Penetapan kadar/potensi

antibiotik dengan cara

mikrobiologi

Slamet Ibrahim

Marlia Singgih

School of Pharmacy ITB

Pendahuluan

• Antibiotik : sintetik, semi-sintetik

• Kasus retensi mikroba patogen

menaikkan dosis nya atau mengganti

dengan antibiotik baru

• banyak penemuan2 antibiotik baru,

sehingga perlu ditetapkan potensi nya

Acuan

• Farmakope Indonesia

• CLSI

• USP (United States

Pharmacopoeia),

• EP (European Pharmacopoeia),

• BP (British Pharmacopoeia),

• JP (Japanese Pharmacopoeia),

• AOAC (American Association of

Analytical Chemists),

• US-CFR (Code of Federal Registry)

and a custom single plate method.

Skrining antimikroba dari mikroorganisme di alam

Pengertian kadar vs potensi

• Kadar jumlah per satuan berat/volume

• Potensi ukuran kekuatan /daya hambat

atau daya bunuh zat aktif terhadap

mikroorganisme tertentu

Mengapa harus dengan cara

mikrobiologi?

• Respons mikroba terhadap antibiotik

berbeda-beda

• Spesifik

• Sensitif

Metode penetapan potensi suatu

senyawa

• Antibiotik

• Hormon

• Vitamin

Penetapan Potensi Antibiotik

Secara Mikrobiologi

• Dilakukan untuk senyawa antibiotik baru

atau untuk tujuan konfirmasi

• Tidak semua antibiotik ditentukan

potensinya secara mikrobiologi

• Penetapan dilakukan terhadap Bahan

baku dan sediaan

Estimasi dari potensi antibiotik melalui

perbandingan langsung antara sampel

(antibiotik uji) dengan antibiotik standar yang

telah disahkan penggunaannya, terkalibrasi

dengan baik, dan umum digunakan sebagai

rujukan.

Prinsip uji potensi antibiotik berdasarkan

Farmakope Indonesia edisi IV 1995

Metode Umum

1. Lempeng (silinder /

kertas cakram)

2. Turbidimetri (tabung)

Metode Lempeng Silinder

Difusi antibiotik dari silinder yang dipasang

tegak lurus pada lapisan agar padat dalam

cawan petri atau lempeng yang berisi biakan

mikroba uji pada jumlah tertentu

Mikroba dihambat pertumbuhannya

Desain pengujian 5+1

• Larutan baku pembanding yang dibuat

pengenceran S1, S2, S3, S4 dan S5

dengan tingkat perbandingan 1,25.

• Dosis tengah ditetapkan dulu, misalnya 10

IU/mL, maka: S2=8,0 IU/mL, S1=6,4

IU/mL, S4=12,5 IU/mL dan S5=15,6 IU/mL

Dosis baku

Dosis sampel

• Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam

selinder atau serapkan pada kertas cakram

sebanyak 100 μL di atas media agar yang telah

diinokulasikan mikroba uji.

• Pre-inkubasi selama 1 jam, lalu inkubasi pada

35-37 ºC selama 18-24 jam.

• Setelah masa inkubasi, daerah hambat yang

terbentuk diukur garis tengahnya.

Pola letak uji pada desain (5+1)

Dosis S3

Dosis lainnya S3

S1 S3 S3

S3 S3

S2 S4

S5 U

Desain pengujian (5+1)

• Sebelum menghitung potensi , dilakukan

terlebih dahulu koreksi garis tengah rata-

rata diameter daerah hambat dosis larutan

baku S1, S2, S4 dan S5

• Cara :

• Hitung diameter rata-rata S3 di semua

cawan (Y3T)

• Hitung diameter rata-rata S3 pada masing-

masing cawan larutan baku S1,2,4 dan 5

(Y31, Y32, Y34 dan Y35)

• Hitung diameter S1,2,4 dan 5 (Y1, Y2, Y4

dan Y5)

Maka diameter koreksi masing-masing

larutan baku adalah :

• S1 (a) = Y1 + (Y3T – Y31)

• S2 (b) = Y2 + (Y3T – Y32)

• S3 (c) = Y3T

• S4 (d) = Y4 + (Y3T – Y34)

• S5 (e) = Y5 + (Y3T – Y35)

Untuk kurva baku, dihitung diameter dosis

terendah dan tertinggi yaitu :

YT = (3e + 2d + c – a )

5

YR = (3a + 2b + c – e )

5

YR = diameter hambat

dosis terendah

YT = diameter hambat

dosis tertinggi

• Selanjutnya dibuat kurva baku pada kertas

semilog :

• Sumbu X : log dosis

• Sumbu Y : diameter hambat

• Hubungkan titik-titik untuk S1 (YR) sampai

S5 (YT)

Sebelum Perhitungan potensi sediaan uji,

dilakukan koreksi diameter larutan sampel U:

YU koreksi = YS + (YU – Y3U)

Y3U = diameter rata-rata S3 pada pengujian

larutan U

YU = diameter rata-rata U pada cawan larutan

U

YS = Hasil interpolasi S3 pada kurva baku

Cara Perhitungan potensi sampel

Perhitungan Potensi sampel

• Potensi sediaan uji ditentukan dengan

menginterpolasi YU pada sumbu Y ke garis

kurva baku dan tarik garis ke sumbu X

(diperoleh XU)

• Dosis U = XU/S3 x dosis S3

• Potensi U = dosis U x faktor pengenceran

Linearity (Kelinieran) (lanjutan)

Perhitungan Kadar

Diameter

Hambat

Log Ci

x

x

x

x

x

a. Menggunakan persamaan garis

D = b log C + a

log Cs = Ds – a/ b

dimana :

Cs = kons. analit dlm sampel

Ds = Diameter hambat

b. Menggunakan satu larutan baku dan

larutan blangko

log Cs = (Ds – a)/(Db – a) . log Cb

dimana :

Cb = kons. analit dlm lar.baku

Membandingkan hasil pengukuran

diameter hambat

Limit value m

m

20

15

10

5

11 14 11 14

DIFFERENT SAME

Interpretasi hasil

Pengukuran diameter hambat

Contoh hasil uji potensi antibiotik

Contoh BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1.

Published online 2009 January 16. doi: 10.1186/1472-6904-9-1.

PMCID: PMC2640365

Copyright © 2009 Zuluaga et al; licensee BioMed Central Ltd.

Application of microbiological assay to determine pharmaceutical equivalence of generic intravenous antibiotics

Andres F Zuluaga,1,2 Maria Agudelo,1 Carlos A Rodriguez,1,2 and Omar Vesga1,3

1GRIPE: Grupo Investigador de Problemas en Enfermedades Infecciosas, University of Antioquia, Medellín, Colombia 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Antioquia, Medellin, Colombia 3Section of Infectious Diseases, Department of Internal Medicine, University of Antioquia, Medellin, Colombia

Corresponding author.

Andres F Zuluaga: andreszuluaga@une.net.co ; Maria Agudelo: mariaag10@yahoo.com ; Carlos A Rodriguez: andreios@yahoo.com ; Omar Vesga: omar.vesga@siu.udea.edu.co

Received June 14, 2008; Accepted January 16, 2009.

Metode

• Pengujian dilakukan berdasarkan variasi konsentrasi

terhadap efek inhibisi pada bakteri uji : Bacillus subtilis

ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538p dan

Staphylococcs epidermidis ATCC 12228, yang

ditumbuhkan pada media agar (Difco™ Antibiotic

Media), menghasilkan hubungan linear antara

konsentrasi zat -respons e linear dengan dua parameter

: y-intercept (concentration) and slope (potency).

• Dibandingkan dua parameter tersebut dari 22 product

generik (amikacin 4, gentamicin 15, and vancomycin 3

produk) dengan sediaan pembanding by Overall Test for

Coincidence of the Regression Lines (Graphpad Prism

5.0).

Pengolahan data dalam proses

validasi

• Ditentukan linearity, limit of quantification, precision, accuracy, dan specificity utk menvalidasi method for testing pharmaceutical equivalence.

• Untuk tujuan tersebut, log-transformed concentrations (x-axis, log10 mg/L) dari setiap produk diplot terhadap masing-masing diameter hambat nya (y-axis, rata-rata diameter dalam mm); intercept (perpotongan dan kemiringan/slope garis regresi linear yang diekspresikan dengan persamaan y = b + mx, dengan b sebagai nilai y-intercept dan m sebagai nilai kemiringan nya

• 5 Konsentrasi yang digunakan untuk masing-

masing antibiotik : 0.5 – 256 mg/L (amikacin),

0.125 – 64 mg/L (gentamicin), dan 0.25 – 128

mg/L (vancomycin)

• The goodness of fit to the model (linearity) :

dinyatakan dalam coefficient of determination

(r2) dan standard error of estimate (Syx).

• Dihitung pula x-intercept (log10 mg/L) dan

kemiringan garis regresi dengan kepercayaan

95% confidence intervals (95% CI)

Results

• Validasi metode menghasilkan linearitas (r2 ≥ 0.98),

precision (intra-assay variation ≤ 11%; inter-assay

variation ≤ 10%), accuracy, and specificity tests , sesuai

dengan syarat international pharmacopoeial .

• Kecuali pada vancomycin yang ditambahkan 25% API

(Py-intercept = 0.001), penentuan potensi antibiotik

menunjukkan hasil yang ekuivalen. 21 sediaan generik

memberikan undistinguishable slopes dan intercepts

(P > 0.66).

• Estimasi potensi antibiotik: amikacin 99.8 - 100.5 ,

gentamisin 99.7 - 100.2, dan vancomycin 98.5 - 99.9%

Vancomycin

concentration (mg/L)

Inhibition zone

diameters (mean in

mm ± SD)

Coefficient of variation

(%) Intra-day

Coefficient of variation

(%) Inter-day

128 18.00 ± 0.04 8.3 10.3

64 16.33 ± 0.02 5.6 10.5

32 14.16 ± 0.11 11.0 1.0

16 11.62 ± 0.37 7.4* 2.3

8 9.59 ± 0.00 4.6 6.5

Precision of the vancomycin bioassay

*An outlier value was excluded from the calculations (we only used five data to compute the CV) BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1.

Published online 2009 January 16. doi: 10.1186/1472-6904-9-1.

Copyright © 2009 Zuluaga et al; licensee BioMed Central Ltd.

Kurva baku masing2 antibiotik

Penetapan nilai potensi antibiotik