Prosedur selanjutnya yaitu uji kualitatif penentuan adanya rhodamin dalam blush on dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Alasan penggunaan KLT yaitu karena prosesnya sederhana, cepat, dan dapat dilakukan hampir disemua Laboratorium dan ketepatan penentuan adanya suatu komponen akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.Kromatografi lapis tipis merupakan salah satuanalisiskualitatifdari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponensampelberdasarkan perbedaan kepolaran dan adsorpsi. KLT dapat digunakan untuk pemisahan senyawa yang berbeda seperti senyawa organik alam senyawa organik sintetik,kompleks anorganik-organik dan bahkan ion anorganik,dapat dilakukan dalam beberapa menit dengan alat yang harganya tidak terlalu mahal.Pertama-tama disiapkan 3 jenis larutan yang akan ditotolkan pada pelat KLT. Hal yang pertama dilakukan adalah pembuatan larutan baku rhodamin BPFI (Baku Pembanding Farmakope Indonesia) dan sampel blush on. Larutan baku dibuat dengan menimbang 5 mg baku rhodamin-B BPFI dan dilarutkan dalam etanol 50 ml. Menggunakan etanol karena rhodamin B menurut Farmakope Indonesia sangat mudah larut dalam etanol dan dibuat sampel yang telah diekstraksi. Tujuan penggunaa larutan baku digunakan pada pelat KLT adalah untuk membandingkan hasil Rf yang terbentuk pada sampel dengan Rf yang dibentuk oleh larutan baku sehingga dapat menentukan ada atau tidak adanya kandungan rhodamin B dalam sampel. Kemudian dilakukan penyiapan fasa diam dan fasa gerak dari sistem kromatografi lais tipis ini. Sistem dari KLT ini adalah normal phase dimana fasa gerak yaitu silica gel bersifat polar dan fasa gerak bersifat lebih non polar. Fasa gerak yang digunakan merupakan campuran dari n-butanol,etil asetat,dan amoniak (55:20:25). Fasa diam adalah fasa yang terikat pada pendukung, fase diam yang digunakan pada percobaan kali ini yaitu silika gel GF 254. Silika gel adalah adsorben yang paling luas penggunaannya baik pada kromatografi kolom maupun KLT. Silika gel [(SiO2)x] mempunyai atom oksigen yang polar dan adanya gugus hidroksi pada permukaannya menjadikan silika gel bahan yang benar-benar polar. Sehingga akan menarik molekul polar daripada molekul nonpolar Silika gel disiapkan dengan asidifikasi Natrium silikat menggunakan asam sulfat yang diikuti dengan pencucian menggunakan air dan pengeringan/ pembebasan air karena jika silika gel mengandung molekul air, maka akan terjadi partisi dan bukan adsorpsi. Pengecilan ukuran partikel akan meningkatkan luas area dan akan meningkatkan daya pemisahan.arti dari G nya merupakan Gypsum(kalium sulfat) yang berperan untuk memperkuat pelapisannya pada pendukung yang digunakan, pada praktikum kali ini digunakan kaca sebagai pendukung. Arti dari F254 yatu ditambahkan zat berpendar/ indikator berflouresensi di lampu ultraviolet dengan panjang gelombang 254 nm. Sedangkan fasa gerak adalah fasa yang bergerak melalui fasa diam. Fase gerak yang digunakan yaitu etanol : etil asetat : air ( 40 : 20 : 15) sebanyak 100 ml, penggunaan pengembang tersebut karena Rhodamin B bersifat polar sehingga diharapkan dapat tertarik dengan menggunakan fase gerak yang lebih polar. Lalu fase gerak dimasukkan dalam chamber yang telah dioleskan vaselin pada permukaan tutup atas chamber yang bertujuan untuk mengedapkan udara didalam chamber agar tidak ada udara dari luar yang masuk ke dalam chamber yang dapat menggangu proses penjenuhan pengembang sehingga hasil KLT yang diperoleh tidak maksimal. Tinggi campuran pelarut dalam bejana disesuaikan dengan plat klt 16 x 20 cm yang mana titik awal plat klt tidak boleh terendam dalam campuran pelarut tersebut karena bila titik awal tercelup pada pengembangan akan menyebabkan senyawa kimia dari titik pertama akan terlarut lebih dahulu pada larutan pengembang sebelum dilakukan pemisahan.Tujuan penjenuhan yaitu supaya larutan pengembang yang dimasukkan ke dalam chamber mengalami penguapan namun tidak dapat keluar dari chamber sehingga diperoleh suasana yang jenuh. Pada suasana jenuh ini penguapan dari larutan pengembang akan menghasilkan tekanan ke atas. Keadaan inilah dimanfaatkan untuk melajukan larutan pengembang, kemudian penjenuhan fase gerak juga dilakukan untuk meningkatkan efektivitas dari pemisahan pada kromatografi lapis tipis. Ketidakjenuhan bejana akan mengakibatkan beberapa masalah seperti speading spot, tailing dan ketidaktepatan Rf. Selanjutnya diatas pelat silika yang telah disiapkan ditotolkan larutanbaku dan larutan sampel pada plat dengan jarak antar titik 2,5 cm supaya spot yang ada tidak saling tumang tindih atau saling menumpuk sehingga akan mengacaukan hasil Rf. Sebelum mentotolkan sampel ke plat KLT, terlebih dahulu dibuat batas atas dan batas bawah dengan menggunakan pensil, hal ini bertujuan agar kita mengetahui dimana pentetesan sampel itu. Dalam penandaan tidak digunakan tinta karena pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk. Hal ini dapat mempengaruhi proses pengelusian senyawa sample. Pertama-tama pada plat dibuat garis 1 cm dari masing-masing ujung dengan menggunakan pensil. Pensil dipilih dari pada alat tulis dengan tinta karena tinta dapat mengganggu hasil karena akan terbawa bersama fase gerak. Titik tempat ditempatkan disebut titik awal. Larutan sampel dan baku diletakkan pada titik awal dengan menotolkan menggunakan pipa kapiler sebanyak 3-5 kali pada titik yang sama sampai jenuh dan diusahakan agar luas totolan sekecil mungkin. Jumlah totolan tidak boleh terlalu banyak karena menyebabkan bercak menjadi asimetris dan menyebabkan perubahan pada harga Rf . Selain itu penotolan harus tepat sehingga didapatkan jumlah noda yang baik. Penotolan cuplikan merupakan tahap yang paling menentukan pada KLT. Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran sekecil dan sesempit mungkin. Jika sampel ditotolkan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Penotolan yang tidak tepat akan menyebarkan bercak yang menyebar dan puncak ganda dan jika penotolan terlalu sedikit maka spot yang teramati tidak akan jelas. Kemudian lempeng KLT dimasukkan ke dalam chamber yang berisi fase gerak yang telah jenuh. Ketika pelarut mulai membasahi plat / lempengan, pelarut pertama-tama akan melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar.Senyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut. Senyawa yang bersifat polar akan ikut tertarik oleh pengembang, karena eluen yang digunakan memiliki kepolaran yang lebih tinggi daripada silika sehingga ikatan Rhodamin B dengan silika lebih kecil daripada ikatan Rhodamin B dengan eluen sehingga akibatnya Rhodamin B akan berada pada jarak mendekati fase gerak. Pemisahan pada kromatografi lapis tipis dilakukan sampai eluen mencapai garis akhir pelarut. Setelah pengembang sampai pada garis akhir pada pelat, pelat diangkat dan didiamkan hingga kering. Lalu diukur nilai Rf (factor), nilai Rf menyatakan ukuran daya pisah suatu zat dengan KLT, dimana jika nilai Rfnya besar berarti daya pisah zat yang dilakukan solvent (eluennya) maksimum sedangkan jika nilai Rfnya kecil berarti daya pisah zat yang dilakukan solvent (eluenya) minimum. Nilai Rfuntuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Dari hasil percobaan ini didapatkan Rf larutan baku Rhodamin-B BPFI yaitu 0,89 dan RF larutan sampel 0,84 yang menunjukan bahwa sampel teikat dengan eluen sehingga mendekati laju fase gerak. RF baku dengan sampel tersebut hampir mirip sehingga dapat dikatakan dalam sampel tersebut mengandung Rhodamin B.