuk mempermudah proses

penggerusan. Mortir dan stamper didinginkan terlebih dahulu di dalam refrigerator.

Saat penggerusan dilakukan suhunya harus dijaga agar tetap rendah (sekitar 4˚C) agar

kandungan protein dalam daun mimba tidak mengalami kerusakan sehingga tidak

kehilangan aksi biologisnya. Penggerusan dilakukan di dalam mortir yang ditaruh

dalam baskom berisi es batu. Setelah digerus, bahan diperas dengan kain monel

kemudian ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Dari 400 gram

daun mimba, didapatkan 515 ml ekstrak gubal.

41

Protein dalam ekstrak gubal daun mimba dipisahkan dengan penambahan

amonium sulfat dalam jumlah tertentu sehingga didapatkan konsentrasi fraksi protein

yang diinginkan. Amonium sulfat dipilih karena beberapa alasan :

1. kelarutannya yang tinggi pada suhu rendah.

2. harganya murah.

3. ammonium sulfat dapat mengendapkan hampir semua jenis protein dan

merupakan jenis garam yang paling sering digunakan untuk pengendapan

protein.

4. ammonium sulfat dapat menjaga protein dari denaturasi.

5. amonium sulfat dapat mencegah aktivitas enzim proteolitik dan bersifat

antibakteri.

6. ammonium sulfat bersifat inert, tidak bereaksi dengan protein yang

diendapkan.

Penambahan garam dengan konsentrasi tertentu pada larutan dapat

menyebabkan protein mengendap tanpa terdenaturasi. Mekanismenya adalah

kompetisi antara ion anorganik dalam ammonium sulfat dengan molekul protein

untuk berikatan dengan air.

42

Gambar 2. Protein yang terlarut dalam air

Komponen-komponen ionik di permukaan protein berikatan kuat dengan

molekul air, membuat protein terselubungi air. Ammonium sulfat yang ditambahkan

pada larutan tersebut akan melucuti muatan listrik dan menghilangkan selubung air

dari protein. Hal ini dapat terjadi karena ion garam memiliki kerapatan muatan yang

lebih besar daripada protein, sehingga air lebih tertarik untuk berikatan dengan

protein. Akibatnya, molekul-molekul protein akan saling berinteraksi membentuk

agregat, kemudian mengendap. Metode ini disebut salting out. (Anonim, 2006c)

gambar 3. protein dalam air dengan penambahan ammonium sulfat

Untuk mendapatkan fraksi protein 30%, ditambahkan ammonium sulfat

sebesar 28,35 gram. Sedangkan untuk mendapatkan fraksi protein 40%, 50%, dan

60% jenuh ditambahkan berturut-turut 29,29 gram; 30,3 gram; dan 31,35 gram

amonium sulfat. Penambahan amonium sulfat dilakukan secara bertahap agar

didapatkan protein dalam fraksi-fraksi yang diinginkan. Masing-masing hasil

43

pengendapan tersebut kemudian disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 20

menit pada suhu 4oC agar endapan dan larutannya benar-benar terpisah.

Selanjutnya, dilakukan proses dialisis untuk menghilangkan sisa ammonium

sulfat. Keempat fraksi protein yang didapatkan dimasukkan ke dalam sebuah kantong

yang disebut tubing dialysis. Tubing dialysis ini kemudian direndam dengan larutan

dapar Na fosfat 5mM pH 7,2 dalam sebuah beaker glass yang sudah dipasangi stirrer

magnetic. Pengadukan dengan stirrer magnetic dilakukan untuk mencegah terjadinya

kejenuhan yang tidak merata pada larutan dapar Na fosfat 5mM pH 7,2 di luar tubing

dialysis agar proses dialisis berjalan dengan sempurna.

Prinsip dari metode dialisis adalah terjadinya mekanisme difusi pasif akibat

adanya perbedaan gradien konsentrasi yang besar di dalam dan di luar tubing dialysis.

Bahan yang digunakan untuk tubing dialysis hanya dapat melewatkan partikel-

partikel berukuran tertentu, yaitu di bawah 15.000-20.000 Dalton, sesuai dengan

ukuran pori-pori yang dimilikinya. Partikel ammonium sulfat yang berukuran lebih

kecil daripada protein akan keluar dari tubing dialysis, sedangkan protein yang

berukuran lebih besar dan merupakan makromolekul akan tetap tinggal di dalam.

Selain itu membran dialisis yang memiliki sifat semipermeabel juga mempermudah

terjadinya proses ini. Karena didasarkan pada perbedaan gradien konsentrasi, larutan

dapar harus selalu diganti setiap beberapa jam agar tetap ada perbedaan gradien

konsentrasi. Dialisis akan meningkatkan volume protein di dalam tubing dialysis

44

akibat adanya efek osmotik ammonium sulfat. Karena itu, diberi sedikit sisa tempat

di bagian atas tubing dialysis untuk mencegah kebocoran.

Dialisis dilakukan selama semalam, tujuannya agar pengendapan dapat

berlangsung optimal. Setelah itu, larutan disentrifus untuk memisahkan protein dan

kontaminan. Supernatan yang dihasilkan dari proses sentrifus inilah yang akan diukur

konsentrasinya dengan menggunakan spektrofotometer UV.

C. Penetapan Konsentrasi Fraksi Protein Daun Mimba

Penetapan konsentrasi masing-masing fraksi protein dilakukan dengan

menggunakan spektrofotometer ultraviolet pada 2 panjang gelombang, yaitu 260 dan

280 nm. Absorbansi protein dapat diukur menggunakan spektrofotometer UV karena

asam amino aromatik pada protein, yakni tirosin, triptofan, dan fenilalanin, dapat

menyerap sinar UV karena memiliki gugus kromofor dan auksokrom. Masing-masing

dapat mengabsorbsi secara maksimal pada panjang gelombang 280 nm. Namun,

pengukuran tersebut dapat terganggu karena adanya asam nukleat dan komponennya,

serta senyawa yang mengandung cincin purin dan pirimidin yang juga memiliki

serapan maksimum pada panjang gelombang 280 nm. Oleh karena itu, dilakukan

koreksi senyawa-senyawa tersebut dengan melakukan pengukuran absorbansi protein

pada panjang gelombang 260 nm. Pada penelitian ini, konsentrasi protein yang

didapatkan untuk daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60, berturut-turut adalah

16,4%; 16,15%; 15,94%; 9,25%; 15,2%; dan 35,3%.

45

D. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba

Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba dilakukan pada kultur sel HeLa

yang dibiakkan di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

Metode yang digunakan adalah metode MTT pada kultur sel HeLa dengan

konsentrasi 5x104 sel /200µl media dengan berbagai seri kadar. Yang terkecil adalah

0,2 µg/ml, dan yang terbesar adalah 200µg/ml.

Sel HeLa menggunakan medium RPMI 1640 sedangkan sel Vero

menggunakan M199. Suatu medium yang digunakan sebagai tempat tumbuh sel

harus mengandung banyak komponen yang menunjang fungsi pertumbuhannya. Sel

Hela yang akan digunakan dinkubasikan dalam inkubator dengan dialiri gas CO2,

dimana gas CO2 ini dapat menyebabkan terjadinya perubahan pH medium. Untuk

menghindari hal ini, maka digunakan suatu sistem buffer. Bahan pembuffer yang

digunakan berupa natrium bicarbonat dan Hepes. Pemakaian buffer tunggal seperti

natrium bicarbonat dapat menyebabkan kondisi medium menjadi basa dengan cepat

di luar inkubator. Karena itu, digunakan Hepes yang akan mengatur pH tetap optimal

dan terkontrol. Foetal Bovine Serum (FBS) berfungsi sebagai suplemen pertumbuhan

bagi sel.

Medium penumbuh memiliki kecenderungan untuk ditumbuhi bakteri, karena

itu biasanya digunakan juga suatu antibiotik. Dalam percobaan ini, antibiotik yang

ditambahkan pada medium berupa penisilin-streptomisin dan fungison. Penisilin-

streptomisin merupakan antibiotik berspektrum luas yang mampu membunuh gram

46

positif dan gram negatif, sedangkan fungison berfungsi sebagai antijamur. Untuk

lebih meminimalisir kemungkinan terjadinya pencemaran oleh mikroorganisme, alat-

alat yang akan digunakan disterilkan terlebih dahulu dan seluruh proses yang

melibatkan sel Hela dan sel Vero dilakukan dalam kondisi aseptis.

Prinsip metode MTT ini adalah adanya pemecahan garam tetrazolium MTT

(3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromid) oleh sistem enzim

reduktase suksinat tetrazolium yang terdapat dalam mitokondria sel sehingga

terbentuk kristal formazan berwarna ungu yang tidak larut. Dengan penambahan

reagen stopper, kristal tersebut dapat terlarut sehingga dapat dibaca intensitas

warnanya dengan menggunakan ELISA Reader. Kristal formazan ungu ini hanya

terbentuk pada sel HeLa yang hidup, sehingga semakin banyak sel yang masih hidup

maka akan semakin banyak intensitas warna ungu yang dihasilkan. Hal ini akan

berbanding lurus dengan nilai absorbansi yang terbaca pada ELISA Reader.

Gambar 4. Reaksi MTT menjadi formazan oleh enzim dehidrogenase

47

Gambar 5. kristal formazan

Metode MTT termasuk metode yang aman, sederhana, dan cepat. Aman

karena tidak menggunakan bahan-bahan radioaktif yang membahayakan, sederhana

karena perlakuan yang harus diberikan pada sampel sebelum diuji relatif cukup

mudah, dan cepat karena waktu yang dibutuhkan relatif singkat. Metode ini juga

terbukti cukup akurat, karena absorbansi yang terbaca sebanding dengan jumlah sel

hidup yang masih aktif melakukan metabolisme. Walaupun demikian, metode ini

juga memiliki kelemahan, yakni tidak dapat digunakan untuk sampel yang berwarna

karena dapat mempengaruhi absorbansi yang terbaca oleh ELISA Reader.

Walaupun sampel yang digunakan pada penelitian berwarna hijau kecoklatan,

metode MTT ini tetap dilakukan karena dari penelitian yang dilakukan sebelumnya

(Febriani, 2004), diketahui bahwa metode ini terbukti cukup efektif, bahkan lebih

baik dari metode Trypan Blue.

Pada metode Trypan Blue, sel HeLa yang mati akan berbentuk bulat-bulat

kecil dan berwarna biru karena menyerap zat warna Trypan Blue, sedangkan sel

HeLa yang masih hidup akan berbentuk bulat panjang dan berwarna bening.

Perhitungan jumlah sel yang mati dilakukan sendiri oleh peneliti dengan

menggunakan haemocytometer, sehingga hasilnya akan sangat tergantung pada

48

ketelitian dan objektivitas peneliti. Pada metode MTT, perhitungan dilakukan dengan

alat yang dinamakan ELISA reader, sehingga hasilnya lebih akurat.

Pada penelitian ini dilakukan pengukuran absorbansi dari perlakuan,

perlakuan tanpa sel HeLa, dan kontrol pada masing-masing fraksi protein. Perlakuan

adalah sel HeLa yang diberi fraksi protein daun mimba, sedangkan kontrol adalah sel

HeLa tanpa fraksi protein daun mimba. Perlakuan tanpa sel HeLa digunakan sebagai

faktor koreksi agar absorbansi yang terbaca murni berasal dari intensitas warna yang

dihasilkan oleh sejumlah sel yang tetap hidup setelah pemberian senyawa uji tanpa

adanya pengaruh dari warna senyawa uji yang digunakan. Kontrol digunakan untuk

melihat apakah perlakuan yang diberikan benar-benar memberikan efek terhadap sel

uji. Kontrol negatif yang digunakan berisi sel, medium, dan larutan dapar natrium

fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl. Dari penelitian yang dilakukan

oleh Febriani pada tahun 2002, diketahui bahwa larutan buffer tidak memberikan

pengaruh yang berarti terhadap kematian sel HeLa. Karena itu, tidak perlu dilakukan

uji tersendiri untuk melihat apakah buffer yang digunakan dapat menginduksi

terjadinya kematian pada sel HeLa secara berarti atau tidak.

Di bawah mikroskop, terlihat jelas perbedaan antara sel kontrol dan sel yang

sudah diberi perlakuan. Pada sel Hela dan sel Vero yang sudah diberi perlakuan,

terlihat ada banyak sel yang mati. Sel-sel HeLa yang masih hidup berbentuk seperti

daun memanjang dan melekat pada dasar sumuran (i), sedangkan sel-sel HeLa yang

sudah mati berbentuk bulat dan mengapung (ii).

49

Gambar 6. Sel HeLa

(i). kontrol (ii) sel HeLa dengan perlakuan

Gambar 7. Sel Vero

(i). Kontrol (ii). Sel Vero dengan perlakuan

Sel Vero yang hidup terlihat berbentuk seperti benang-benang halus yang

memanjang (i) sedangkan sel Vero yang mati terlihat berbentuk membulat (ii).

Pengukuran dengan menggunakan ELISA Reader dilakukan pada panjang

gelombang 550 nm. Serapan yang terbaca menunjukkan jumlah sel yang hidup. Hasil

yang didapatkan dari percobaan menunjukkan bahwa kontrol memiliki intensitas

warna yang lebih intensif daripada perlakuan.

50

Hasil akhir uji sitotoksisitas, yaitu persentase kematian sel, dapat diketahui

dengan modifikasi rumus Abbot, dengan persamaan berikut:

% Kematian sel = 100% x A

C)(BA −−

Keterangan :

A = Rata-rata absorbansi kontrol

B = Rata-rata absorbansi perlakuan

C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa sel

(Meyer, 1982)

Tabel II. Hasil uji sitotoksik fraksi protein terhadap sel HeLa dengan metode MTT

Rerata % kematian sel HeLa Konsentrasi fraksi protein (µg/ml)

FP30 FP40 FP50 FP60

1 0,2 85,50 57,60 81,4 84,9 2 0,4 86,70 58,92 83,33 78,46 3 0, 8 85,54 68,23 80,62 77,81 4 1,6 94,09 78,89 74,42 73,03 5 3,1 97,10 94,91 70,65 55,38 6 6,25 90,35 87,47 73,36 70,26 7 12,5 84,60 79,25 88,57 78,07 8 25 97,55 88,38 107,67 102,66 9 50 105,16 73,32 112,67 108,93 10 100 110,16 90,56 147,08 135,26 11 200 89,48 12,76 145,44 142,87

Dari tabel dapat dilihat bahwa pemberian fraksi protein daun mimba mampu

menginduksi kematian sel HeLa pada angka yang cukup tinggi. Bahkan pada

konsentrasi terendah, persentase kematian sel HeLa sudah lebih dari 50%, atau lebih

51

dari separuh jumlah populasinya. Hal ini membuktikan bahwa fraksi protein daun

mimba memang memiliki sifat sitotoksik terhadap sel HeLa.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 2 4 6 8 10 1

konsentrasi

resp

on k

emat

ian

(%)

2

Rerata % kematian sel HeLa FP30 Rerata % kematian sel HeLa FP40

Rerata % kematian sel HeLa FP50 Rerata % kematian sel HeLa FP60

Gambar 8. Grafik persen kematian sel HeLa vs kadar fraksi protein daun mimba

Dari grafik terlihat bahwa respon kematian sel Hela pada konsentrasi

3,1µg/ml meningkat pada FP30 dan FP40. Pada konsentrasi-konsentrasi berikutnya

respon kematian yang ditimbulkan cukup berfluktuatif, menunjukkan peningkatan

konsentrasi fraksi protein daun mimba tidak selalu diiringi dengan peningkatan

respon kematian sel. Hal sebaliknya terjadi pada FP50 dan FP60 yang menurun pada

konsentrasi tersebut, tetapi menunjukkan kecenderungan untuk meningkat pada

konsentrasi-konsentrasi berikutnya.

52

Tabel III. Hasil uji sitotoksik fraksi protein terhadap sel Vero dengan metode MTT

Rerata % kematian sel Vero Konsentrasi fraksi protein (µg/ml)

FP30 FP40 FP50 FP60

1 0,2 64,9 82,9 58,91 59,73 2 0,4 68,93 79,64 56,41 65,3 3 0, 8 67,71 85,06 51,56 58,44 4 1,6 69,16 75,84 67,87 59,4 5 3,1 76,81 76,79 73,3 68,72 6 6,25 82,06 70,07 75,08 70,3 7 12,5 76,18 66,81 75,37 70,51 8 25 85,49 79,22 72,89 75 9 50 90,6 85,14 73,42 75,29 10 100 79,88 75,42 73,57 84,38 11 200 89,50 74,41 69,35 84,22

Fraksi protein daun mimba ternyata menunjukkan efek sitotoksisitasnya

terhadap sel Vero. Sama seperti pada sel Hela, konsentrasi terkecil yang digunakan

sudah mampu menginduksi kematian pada lebih dari separuh populasi sel Vero.

53

grafik plot respon kematian sel Vero

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 1

konsentrasi

resp

on k

emat

ian

(%)

2

Rerata % kematian sel Vero FP30 Rerata % kematian sel Vero FP40

Rerata % kematian sel Vero FP50 Rerata % kematian sel Vero FP60

Gambar 9. Grafik persen kematian sel Vero vs kadar fraksi protein daun mamba

Pada grafik terlihat bahwa pemberian daun mimba FP30 an FP60 berbanding

lurus dengan respon kematian yang ditimbulkan pada sel Vero. Pada FP50, respon

kematian yang ditimbulkan cenderung stabil mulai konsentrasi 1,6µg/ml. Hal ini

mungkin disebabkan karena protein daun mimba yang mampu membunuh sel Vero

mengalami kejenuhan sehingga dengan peningkatan konsentrasi, respon yang

ditimbulkan tetap atau hampir sama. Sedangkan pada FP40 grafik terlihat fluktuatif.

Untuk menghitung nilai LC50 digunakan metode grafik probit Miller-Tainter

dari program SPSS 13. Analisis probit merupakan salah satu analisis regresi yang

digunakan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi dan respon yang berupa

persen kematian sel. Karena FP30, FP40, FP50, dan FP60 pada sel HeLa dan sel Vero

54

memberikan respon kematian lebih dari 50%, maka nilai LC50 ditentukan secara

ekstrapolasi. Hasil ekstrapolasi ini hanya merupakan prediksi karena nilai LC50 yang

diperoleh tidak berada dalam kurva probit.

Tabel IV. Nilai LC50 pada sel Hela dan sel Vero

Sel HeLa Sel Vero FP Daun Mimba LC50

(µg/ml) t

hitung t

tabel LC50

(µg/ml) t

hitung t

tabel FP30 3,72.10-13 0,841 1,415 9,84.10-3 5,552 1,383 FP40 1,8.10-2 2,339 1,383 46,37.1011 1,020 1,383 FP50 1,5.1023 0,056 1,440 9,51.10-3 3,017 1,383 FP60 173,49 1,011 1,467 4,54.10-2 7,338 1,383

Menurut National Cancer Institute (NCI), suatu senyawa dikatakan bersifat

antikanker apabila memiliki harga LC50 ≤ 20 µg/ml (Suffness & Pezzuto, 1991).

Suatu antikanker diharapkan memiliki toksisitas selektif, artinya mampu

menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal (Nafrialdi & Gan,

1995).

LC50 adalah konsentrasi obat (fraksi protein daun mimba) yang dibutuhkan

untuk menimbulkan kematian pada 50% populasi. Semakin kecil nilai LC50 maka

toksisitasnya semakin besar. Hasil analisis probit menunjukkan bahwa urutan fraksi

protein mulai dari yang paling toksik adalah FP30, FP40, FP60, dan FP50. Daun mimba

FP30 dan FP40 kemungkinan dapat dikembangkan sebagai senyawa antikanker karena

masing-masing memiliki nilai LC50 ≤ 20 µg/ml. Hal ini berbeda dengan penelitian

sebelumnya (Suwanto, 2006) yang menyatakan bahwa yang berpotensi sebagai

antikanker adalah FP30 dan FP60. Seperti yang telah disebutkan sebelumnya, fraksi-

55

fraksi protein yang digunakan dalam penelitian ini didapatkan dengan cara fraksinasi

bertingkat. Pada penelitian yang dilakukan oleh Suwanto, fraksinasi dimulai dari

FP30, sedangkan fraksinasi dalam penelitian ini dimulai dari FP10. Tentu saja

keduanya memiliki kandungan yang berbeda. Kemungkinan ada protein-protein

tertentu yang ikut terendapkan pada FP10, FP20, FP30, FP40, atau FP50, sehingga tidak

muncul dalam FP60 dalam penelitian ini tetapi muncul dalam FP60 penelitian tersebut.

Sel-sel HeLa yang digunakan dalam penelitian ini merupakan subjek uji biologis

yang relatif sulit dikendalikan, sehingga mungkin menghasilkan respon yang berbeda.

Agar FP30 dan FP40 bisa dinyatakan dapat dikembangkan sebagai senyawa antikanker,

selektivitasnya terhadap sel normal harus dipastikan.

Dari perhitungan, diketahui bahwa FP30, FP50, dan FP60 tidak memiliki

korelasi yang linier dengan respon kematian pada sel HeLa pada taraf kepercayaan

80%. Hal ini berarti, peningkatan konsentrasi fraksi protein yang diberikan tidak

meningkatkan jumlah kematian pada sel HeLa. Hanya FP40 saja yang memiliki

korelasi linier dengan jumlah kematian sel HeLa. Pada sel Vero, hanya FP40 yang

tidak memiliki korelasi linier dengan respon kematian sel.

Hasil uji Kolmogorov Smirnov menyatakan bahwa distribusi data semua

fraksi adalah normal. Untuk melihat selektivitas fraksi protein daun mimba terhadap

sel Vero dan sel HeLa, dilakukan uji T-test.

56

Lewat uji T-test diketahui bahwa ternyata pengaruh perlakuan terhadap sel

Hela dibandingkan sel Vero adalah berbeda tidak bermakna, sehingga tidak ada

satupun dari keempat fraksi tersebut yang bersifat selektif.

Dalam waktu yang hampir bersamaan dengan penelitian ini, sebenarnya telah

dilakukan juga penelitian yang sama dengan menggunakan fraksi protein yang sama,

yakni FP10, FP20, FP30, FP40, FP50, dan FP60. Perbedaannya adalah pada jenis sel

kanker yang digunakan. Ada 4 jenis sel kanker yang digunakan, yakni sel HeLa, sel

SiHa, sel Myeloma, dan sel Raji. Penelitian-penelitian tersebut dibagi menjadi 2

kelompok, yakni fraksi kecil (FP10, FP20, FP30, dan FP40) dan fraksi besar (FP30, FP40,

FP50, dan FP60). Penelitian dengan fraksi kecil dilakukan oleh Lahrita (2006),

Purnamasari (2007), serta Harsono (2006), sedangkan penelitian dengan fraksi besar

dilakukan oleh Jenny (2006), Ekasaptawati (2007), dan Mellina (2007), berturut-turut

terhadap kultur sel Raji, Myeloma, dan SiHa.

Hasil yang didapatkan dari penelitian-penelitian tersebut menunjukkan bahwa

yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker adalah FP20 dan

FP60 untuk sel Raji, FP20 dan FP40 untuk sel SiHa, dan tidak ada FP yang berpotensi

untuk sel Myeloma.

Menurut Nafrialdi dan Gan (1995), suatu antikanker diharapkan memiliki

toksisitas selektif, artinya mampu menghancurkan sel-sel kanker tanpa merusak sel-

sel pada jaringan normal. Dengan demikian, tidak ada satupun dari keempat fraksi

yang digunakan dalam penelitian ini berpotensi dikembangkan sebagai senyawa

57

antikanker. Namun perlu diingat, penyakit kanker sendiri banyak macamnya.

Masing-masing memiliki jenis sel kanker yang berbeda dan dengan demikian

kemungkinan memiliki sifat dan mekanisme pertahanan yang berbeda pula. Hal ini

dapat dibuktikan dari penelitian-penelitian di atas. Walaupun fraksi protein yang

digunakan sama, metode, serta keseluruhan prosesnya dilakukan bersamaan dengan

penelitian ini, hasil yang didapatkan berbeda. Percobaan ini hanya dilakukan terhadap

sel kanker leher rahim, sehingga dapat dikatakan bahwa fraksi protein daun mimba

tidak dapat digunakan untuk mengobati kanker leher rahim, namun belum tentu tidak

dapat digunakan untuk mengobati jenis kanker lainnya.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Dari hasil penelitian, didapatkan kesimpulan sebagai berikut:

1. nilai LC50 dari daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 terhadap sel HeLa berturut-

turut adalah 3,72.10-13 µg/ml; 1,8.10-2 µg/ml; 1,5.1023 µg/ml; dan 173,49 µg/ml.

2. nilai LC50 dari daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 terhadap sel Vero berturut-

turut adalah 9,84.10-3 µg/ml; 46,37.1011 µg/ml; 9,51.10-3 µg/ml; dan 4,54.10-2

µg/ml.

3. daun mimba FP30 dan FP40 memiliki nilai LC50 ≤ 20 µg/ml, namun tidak ada

satupun yang bersifat selektif.

4. tidak ada satupun fraksi protein daun mimba FP30, FP40, FP50, dan FP60 yang

berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker.

B. Saran

Berdasarkan kesimpulan di atas, maka saran yang dikemukakan untuk penelitian

selanjutnya adalah sebagai berikut:

1. perlu dilakukan uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap jenis sel

kanker lain yang prevalensinya tinggi di Indonesia.

2. perlu dilakukan uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba dengan waktu

inkubasi lebih dari 24 jam.

58

59

3. perlu dilakukan pemurnian fraksi protein daun mimba lebih lanjut agar dapat

diketahui secara lebih spesifik kandungan protein apa yang benar-benar bersifat

sitotoksik.

60

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2001a, Simposium Kanker Nasional, http://www.gramedia-majalahcom.

Diakses pada tanggal 23 September 2006. Anonim, 2002, Vero Cells, http://en.wikipedia.org/wiki/Vero_cells. Diakses pada

tanggal 16 Oktober 2006. Anonim, 2003, HeLa Cell Genes Coding,

http://www.cancerbacup.org.uk/Cancertype/Cervix/General/Thecervix Anonim, 2004a, Hela Cell Culture, Nikon MicroscopyU : Phase Contrast and

DIC Comparison Image Gallery. Anonim, 2004b, Kanker Pandangan Umum, http://www.detok.com/news/05-23-

2004-kanker.htm. Diakses 3 Juni 2006.

Anonim, 2006a, Apa yang Harus Anda Ketahui Tentang Kanker, http://www.mastel.or.id.htm.

Anonim, 2006b, Cancer, http://en.wikipedia.org/wiki/Protein. Diakses pada 23

September 2006.

Anonim,2006c, Ammonium Sulfate Fraction of Protein Mixtures, http://www.bio.mtu.edu.htm. Diakses pada 23 September 2006.

Anonim, 2006d, Hubungan HPV dan Kanker Serviks, Ethical Digest, 31, 12,17,18,

Ansel, H. C., 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, edisi IV, 411-413, UI

Press, Jakarta. Ariyani, 2004, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A.

Juss) terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

ATCC, 2001, MTT Cell Proliferation Assay,

http://www.atcc.org/common/products/MttCell.ctm. Diakses 16 Oktober 2006.

61

Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume II, 116-117,120, N. V. Noordhoff, Graningen.

Barile, F.A., 1997, in Vitro Methods in Pharmaceutical Research, 2-3, 34-43,

Academic Press, Valencia, Spanyol. Biswas, K., Chattopadhyay, I., Banerjee, R.K., Bandyopadhyay, U., 2002,

Biological activities and Medical Properties of Neem (Azadirachta indica), Current Sciences, 82, 1336-1345.

Balmer, C.M., Valley, A.W., dan Ianucci, A., 2005, Cancer Treatment and

Chemotherapy. Pharmacoteraphy, a Patophysiologic Approach, 6th Ed, in DiPiro, J.T., Talbert, R.L., Yee, G.C., Matzke, G.R., Wells, B.G., Posey, L.M (Eds), 2279-2287, McGraw Hill Co.,USA

Candra, 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A.

Juss) Hasil Pengendapan Dengan Amonium Sulfat 30%, 60%, 100% Jenuh Terhadap Sel SiHa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

De Muth, J.E., Basic Statistical and Pharmaceutical Statistical Applications, 574,

Marcel Dekker, Inc., New York. Febriani, A.C., 2004, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta

indica A. Juss) terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture A Practical Approach, Ed. I, 71-73,

IRL Press, Washington DC. Gan, S., dan Nafrialdi, 1995, Antikanker, dalam Ganiswara, S., (Ed),

Farmakologi dan Terapi, 687, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.

Hariadi, A., 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica

A. Juss) Hasil Pengendapan Dengan Amonium Sulfat 30%, 60%, 100% Jenuh Terhadap Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Hutapea, J., 1993, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, 67-68, Badan Litbang

Kesehatan, Departemen Kesehatan Indonesia.

62

Kerese, I., 1984, Methods of Protein Analysis, 71-72, Ellis Horwood Limited, Chichester.

King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2nd Ed, 71-89, School of Biological

Sciences, University of Surrey, England. Lee, H.P., Seo, S.S., 2002, The Application of Human Papillomavirus Testing to

Cervical Cancer Screening, http://www.eyjm.org. Diakses pada tanggal 23 Oktober 2006.

Lusia, S.W.K., 2004, Sitotoksisitas Fraksi Total Daun Mimba (Azadirachta

indica A. Juss) terhadap Kultur Sel Siha, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Mahardika, A.W., 2004, Kursus singkat Kultur Sel, Laboratorium Ilmu Hayati

Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nochols, D.E., Mc

Laughlin, J.L., 1982, Brine shrimp : a convinient general bioassay for active plant convinient, vol 45, Planta Medica.

Murray, R.K., et al, 1995, Biokimia Harper, diterjemahkan oleh Andry Hartono,

Edisi ke-22, 47-50, Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Newman, D.J., dan Cragg, G.M., 2002, Drug from Nature: Past Achievements,

Future Prospects dalam Iwu, M. M., Wotton, J.C. (Eds), Advanced in Phytomedicine vol.1, Ethnomedicine and Drug Discovery, Elsevier, Amsterdam.

Poedjiadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia, 82-124, Universitas Indonesia,

Jakarta. Prabaningdyah, N.K., 2002, Efek Fraksi Protein Sejenis Ribosome Inactivating

Protein (RIPs) dari Biji Mirabilis jalapa L. pada Proses Kematian Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Rang, H.P., Dale, M.M., Ritter, J.M., dan Moore, P.K., 2003, Pharmacology,

fifth (5th) Ed, 693-709, Elsevier Science, London, UK. Richterich, R., Colombo, J.P., 1981, Clinical Chemistry Theory, Practice, and

Interpretation, 408, John Wiley & Sons, Ltd, New York, USA.

63

Robbyono, 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) Hasil Pengendapan Dengan Amonium Sulfat 30%, 60%, 100% Jenuh Terhadap Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Robinson, T., 1991, The Organic Constituents of Higher Plants, 6th edition,

diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dalam Sutomo, T. (Ed), 246-248, Penerbit ITB, Bandung.

Sadarum, M.T., 2006, Uji Efek Sitotoksik dari Daun Mirabilis jalapa L. Hasil

Pemisahan Menggunakan Kolom Ioenaustsuscher typ II terhadap Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Scopes, R.K., 1994, Protein Purification, Principles and Practice, 2nd Edition,

Jeringer Verleg, New York. Sofyan, R., 2000, Terapi Kanker pada Tingkat Molekuler,

http://www.kalbefarma.com. Diakses pada tanggal 29 Mei 2007. Suffness, M., dan Pezzuto, J.M., 1991, “Assay Related to Cancer Drug

Discovery”, Methods in Plant Biochemistry: Assay for Bioactivity Vol. 6, Academic Press, London.

Sukrasno dan Tim Lentera, 2003, Mimba, Tanaman Obat Multifungsi, 3, 4,

Agromedia Pustaka, Jakarta. Sumarny, R., 2004, Paradigma Pengobatan Kanker,

http://rudyct.tripod.com/sem2_012/ros_sumarny.htm. Suwanto, N.B., 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta

indica A. Juss) Hasil Pengendapan Dengan Amonium Sulfat 30%, 60%, 100% Jenuh Terhadap Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Widiyani, L.R., 2005, Uji Sitotoksisitas Senyawa (2E)-3 (4’-Hidroksi-

3’metoksifenil)-(4’’-metoksifenil)prop-2-en-1-on dan calkon terhadap sel HeLa dan sel Vero, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

64

Lampiran 1. Jumlah Penambahan Amonium Sulfat pada Derajat Kejenuhan Tertentu

Tabel V. Volume larutan ektrak gubal protein daun mimba

Fraksi Protein FP10 FP20 FP30 FP40 FP50 FP60

Volume Ekstrak

515 ml 500 ml 500 ml 500 ml 500 ml 500 ml

Penambahan ammonium sulfat dihitung dengan rumus:

)1.3,0(100)12(533

SSSG

−−

=

dimana

S1 = % kejenuhan pada larutan awal

S2 = % kejenuhan pada larutan akhir

G = jumlah ammonium sulfat yang ditambahkan per 1 liter larutan (gram)

(Anonim, 2006c)

a. Jumlah ammonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan

10%

=G )0.3,0(100

)010(533−

− = 53,3 gram/L

Jadi, amonium sulfat yang ditambahkan untuk 515 ml larutan = 27,45 g.

65

b. Jumlah ammonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan

20%

=G )10.3,0(100)1020(533

−− = 54,95 gram/L

Jadi, amonium sulfat yang ditambahkan untuk 500 ml larutan = 27,47 g.

c. Jumlah ammonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan

30%

=G )20.3,0(100)2030(533

−− = 56,7 gram/L

Jadi, amonium sulfat yang ditambahkan untuk 500 ml larutan = 28,35 g.

d. Jumlah ammonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan

40%

)30.3,0(100)3040(533

−−

=G = 58,6 gram

Jadi, amonium sulfat yang ditambahkan untuk 500 ml larutan = 29,3 g.

e. Jumlah ammonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan

50%

)40.3,0(100)4050(533

−−

=G = 60,6 gram/L

Jadi, amonium sulfat yang ditambahkan untuk 500 ml larutan = 30,3 g.

66

f. Jumlah ammonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan

60%

)50.3,0(100)5060(533

−−

=G = 62,7 gram

Jadi, amonium sulfat yang ditambahkan untuk 500 ml larutan = 31,35 g.

67

Lampiran 2. Cara Perhitungan Kadar Protein

Perhitungan menurut Layne:

Concentration = [1.55E(280)] – [0.76E(260)] mg ml-1

(Richterich and Colombo, 1981)

Tabel VI. Absorbansi fraksi protein pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm

Fraksi protein daun mimba (%)

Absorbansi pada λ 280 nm

Absorbansi pada λ 260 nm

Rasio serapan R 280/260

10 0.197 0.186 1.059 20 0.191 0.177 1.079 30 0.223 0.245 0.910 40 0.195 0.276 0.707 50 0.203 0.214 0.949 60 0.542 0.641 0.846

Faktor pengenceran = 100 kali

a. Konsentrasi FP30 = (1,55 x 0,223) - (0,76 x 0,245)

= 0,15945 mg/ml x 100

= 15,95 mg/ml.

b.Konsentrasi FP40 = (1,55 x 0,195) - (0,76 x 0,276)

= 0,09249 mg/ml x 100

= 9,25 mg/ml.

c. Konsentrasi FP50 = (1,55 x 0,203) - (0,76 x 0,214)

= 0,15201mg/ml x 100

= 15,20 mg/ml.

d. Konsentrasi FP60 = (1,55 x 0,542) - (0,76 x 0,641)

= 0,35294 mg/ml x 100

= 35,29 mg/ml.

68

Lampiran 3. Absorbansi sel dengan metode MTT

A. Sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel HeLa

Tabel VII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP30 terhadap kultur sel HeLa Absorbansi

Perlakuan Perlakuan tanpa sel Kadar Fraksi Protein (µg/ml) I II III IV V

Rata-rata I II III

Rata-rata Kontrol

0,2 0,776 0,743 0,782 0,773 0,729 0,761 0,558 0,603 0,741 0,634 0,729 0,4 0,755 0,745 0,731 0,728 0,69 0,73 0,568 0,598 0,675 0,614 0,773 0,8 0,822 0,774 0,731 0,711 0,705 0,749 0,552 0,616 0,699 0,622 0,782 1,6 0,776 0,775 0,796 0,746 0,755 0,797 0,512 0,645 0,997 0,718 0,743 3,1 0,772 0,797 0,766 0,764 0,731 0,766 0,637 0,67 0,915 0,741 0,825

6,25 0,755 0,83 0,743 0,76 0,73 0,764 0,569 0,697 0,772 0,679 12,5 0,743 0,82 0,903 0,731 0,72 0,783 0,639 0,538 0,77 0,649 25 0,75 0,826 0,886 0,723 0,707 0,778 0,952 0,594 0,725 0,757 50 0,805 0,796 0,907 0,702 0,693 0,781 1,146 0,711 0,62 0,826 100 0,747 0,71 0,686 0,733 0,694 0,714 1,183 0,647 0,586 0,805 200 0,657 0,684 0,978 1,813 0,667 0,96 0,957 1,689 0,558 1,068

Rata-rata 0,7704

Tabel VIII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP40 terhadap kultur sel HeLa Absorbansi

Perlakuan Perlakuan tanpa sel Kadar Fraksi Protein (µg/ml) I II III IV V

Rata-rata I II III

Rata-rata Kontrol

0,2 1,116 0,855 0,882 0,947 1,029 0,966 0,57 0,552 0,652 0,591 0,854 0,4 0,988 0,873 0,804 1,044 1,075 0,957 0,56 0,573 0,649 0,594 0,892 0,8 1,073 0,832 0,831 0,823 0,761 0,864 0,579 0,557 0,615 0,584 0,914 1,6 1,021 0,848 0,767 0,719 0,782 0,827 0,699 0,583 0,641 0,641 0,878 3,1 0,824 0,817 0,905 0,553 0,834 0,787 0,788 0,564 0,873 0,742 0,878

6,25 0,827 0,821 0,774 0,642 0,921 0,797 0,875 0,502 0,682 0,686 12,5 0,792 0,794 1,003 0,859 0,845 0,859 0,577 0,519 0,93 0,675 25 0,813 0,797 0,921 0,745 0,787 0,813 0,778 0,531 0,821 0,71 50 0,733 0,691 0,751 0,803 0,707 0,737 0,464 0,521 0,519 0,501 100 0,662 0,596 0,592 0,736 0,639 0,645 0,566 0,497 0,622 0,562 200 0,529 0,392 0,352 0,419 0,352 0,409 0,522 0,648 0,633 0,601

Rata-rata 0,8832

69

Tabel IX. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP50 terhadap kultur sel HeLa Absorbansi

Perlakuan Perlakuan tanpa sel Kadar Fraksi Protein (µg/ml) I II III IV V

Rata-rata I II III

Rata-rata Kontrol

0,2 0,743 0,738 0,756 0,704 0,713 0,731 0,573 0,567 0,608 0,583 0,775 0,4 0,698 0,719 0,71 0,721 0,709 0,711 0,542 0,55 0,644 0,579 0,791 0,8 0,643 0,729 0,724 0,727 0,712 0,707 0,532 0,552 0,574 0,553 0,773 1,6 0,891 0,691 0,704 0,714 0,75 0,75 0,487 0,576 0,576 0,546 0,795 3,1 0,889 0,792 0,707 0,735 0,592 0,743 0,455 0,612 0,461 0,509 0,847

6,25 0,824 0,66 0,661 0,674 0,56 0,676 0,474 0,437 0,48 0,464 12,5 0,645 0,584 0,622 0,712 0,561 0,625 0,634 0,451 0,517 0,534 25 0,64 0,507 0,558 0,716 0,573 0,599 0,609 0,484 0,886 0,66 50 0,457 0,447 0,439 0,809 0,61 0,552 0,544 0,526 0,906 0,659 100 0,267 0,246 0,372 0,354 0,305 0,309 0,492 0,667 0,892 0,684 200 0,23 0,237 0,262 0,372 0,22 0,264 0,53 0,611 0,737 0,626

Rata-rata 0,7962

Tabel X. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP60 terhadap kultur sel HeLa Absorbansi

Perlakuan Perlakuan tanpa sel Kadar Fraksi Protein (µg/ml) I II III IV V

Rata-rata I II III

Rata-rata Kontrol

0,2 0,758 0,743 0,724 0,704 0,737 0,733 0,588 0,617 0,647 0,617 0,766 0,4 0,731 0,752 0,893 0,73 0,722 0,766 0,555 0,583 0,663 0,6 0,775 0,8 0,73 0,741 0,786 0,7 0,711 0,734 0,525 0,554 0,611 0,563 0,732 1,6 0,812 0,712 0,709 0,677 0,698 0,722 0,485 0,519 0,54 0,515 0,794 3,1 0,737 0,72 0,699 0,779 1,085 0,804 0,446 0,471 0,468 0,462 0,769

6,25 0,673 0,681 0,802 0,668 0,67 0,699 0,455 0,461 0,496 0,471 12,5 0,613 0,592 0,825 0,596 0,607 0,647 0,474 0,475 0,486 0,478 25 0,536 0,448 0,436 0,526 0,432 0,476 0,476 0,498 0,514 0,496 50 0,433 0,469 0,439 0,468 0,44 0,45 0,485 0,524 0,546 0,518 100 0,272 0,228 0,229 0,286 0,254 0,254 0,505 0,526 0,542 0,524 200 0,228 0,221 0,214 0,223 0,211 0,219 0,539 0,541 0,565 0,548

Rata-rata 0,7672

70

B. Sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel Vero Tabel XI. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP30 terhadap kultur sel Vero

Absorbansi Perlakuan Perlakuan tanpa sel

Kadar Fraksi Protein (µg/ml) I II III IV V

Rata-rata I II III

Rata-rata Kontrol

0,2 1,02 0,88 0,811 1,098 0,732 0,91 0,589 0,586 0,593 0,59 1,02 0,4 0,886 0,796 0,857 1,167 0,798 0,9 0,596 0,648 0,612 0,62 0,88 0,8 1,097 0,957 0,838 0,772 0,794 0,89 0,558 0,593 0,644 0,6 0,811 1,6 1,153 0,821 0,851 0,833 0,766 0,88 0,56 0,641 0,613 0,6 1,098 3,1 1,034 0,798 0,818 0,927 0,796 0,87 0,598 0,604 0,79 0,66 0,732

6,25 0,824 0,814 0,807 0,746 0,782 0,8 0,557 0,68 0,658 0,63 12,5 0,776 0,83 0,784 0,793 0,912 0,82 0,566 0,603 0,639 0,6 25 0,749 0,739 0,802 0,773 0,766 0,77 0,699 0,586 0,617 0,63 50 0,753 0,785 0,837 0,793 0,779 0,79 0,578 0,811 0,723 0,704 100 0,783 0,708 0,835 0,724 0,752 0,76 0,577 0,593 0,563 0,57 200 0,847 0,751 0,72 0,7 0,707 0,75 0,601 0,793 0,555 0,65

Rata-rata 0,9082 Tabel XII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP40 terhadap kultur sel Vero

Absorbansi Perlakuan Perlakuan tanpa sel

Kadar Fraksi Protein (µg/ml) I II III IV V

Rata-rata I II III

Rata-rata Kontrol

0,2 0,799 0,788 0,768 0,766 0,788 0,782 0,489 0,831 0,598 0,639 0,843 0,4 0,813 0,762 0,759 0,815 0,77 0,784 0,552 0,56 0,728 0,613 0,834 0,8 0,815 0,783 0,856 0,753 0,767 0,795 0,679 0,561 0,769 0,669 0,866 1,6 0,822 0,753 0,721 0,757 0,742 0,759 0,524 0,568 0,578 0,557 0,833 3,1 0,796 0,741 0,764 0,755 0,744 0,76 0,548 0,582 0,567 0,566 0,811

6,25 0,762 0,79 1,027 0,764 0,73 0,815 0,541 0,554 0,597 0,564 12,5 0,791 0,78 1,091 0,768 0,713 0,829 0,522 0,549 0,581 0,551 25 0,759 0,727 0,905 0,599 0,695 0,737 0,552 0,562 0,575 0,563 50 0,696 0,671 0,818 0,691 0,693 0,7138 0,64 0,549 0,579 0,589 100 0,754 0,753 0,782 0,746 0,709 0,7488 0,515 0,553 0,561 0,543 200 0,804 0,763 0,737 0,758 0,781 0,7686 0,562 0,55 0,551 0,554

Rata-rata 0,8374

71

Tabel XIII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP50 terhadap kultur sel Vero

Absorbansi Perlakuan Perlakuan tanpa sel

Kadar Fraksi Protein (µg/ml) I II III IV V

Rata-rata I II III

Rata-rata Kontrol

0,2 0,859 0,849 0,824 1,132 0,828 0,898 0,57 0,505 0,486 0,52 1,058 0,4 0,81 0,89 0,871 1,177 0,847 0,919 0,502 0,572 0,48 0,518 0,911 0,8 1,114 0,834 0,87 1,134 0,786 0,948 0,529 0,486 0,491 0,502 0,901 1,6 0,956 0,851 0,832 0,707 0,822 0,834 0,54 0,481 0,593 0,538 0,849 3,1 1,02 0,833 0,81 0,866 0,796 0,865 0,544 0,665 0,649 0,619 0,881

6,25 0,878 0,794 0,803 0,886 0,792 0,831 0,594 0,5 0,71 0,601 12,5 0,779 0,764 0,757 0,724 0,744 0,754 0,548 0,515 0,518 0,527 25 0,747 0,771 0,787 0,726 0,736 0,753 0,486 0,519 0,507 0,504 50 0,788 0,746 0,736 0,763 0,743 0,755 0,504 0,518 0,51 0,511 100 0,742 0,751 0,767 0,772 0,847 0,776 0,522 0,55 0,526 0,533 200 0,845 0,766 0,75 0,744 0,79 0,779 0,497 0,496 0,498 0,497

Rata-rata 0,92 Tabel XIV. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP60 terhadap kultur sel Vero

Absorbansi Perlakuan Perlakuan tanpa sel

Kadar Fraksi Protein (µg/ml) I II III IV V

Rata-rata I II III

Rata-rata Kontrol

0,2 1,086 0,864 0,886 0,948 0,788 0,914 0,49 0,51 0,584 0,528 1,16 0,4 1,119 0,87 0,818 0,855 0,856 0,904 0,54 0,563 0,609 0,571 0,94 0,8 1,109 0,87 0,915 0,987 0,813 0,939 0,491 0,525 0,604 0,54 0,938 1,6 0,862 0,834 0,881 1,218 0,745 0,908 0,472 0,504 0,579 0,518 0,9 3,1 0,83 0,869 0,806 0,949 0,697 0,83 0,483 0,503 0,604 0,53 0,86

6,25 0,799 0,745 0,786 0,846 0,721 0,779 0,463 0,458 0,562 0,494 12,5 0,8 0,798 0,865 0,683 0,704 0,77 0,447 0,466 0,548 0,487 25 0,77 0,739 0,713 0,717 0,702 0,728 0,458 0,478 0,529 0,488 50 0,763 0,742 0,746 0,75 0,683 0,737 0,454 0,514 0,531 0,5 100 0,778 0,769 0,767 0,751 0,751 0,763 0,435 0,707 0,698 0,613 200 0,714 0,76 0,743 0,719 0,718 0,731 0,465 0,551 0,722 0,579

Rata-rata 0,9596 Persen kematian sel dihitung dengan

rumus :

% Kematian = 100% x A

C)(BA −−

Keterangan : A = Rata-rata absorbansi kontrol

B = Rata-rata absorbansi perlakuan

C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa

sel (Meyer, 1982)

72

Lampiran 4. Uji Kolmogorov-Smirnov

Test Kolmogorov-Smirnov Sel HeLa

NPar Tests Descriptive Statistics

N Mean Std. Deviation Minimum Maximum perlakuan30 11 93.3208 8.55547 84.60 110.46

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

perlakuan30 N 11

Mean 93.3208 Normal Parameters(a,b) Std. Deviation 8.55547

Absolute .181 Positive .181

Most Extreme Differences

Negative -.154 Kolmogorov-Smirnov Z .602 Asymp. Sig. (2-tailed) .862

a Test distribution is Normal. b Calculated from data.

Descriptive Statistics

N Mean Std. Deviation Minimum Maximum perlakuan40 11 81.7578 18.16701 57.60 121.76

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

perlakuan40 N 11

Mean 81.7578 Normal Parameters(a,b) Std. Deviation 18.16701

Absolute .144 Positive .144

Most Extreme Differences

Negative -.092 Kolmogorov-Smirnov Z .476 Asymp. Sig. (2-tailed) .977

a Test distribution is Normal. b Calculated from data.

73

Descriptive Statistics

N Mean Std. Deviation Minimum Maximum perlakuan50 11 96.8365 27.83120 70.65 147.08

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

perlakuan50 N 11

Mean 96.8365 Normal Parameters(a,b) Std. Deviation 27.83120

Absolute .253 Positive .253

Most Extreme Differences

Negative -.173 Kolmogorov-Smirnov Z .838 Asymp. Sig. (2-tailed) .483

a Test distribution is Normal. b Calculated from data.

Descriptive Statistics

N Mean Std. Deviation Minimum Maximum perlakuan60 11 89.8490 30.58366 36.61 142.87

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

perlakuan60 N 11

Mean 89.8490 Normal Parameters(a,b) Std. Deviation 30.58366

Absolute .201 Positive .201

Most Extreme Differences

Negative -.170 Kolmogorov-Smirnov Z .666 Asymp. Sig. (2-tailed) .768

a Test distribution is Normal. b Calculated from data.

74

Test Kolmogorov-Smirnov Sel Vero

NPar Tests Descriptive Statistics

11 77.3836 8.97542 64.90 90.60perlakuan30N Mean Std. Deviation Minimum Maximum

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

1177.38368.97542

.184

.184-.093.610.851

NMeanStd. Deviation

Normal Parametersa,b

AbsolutePositiveNegative

Most ExtremeDifferences

Kolmogorov-Smirnov ZAsymp. Sig. (2-tailed)

perlakuan30

Test distribution is Normal.a.

Calculated from data.b.

Descriptive Statistics

11 77.3909 5.81984 66.81 85.14perlakuan40N Mean Std. Deviation Minimum Maximum

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

1177.39095.81984

.122

.092-.122.406.997

NMeanStd. Deviation

Normal Parametersa,b

AbsolutePositiveNegative

Most ExtremeDifferences

Kolmogorov-Smirnov ZAsymp. Sig. (2-tailed)

perlakuan40

Test distribution is Normal.a.

Calculated from data.b.

75

Descriptive Statistics

11 67.9755 8.40184 51.56 75.37perlakuan50N Mean Std. Deviation Minimum Maximum

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

1167.97558.40184

.266

.189-.266.883.417

NMeanStd. Deviation

Normal Parametersa,b

AbsolutePositiveNegative

Most ExtremeDifferences

Kolmogorov-Smirnov ZAsymp. Sig. (2-tailed)

perlakuan50

Test distribution is Normal.a.

Calculated from data.b.

Descriptive Statistics

11 70.1173 9.15080 58.44 84.38perlakuan60N Mean Std. Deviation Minimum Maximum

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

1170.11739.15080

.145

.145-.120.479.976

NMeanStd. Deviation

Normal Parametersa,b

AbsolutePositiveNegative

Most ExtremeDifferences

Kolmogorov-Smirnov ZAsymp. Sig. (2-tailed)

perlakuan60

Test distribution is Normal.a.

Calculated from data.b.

76

Lampiran 5. Analisis Probit FP30 terhadap sel HeLa * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 9 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 2 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 14 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .09948 .06437 1.54553 Intercept Standard Error Intercept/S.E. 1.23647 .06516 18.97602 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 21.265 DF = 7 P = .003 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits.

77

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.71 100.0 85.5 87.817 -2.319 .87817 -.41 100.0 86.7 88.412 -1.715 .88412 -.11 100.0 85.5 88.986 -3.450 .88986 .19 100.0 94.1 89.540 4.550 .89540 .49 100.0 97.1 90.073 7.026 .90073 .80 100.0 90.3 90.585 -.238 .90585 1.10 100.0 84.6 91.078 -6.473 .91078 1.40 100.0 97.5 91.552 5.997 .91552 2.30 100.0 89.5 92.859 -3.375 .92859 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 1.53360E-036 . . .02 8.43223E-034 . . .03 4.61882E-032 . . .04 9.38432E-031 . .

78

.05 1.08707E-029 . . .06 8.74505E-029 . . .07 5.44144E-028 . . .08 2.79643E-027 . . .09 1.23916E-026 . . .10 4.87816E-026 . . .15 1.41985E-023 . . .20 1.28986E-021 . . .25 6.17430E-020 . . .30 1.99215E-018 . . .35 4.98181E-017 . . .40 1.05685E-015 . . .45 2.03022E-014 . . .50 3.72153E-013 . . .55 6.82181E-012 . . .60 1.31047E-010 . . .65 2.78007E-009 . . .70 .00000 . . .75 .00000 . . .80 .00011 . . .85 .00975 . . .90 2.83914 . . .91 11.17671 . . .92 49.52668 . . .93 254.52378 . . .94 1583.72643 . . .95 12740.49665 . . .96 147584.10760 . . .97 2998554.24722 . . .98 164248076.599 . . .99 90308944932.0 . . Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

79

210-1

Log of konsentrasi

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

Prob

it

Probit Transformed Responses

R Sq Linear = 0.092

FP40 terhadap sel HeLa * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 10 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 1 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C

80

* * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 10 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .33439 .05236 6.38605 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .57906 .05224 11.08494 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 47.202 DF = 8 P = .000 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.71 100.0 57.6 63.378 -5.777 .63378 -.41 100.0 58.9 67.095 -8.173 .67095 -.11 100.0 68.3 70.651 -2.391 .70651 .19 100.0 78.9 74.017 4.878 .74017

81

.49 100.0 94.9 77.172 17.740 .77172 .80 100.0 87.5 80.100 7.370 .80100 1.10 100.0 79.2 82.789 -3.539 .82789 1.40 100.0 88.4 85.234 3.149 .85234 1.70 100.0 73.3 87.435 -14.118 .87435 2.00 100.0 90.6 89.396 1.169 .89396 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 2.04853E-009 4.25516E-075 .00004 .02 .00000 1.81961E-068 .00012 .03 .00000 2.92961E-064 .00023 .04 .00000 4.27773E-061 .00037 .05 .00000 1.60340E-058 .00055 .06 .00000 2.48677E-056 .00077 .07 .00000 2.07129E-054 .00103 .08 .00000 1.08595E-052 .00134 .09 .00000 3.97737E-051 .00170 .10 .00000 1.09390E-049 .00212 .15 .00001 9.93913E-044 .00530 .20 .00006 5.38615E-039 .01101 .25 .00018 6.17972E-035 .02070 .30 .00050 2.72229E-031 .03664 .35 .00131 6.44961E-028 .06250 .40 .00324 1.02114E-024 .10436 .45 .00781 1.26235E-021 .17277 .50 .01855 1.37786E-018 .28706 .55 .04407 1.47667E-015 .48575 .60 .10616 1.71460E-012 .85615 .65 .26341 2.35942E-009 1.64477 .70 .68637 .00000 3.92201 .75 1.92928 .00578 21.15718 .80 6.09817 .66135 3988.48019 .85 23.32288 4.06749 73043884.1969 .90 126.12584 14.34524 4.70281E+013

82

.91 189.60554 18.64032 1.24113E+015 .92 295.24906 24.55781 4.38401E+016 .93 480.47844 32.99289 2.22570E+018 .94 827.69426 45.54924 1.80095E+020 .95 1539.05012 65.34581 2.72037E+022 .96 3189.64912 99.16792 9.94981E+024 .97 7813.17070 164.39945 1.41939E+028 .98 25706.75379 319.13864 2.23318E+032 .99 167977.01396 896.36092 9.31496E+038 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

2.01.51.00.50.0-0.5-1.0

Log of konsentrasi

1.5

1.0

0.5

0.0

Prob

it

Probit Transformed Responses

R Sq Linear = 0.378

83

FP50 terhadap sel HeLa * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 7 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 4 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 10 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr -.03496 .08974 -.38957 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .81024 .05636 14.37624 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 14.136 DF = 5 P = .015 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

84

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.71 100.0 81.4 79.815 1.580 .79815 -.41 100.0 83.3 79.518 3.812 .79518 -.11 100.0 80.6 79.217 1.399 .79217 .19 100.0 74.4 78.915 -4.494 .78915 .49 100.0 70.7 78.609 -7.957 .78609 .80 100.0 73.4 78.301 -4.945 .78301 1.10 100.0 88.6 77.991 10.605 .77991 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 5.24939E+089 . . .02 8.36725E+081 . . .03 9.44719E+076 . . .04 1.79332E+073 . . .05 1.68417E+070 . . .06 4.46376E+067 . . .07 2.45727E+065 . . .08 2.33113E+063 . . .09 3.37157E+061 . . .10 6.82893E+059 . . .15 6.65117E+052 . .

85

.20 1.77998E+047 . . .25 2.94933E+042 . . .30 1.50146E+038 . . .35 1.57839E+034 . . .40 2.64970E+030 . . .45 5.89962E+026 . . .50 1.50092E+023 . . .55 3.81850E+019 . . .60 8.50199E+015 . . .65 1427261826940 . . .70 150039109.136 . . .75 7638.25515 . . .80 .12656 . . .85 .00000 . . .90 3.29886E-014 . . .91 6.68168E-016 . . .92 9.66387E-018 . . .93 9.16778E-020 . . .94 5.04680E-022 . . .95 1.33762E-024 . . .96 1.25620E-027 . . .97 2.38459E-031 . . .98 2.69237E-036 . . .99 4.29150E-044 . . Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

86

1.00.50.0-0.5

Log of konsentrasi

1.2

1.0

0.8

0.6

Prob

it

Probit Transformed Responses

R Sq Linear = 5.407E-4

FP60 terhadap sel HeLa * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 7 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 4 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C

87

* * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 9 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr -.27797 .08533 -3.25743 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .62245 .05448 11.42605 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 61.599 DF = 5 P = .000 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.71 100.0 84.9 79.378 5.520 .79378 -.41 100.0 77.9 76.911 1.026 .76911 -.11 100.0 77.8 74.288 3.519 .74288 .19 100.0 73.0 71.518 1.510 .71518

88

.49 100.0 36.6 68.612 -32.003 .68612 .80 100.0 70.3 65.587 4.677 .65587 1.10 100.0 78.1 62.458 15.609 .62458 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 40595636029.6 . . .02 4244108359.22 . . .03 1012903960.42 . . .04 344744827.589 . . .05 143469144.108 . . .06 68028297.8902 . . .07 35362631.3260 . . .08 19684599.7201 . . .09 11554299.1960 . . .10 7075468.44234 . . .15 928808.69121 . . .20 184959.47901 . . .25 46324.41838 . . .30 13361.46164 . . .35 4221.86420 . . .40 1414.88556 . . .45 491.31873 . . .50 173.49552 . . .55 61.26511 . . .60 21.27430 . . .65 7.12972 . . .70 2.25280 . . .75 .64978 . . .80 .16274 . . .85 .03241 . . .90 .00425 . . .91 .00261 . . .92 .00153 . . .93 .00085 . . .94 .00044 . . .95 .00021 . . .96 .00009 . .

89

.97 .00003 . . .98 .00001 . . .99 .00000 . . Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

1.00.50.0-0.5

Log of konsentrasi

1.0

0.5

0.0

Prob

it

Probit Transformed Responses

R Sq Linear = 0.17

FP30 terhadap sel Vero * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information

90

ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 9 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .27697 .04568 6.06283 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .55594 .05211 10.66771 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 10.625 DF = 9 P = .302 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.70 100.0 64.9 64.145 .755 .64145

91

-.40 100.0 68.9 67.210 1.720 .67210 -.10 100.0 67.7 70.163 -2.453 .70163 .20 100.0 69.2 72.989 -3.829 .72989 .50 100.0 76.8 75.590 1.220 .75590 .80 100.0 82.1 78.123 3.937 .78123 1.10 100.0 76.2 80.504 -4.324 .80504 1.40 100.0 85.5 82.719 2.771 .82719 1.70 100.0 90.6 84.767 5.833 .84767 2.00 100.0 79.9 86.647 -6.767 .86647 2.30 100.0 89.5 88.361 1.139 .88361 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 3.92163E-011 1.97300E-016 .00000 .02 3.78172E-010 5.60144E-015 .00000 .03 1.59275E-009 4.67907E-014 .00000 .04 4.69789E-009 2.30970E-013 .00000 .05 .00000 8.46288E-013 .00000 .06 .00000 2.55558E-012 .00000 .07 .00000 6.73423E-012 .00000 .08 .00000 1.60334E-011 .00001 .09 .00000 3.52874E-011 .00001 .10 .00000 7.29369E-011 .00001 .15 .00000 1.47268E-009 .00007 .20 .00001 .00000 .00024 .25 .00004 .00000 .00068 .30 .00013 .00000 .00175 .35 .00040 .00000 .00423 .40 .00120 .00002 .00980 .45 .00346 .00010 .02214 .50 .00984 .00047 .04957

92

.55 .02796 .00213 .11166 .60 .08082 .00990 .25751 .65 .24210 .04742 .62325 .70 .76938 .23605 1.65633 .75 2.67944 1.18087 5.37332 .80 10.75164 5.36165 26.35487 .85 54.30596 22.80371 230.71644 .90 416.72638 118.10257 4220.91009 .91 681.72021 173.77474 8611.58508 .92 1163.64934 263.67917 18733.92956 .93 2094.86490 416.06143 44138.15446 .94 4039.46618 690.88470 115203.28439 .95 8541.99927 1229.26919 344833.84527 .96 20590.62111 2413.68652 1253102.51122 .97 60733.03943 5519.29672 6136822.31986 .98 255789.78850 16524.53122 50859647.3481 .99 2466644.68146 92655.19768 1431572810.38 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

Prob

it

Probit Transformed Responses

R Sq Linear = 0.772

93

FP40 terhadap sel Vero C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 10 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr -.06347 .04459 -1.42349 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .80392 .05603 14.34798 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 17.269 DF = 9 P = .045 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C

94

* * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.70 100.0 82.9 80.186 2.714 .80186 -.40 100.0 79.6 79.650 -.010 .79650 -.10 100.0 85.1 79.105 5.955 .79105 .20 100.0 75.8 78.552 -2.712 .78552 .50 100.0 76.8 78.008 -1.218 .78008 .80 100.0 70.1 77.440 -7.370 .77440 1.10 100.0 66.8 76.862 -10.052 .76862 1.40 100.0 79.2 76.275 2.945 .76275 1.70 100.0 85.1 75.681 9.459 .75681 2.00 100.0 75.4 75.079 .341 .75079 2.30 100.0 74.4 74.469 -.059 .74469 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 2.08614E+049 . . .02 1.05773E+045 . . .03 1.99229E+042 . .

95

.04 1.77593E+040 . . .05 3.81915E+038 . . .06 1.45445E+037 . . .07 8.28472E+035 . . .08 6.36865E+034 . . .09 6.17589E+033 . . .10 7.20960E+032 . . .15 9.90645E+028 . . .20 8.44361E+025 . . .25 1.96456E+023 . . .30 8.48230E+020 . . .35 5.46033E+018 . . .40 4.54877E+016 . . .45 4.42714E+014 . . .50 4637127710447 . . .55 48570703186.2 . . .60 472719876.536 . . .65 3938033.01952 . . .70 25350.38266 . . .75 109.45431 . . .80 .25467 . . .85 .00022 . . .90 .00000 . . .91 3.48176E-009 . . .92 3.37637E-010 . . .93 2.59549E-011 . . .94 1.47843E-012 . . .95 5.63029E-014 . . .96 1.21080E-015 . . .97 1.07931E-017 . . .98 2.03294E-020 . . .99 1.03075E-024 . . Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

96

210-1

Log of konsentrasi

1.1

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

Prob

it

Probit Transformed Responses

R Sq Linear = 0.104

FP50 terhadap sel Vero C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * *

97

Parameter estimates converged after 7 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .16752 .04163 4.02397 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .33869 .05039 6.72150 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 15.371 DF = 9 P = .081 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.70 100.0 58.9 58.769 .141 .58769 -.40 100.0 56.4 60.720 -4.310 .60720 -.10 100.0 51.6 62.645 -11.085 .62645 .20 100.0 67.9 64.538 3.332 .64538 .50 100.0 73.3 66.338 6.962 .66338 .80 100.0 75.1 68.154 6.926 .68154

98

1.10 100.0 75.4 69.932 5.438 .69932 1.40 100.0 72.9 71.663 1.227 .71663 1.70 100.0 73.4 73.346 .074 .73346 2.00 100.0 73.6 74.976 -1.406 .74976 2.30 100.0 69.4 76.551 -7.201 .76551 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 1.23262E-016 1.80646E-032 3.63798E-011 .02 5.22554E-015 2.67938E-029 4.53498E-010 .03 5.63120E-014 2.75354E-027 2.24876E-009 .04 3.36735E-013 8.97890E-026 7.50154E-009 .05 1.44232E-012 1.52798E-024 .00000 .06 4.97511E-012 1.70504E-023 .00000 .07 1.47331E-011 1.41329E-022 .00000 .08 3.89458E-011 9.38821E-022 .00000 .09 9.42763E-011 5.25327E-021 .00000 .10 2.12727E-010 2.56318E-020 .00000 .15 6.18122E-009 1.81198E-017 .00001 .20 .00000 3.32536E-015 .00003 .25 .00000 2.90335E-013 .00016 .30 .00001 1.60276E-011 .00066 .35 .00005 6.56994E-010 .00241 .40 .00029 .00000 .00832 .45 .00169 .00000 .02776 .50 .00951 .00002 .09200 .55 .05349 .00050 .31267 .60 .30940 .01365 1.15315 .65 1.89820 .33261 5.50546 .70 12.84078 4.39746 62.59099 .75 101.05568 27.20661 2261.24090 .80 1005.22880 148.06088 171651.16585 .85 14628.87767 962.72766 29575205.5113 .90 425072.23203 9686.46499 20185388869.3 .91 959140.81753 16857.98139 97970063595.4 .92 2321799.99259 30747.55960 545529464312

99

.93 6137479.94205 59482.86866 3607367940810 .94 18175340.9229 124179.71896 2.97732E+013 .95 62693457.1128 287212.41096 3.30881E+014 .96 268532652.387 768394.74203 5.60866E+015 .97 1605772473.57 2573234.20439 1.82181E+017 .98 17304295981.5 12810892.7521 1.86478E+019 .99 733591561818 160413775.785 2.75351E+022 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

Prob

it

Probit Transformed Responses

R Sq Linear = 0.503

FP60 terhadap sel Vero * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done.

100

MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 8 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .25367 .04311 5.88447 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .34056 .05046 6.74925 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 6.250 DF = 9 P = .715 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob

101

-.70 100.0 59.7 56.484 3.246 .56484 -.40 100.0 65.3 59.468 5.832 .59468 -.10 100.0 58.4 62.399 -3.959 .62399 .20 100.0 59.4 65.259 -5.859 .65259 .50 100.0 68.7 67.949 .771 .67949 .80 100.0 70.3 70.624 -.324 .70624 1.10 100.0 70.5 73.198 -2.688 .73198 1.40 100.0 75.0 75.652 -.652 .75652 1.70 100.0 75.3 77.980 -2.690 .77980 2.00 100.0 84.4 80.175 4.205 .80175 2.30 100.0 84.2 82.232 1.988 .82232 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 3.06605E-011 7.41437E-017 .00000 .02 3.64094E-010 3.02031E-015 .00000 .03 1.74999E-009 3.17228E-014 .00000 .04 5.70089E-009 1.86024E-013 .00000 .05 .00000 7.84081E-013 .00000 .06 .00000 2.66744E-012 .00000 .07 .00000 7.80310E-012 .00001 .08 .00000 2.03996E-011 .00001 .09 .00000 4.88814E-011 .00002 .10 .00000 1.09258E-010 .00003 .15 .00000 3.04916E-009 .00013 .20 .00002 .00000 .00051 .25 .00010 .00000 .00160 .30 .00039 .00000 .00450 .35 .00138 .00002 .01175 .40 .00456 .00012 .02930

102

.45 .01452 .00069 .07132 .50 .04544 .00368 .17268 .55 .14218 .01950 .42454 .60 .45311 .10275 1.09265 .65 1.50130 .53145 3.12736 .70 5.30575 2.49625 11.39587 .75 20.72173 9.80461 62.17696 .80 94.46887 35.90511 515.30361 .85 553.69890 146.62801 6739.70086 .90 5123.58614 816.47649 180583.09555 .91 8769.29884 1231.14008 401183.44014 .92 15722.16333 1921.32720 955922.28972 .93 29874.54469 3130.95929 2486008.85950 .94 61187.81178 5396.03413 7236700.51730 .95 138604.32308 10028.06056 24504642.0381 .96 362232.57252 20745.42037 102822706.816 .97 1180035.43740 50637.34589 600293013.990 .98 5671739.50539 165549.61437 6276429299.64 .99 67352065.3767 1068139.21680 254379424682 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

Prob

it

Probit Transformed Responses

R Sq Linear = 0.857

103

Lampiran 6. Uji t-independent

T-Test

Group Statistics

5 .0692 .11403 .050995 2E+085 3.8284E+085 2E+085

selvero30hela30

LC50N Mean Std. Deviation

Std. ErrorMean

Independent Samples Test

7.111 .029 -1.000 8 .347 1.71E+085 1.71E+085 -6E+085 2E+085

-1.000 4.000 .374 1.71E+085 1.71E+085 -6E+085 3E+085

Equal variancesassumedEqual variancesnot assumed

LC50F Sig.

Levene's Test forEquality of Variances

t df Sig. (2-tailed)Mean

DifferenceStd. ErrorDifference Lower Upper

95% ConfidenceInterval of the

Difference

t-test for Equality of Means

Group Statistics

5 5E+040 1.0144E+041 5E+0405 .0791 .13658 .06108

selvero40hela40

LC50N Mean Std. Deviation

Std. ErrorMean

Independent Samples Test

7.111 .029 1.000 8 .347 4.54E+040 4.54E+040 -6E+040 1E+041

1.000 4.000 .374 4.54E+040 4.54E+040 -8E+040 2E+041

Equal variancesassumedEqual variancesnot assumed

LC50F Sig.

Levene's Test forEquality of Variances

t df Sig. (2-tailed)Mean

DifferenceStd. ErrorDifference Lower Upper

95% ConfidenceInterval of the

Difference

t-test for Equality of Means

Group Statistics

5 .1858 .39625 .177215 35.6808 79.78431 35.68063

selvero50hela50

LC50N Mean Std. Deviation

Std. ErrorMean

104

Independent Samples Test

7.041 .029 -.995 8 .349 -35.49495 35.68107 -117.776 46.78574

-.995 4.000 .376 -35.49495 35.68107 -134.560 63.56965

Equal variancesassumedEqual variancesnot assumed

LC50F Sig.

Levene's Test forEquality of Variances

t df Sig. (2-tailed)Mean

DifferenceStd. ErrorDifference Lower Upper

95% ConfidenceInterval of the

Difference

t-test for Equality of Means

Group Statistics

5 .1346 .29182 .130505 2E+008 347338936.2 2E+008

selvero60hela60

LC50N Mean Std. Deviation

Std. ErrorMean

Independent Samples Test

7.111 .029 -1.000 8 .347 1.55E+008 2E+008 -5E+008 2E+008

-1.000 4.000 .374 1.55E+008 2E+008 -6E+008 3E+008

Equal variancesassumedEqual variancesnot assumed

LC50F Sig.

Levene's Test forEquality of Variances

t df Sig. (2-tailed)Mean

DifferenceStd. ErrorDifference Lower Upper

95% ConfidenceInterval of the

Difference

t-test for Equality of Means

105

Lampiran 7. Perhitungan nilai korelasi kadar fraksi protein dengan persen kematian sel HeLa dan sel Vero pada taraf kepercayaan 80%

Nilai korelasi (r) dihitung linieritasnya menggunakan nilai t yang dapat diperoleh

dengan rumus:

t = 21

)2(

r

nr

−

−

(De Muth, 1999)

• Nilai korelasi FP pada sel HeLa

* FP30 → r2= 0,092 r = 0,303

t = 841,0092,01

29303,0=

−− [ t(80% , 7) = 1,415]

----- t hitung < t tabel, sehingga korelasinya tidak linier -----

* FP40 → r2= 0,378 r = 0,615

t = 339,2378,01

211615,0=

−− [ t(80% , 9) =1,383 ]

----- t hitung > t tabel, sehingga korelasinya linier -----

* FP50 → r2= 5,407.104 r = 0,023

t = 056,010.407,5128023,0

4=

−

− [ t(80% , 6) = 1,440]

----- t hitung < t tabel, sehingga korelasinya tidak linier -----

* FP60 → r2= 0,17 r = 0,412

t = 011,117,01

27412,0=

−− [ t(80% , 5) = 1,467]

----- t hitung < t tabel, sehingga korelasinya tidak linier -----

106

• Nilai korelasi FP pada sel Vero

* FP30 → r2= 0,772 r = 0,879

t = 522,5772,01

211879,0=

−− [ t(80% , 9) = 1,383]

----- t hitung > t tabel, sehingga korelasinya linier -----

* FP40 → r2= 0,104 r =0,322

t = 020,1104,01

211322,0=

−− [ t(80% , 9) = 1,383]

----- t hitung < t tabel, sehingga korelasinya tidak linier -----

* FP50 → r2= 0,503 r = 0,709

t = 017,3503,01

211709,0=

−− [ t(80% ,9) = 1,383]

----- t hitung > t tabel, sehingga korelasinya linier -----

* FP60 → r2= 0,857 r = 0,925

t = 338,7857,01

211925,0=

−− [ t(80% , 9) = 1,383]

----- t hitung > t tabel, sehingga korelasinya linier -----

107

Lampiran 8. Foto tanaman Azadirachta indica A. Juss

Lampiran 9. Foto daun Azadirachta indica A. Juss

108

Lampiran 10. Foto Hi-Mac Sentrifuge HITACHI SCP85H

Lampiran 11. Foto Laminar Air Flow Labconco Seri 226356

109

Lampiran 12. Foto Spektrofotometer UV CECIL Series CE 292

Lampiran 13. Foto ELISA reader SLT 340ATC

110