LAPORAN AKHIR PERCOBAAN I PEWARNAAN GRAM

NAMA: ELLENA MAGGYVINNPM: 260110140137HARI/TANGGAL PRAKTIKUM: KAMIS, 1 OKTOBER 2015ASISTEN:1. SAIFUL ISLAM ROBBANI 2. MYRA VANIA

LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS PADJADJARANJATINANGOR2015

I. TUJUAN1. Mengamati dua kelompok bakteri yaitu bakteri gram positif dan gram negatif dengan menggunakan prosedur pewarnaan gram.2. Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.

II. PRINSIP1. Teknik Pewarnaan DiferensialProsedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba (Pelczar dan Chan, 2007).2. Pewarnaan GramPewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakkan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar gram positif dan gram negatif berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri (Karman, 2008).3. Zat WarnaZat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah satu diantaranya bewarna (Volk & Wheeler, 1993).III. TEORI DASARPewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella Pneumonia (Karmana, 2008).Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negatif, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet.Contoh dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens, Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram negatif misalnya adalah Eschericia Coli.Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan gram, misalnya Mycobacterium sp, karena dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaan tersebut sel bakteri akan berwarna merah tetapi sel jaringan akan berwarna hijau (James, 2002).Banyak spesies bakteri gram negatif yang bersifat patogen, yang berarti berbahaya bagi organisme inang.Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram negatif, terutama lapisan lipopoli sakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin) (Edwin, 2011).Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural.Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantar sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial.Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul (Waluyo, 2010).Karakterisasi merupakan salah satu kegiatan yang dilakukan untuk menobservasi bakteri maupun kapang hasil isolasi (isolat).Kegiatan karakterisasi dapat dilakukan berdasarkan sifat sitologi (bentuk sel, gerak atau motilitas, sifat Gram dan endospora), sifat morfologi, dan sifat fisiologi.Uji sifat morfologi mencakup sifat-sifat koloni, seperti ukuran, bentuk, warna dan tepian, sedangkan uji sifat fisiologi diantaranya uji hidrolisis pati, hidrolisis lemak, hidrolisis protein dan uji katalase (Subandi, 2009).

IV. Alat dan Bahan Alat :1. Bak pewarna2. Cawan petri3. Kaca obyek4. Kapas5. Kertas saring6. Korek api7. Mikroskop majemuk8. Ose9. Pembakar spiritus Bahan :1. Air suling2. Alkohol 70%3. Alkohol 96%4. Desinfektan5. Fuchsin6. Karbol gentian violet (CGV)7. Lugol8. Suspensi campuran bakteri E. coli dan S. aureus. Gambar :1. Air suling

2. Alkohol 70%

3. Alkohol 96%

4. Bak warna

5. Cawan petri

6. Fuchsin

7. Kaca objek

8. Kapas

9. Karbol gentian violet

10. Kertas saring

11. Korek api

12. Mikroskop majemuk

13. Ose

14. Pembakar spiritus

V. ProsedurDibersihkan kaca objek dengan menggunakan alkohol 70% dan dikeringkan kembali menggunakan kapas, lalu dibuat olesan bakteri pada kaca objek.Kemudian diletakkan kaca objek di atas rak kawat di atas bak pewarna.Olesan bakteri di kaca objek digenangin dengan pewarna karbol gentian violet selama 1 menit, lalu zat warna yang berlebih dibuang, lalu bilas secara perlahan dengan air suling. Digenangi kembali olesan dengan lugol selama 2 menit , lugol yang berlebih dibuang lalu dibilas dengan air suling.Olesan bakteri dicuci dengan alkohol 95% tetes demi tetes selama 30 detik atau sampai warna larut , lalu dibilas kembali dengan air suling. Setelah itu olesan digenangi dengan pewarna air fuchsin selama 30 detik, warna yang berlebih dibilas dengan air suling lalu keringkan dengan kertas saring. Kaca objek diteteskan sedikit minyak emersi pada preparat, lalu diperiksa di bawah mikroskop.VI. DATA PENGAMATANNoPerlakuanHasilGambar

1.Mengoleskan suspensi bakteri pada kaca objek kemudian dipanaskanOlesan bakteri sudah kering dan menempel pada objek glass-

2.Genangi olesan bakteri dengan CGV selama 1 menit dan bilas dengan aquadestOlesan bakteri terendam CGV dan CGV terbilas-

3.Genangi olesan bakteri dengan lugol selama 2 menit dan bilas dengan aquadestOlesan bakteri terendam lugol dan lugol terbilas-

4.Olesan dicuci dengan alkohol 95% selama 30 detik dan bilas dengan aquadestOlesan bakteri mengalami perbesaran / pengecilan pori-pori dinding sel-

5.Olesan digenangi dengan air fuksin selama 30 detik dan bilas dengan aquadestOlesan bakteri terendam air fuksin dan air fuksin terbilas-

6.Olesan ditetesi minyak emersi dan diamati dibawah mikroskop (I)Teramati bakteri gram positif S. Aureus

7.Olesan ditetesi minyak emersi dan diamati dibawah mikroskop (II)Teramati bakteri gram negatif E.coli

VII. PembahasanPada percobaan ini, dilakukan uji pewarnaan terhadap bakteri gram positif dan gram negative, dimana percobaan ini bertujuan untuk mengklasifikasikan jenis bakteri ke dalam 2 kelompok besar tersebut. Pengklasifikasian didasarkan dengan prinsip pewarnaan gram, dimana pewarnaan gram adalah pewarnaan diferensial yang digunakan sebagai langkah awal identifikasi bakteri. Pewarnaan didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan dalam membrane sel bakteri.Pada bakteri gram positif, dinding sel yang dimiliki oleh bakteri-bakteri gram positif umumnya memili dinding sel relative tebal, terdiri dari berlapis-lapis polymer peptidoglycan (disebut juga murein). Tebalnya dinding sel menahan lolosnya komplek Carbol Gentian Violet ketika dicuci dengan alcohol atau aseton, sehingga didapatkan hasil kompleks warna ungu bila positif merupakan bakteri gram positif. Sedangkan, untuk bakteri gram negative, memiliki dinding sel berupa lapisan tipis peptidoglikan, yang diselubungi oleh lapisan tipis outer membrane yang terdiri dari lipopolysaccharide (LPS). Daerah antara peptidoglykan dan lapisan LPS disebut periplasmik space adalah zona berisi cairan atau gel yang mengandung berbagai enzim dan protein pembawa protein. Maka, kompleks carbol gentian violet mudah lolos melalui LPS dan lapisan tipis peptidoglikan ketika sel diperlakukan dengan pelarut. Ketika sel diberi perlakuan warna sekunder air fuschin, maka pewarna tersebut akan diserap oleh dinding sel bakteri gram negative.Prosedur dalam pewarnaan bakteri adalah pertama-tama diambil bakteri dari suspense bakteri dengan menggunakan oase dalam keadaan aseptis, dimana aseptis berarti teknik kerja yang terjaga dari kontaminan di udara dalam proses pengerjaan dengan melakukan percobaan selalu didekat api yang menyala. Oase pertama-tama juga harus difiksasi dengan cara dibakar ke api hingga berubah warna merah. Kemudian didiamkan sambil dianginkan hingga dingin, karena bila oase dimasukkan dalam keadaan panas dalam suspense bakteri, akan menyebabkan kematian pada bakteri. Maka dari itu, oase harus dalam keadaan dingin sebelum dicelupkan dalam suspense bakteri dan diambil. Setelah itu diambil kaca yang telah steril dan bersih juga sudah diberi lingkaran untuk membatasi daerah bakteri. Oleskan suspense bakteri dengan oase pada permukaan kaca objek setelah itu difiksasi dekat api, untuk mempejelas struktur daripada sel bakteri yang akan diperiksa.Kemudian plat yang telah dioles dengan bakteri, diteteskan dengan karbol gentian violet dan didiamkan selama 1 menit. Fungsi dari karbol gentian violet adalah sebagai zat pewarna primer. Dalam waktu 1 menit, diasumsikan bahwa pewarna karbol gentian telah masuk dan tidak terlewatkan di dalam dinding sel bakteri, Karena bila bakteri yg diuji positif merupakan gram positif, zat pewarna akan melekat pada dinding sel bakteri. Setelah itu dibilas terlebih dahulu dengan aquadest agar warna primer hilang bertujuan untuk memperjelas pengamatan. Kemudian ditambahkan dengan larutan lugol, yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat, dan mempersulit pelarutan zat warna, kemudian dibiarkan selama 2 menit. Kemudian dibilas lagi dengan aquadest untuk menghilangkan lugol dari kaca objek. Kemudian diteteskan dengan alcohol 95% pada kaca objek yang telah dibilas, fungsinya adalah untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel, juga untuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negated yang akan menyebabkan membesarnya pori-pori sel sehingga meningkatkan daya larut zar pewaena, dilakukan selama 30 detik dan dapat langsung dibilas dengan aquades dan dilanjutkan dengan pemberian pewarnaan sekunder, dimana adalah air fuschin digunakan sebagai pewarna sekunder,kemudian didiamkan selama 30 detik sebelum dibilas dengan air suling. Penambahan minyak dalam pengamatan preparat di mikroskop untuk dilihat bentuk daripada sel bakteri yang diberikan. Kemudian didapatkan hasil berupa koloni bakteri S. aureus yang berwarna biru keunguan dalam koloninya. Maka dapat disimpulkan bakteri S. aureus merupakan bakteri gram positif yang berbentuk coccus atau bulatan. Hasil kedua didapatkan bakteri berbentuk panjang (basil) dengan warna pink atau kemerahmudaaan menunjukkan hasil positif bakteri gram negatif karena mengikat kompleks warna tandingan yaitu warna dari air fuschin. Bakteri gram negative yang didapatkan berwarna merah dengan bentuk basil setelah ditelaah lebih lanjut merupakan bakteri E. Coli. Maka dapat disimpulkan pula bahwa bakteri E.Coli merupakan bakteri gram negative.VIII. KESIMPULAN1. Bakteri gram positif berwarna ungu sedangkan bakteri gram negatif berwarna merah yang disebabkan luluhnya dinding peptidoglikan.2. Prosedur yang digunakan dalam proses pewarnaan bakteri memiliki ketentuan masing-masing berdasarkan sifat kimia zat warna yang digunakan.

IX. Daftar PustakaEdwin. 2011. Materi Kuliah Mikrobiologi. Banjarbaru : UNLAMJames, Joyce. 2002. Prinsip Prinsip Sains Untuk Keperawatan. Jakarta : ErlanggaKarman, O. 2008. Biologi untuk Kelas X Sekolah Menengah Atas. Bandung: Grafindo Meda PratamaKarmana, Oman. 2008. Biologi. Jakarta : PT Grafindo Media PratamaPelczar, M. J. dan Chan, E. C. S. 2007. Elements of Microbiology. New York: Mc Graw Hill Book.Subandi .2009 .Dasar Dasar Mikrobiologi .Bandung : Gunung Djati PressVolk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Erlangga.Waluyo, Lud. 2010. Buku Petunjuk Mikrobiologi Umum. Malang : UMM