Skrining Gen TMPRSS6 pada SNP ss8296198 pada

Mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 –

2014 Menggunakan Teknik High Resolution Melting

“Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk

Memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN ”

OLEH :

Adamilzary Fikry Abdulmannan

1112103000051

Program Studi Pendidikan Dokter

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

1436 H/ 2015 M

ii

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Dengan ini saya menyatakan bahwa:

1. Laporan penelitian ini merupakan hasil karya asli saya yang diajukan untuk

memenuhi salah satu persyaratan memperoleh gelar strata 1 di UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta

2. Semua sumber yang saya gunakan dalam penulisan ini telah saya cantumkan sesuai

dengan ketentuan yang berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3. Jika dikemudian hari terbukti bahwa karya ini bukan karya asli saya atau merupakan

hasil jiplakan dari karya orang lain, maka saya bersedia menerima sanksi yang

berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Ciputat, 16 Oktober 2015

Adamilzary Fikry Abdulmannan

Materai

6000

v

KATA PENGANTAR

Assalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh,

Alhamdulillah puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan

rahmat dan ridho-Nya serta shalawat dan salam selalu tercurah kepada junjungan Nabi

Muhammad SAW karena dengan rahmat dan ridho-Nya penulis dapat menyelesaikan

penelitian dan laporan penelitian dengan judul “Skrining Gen TMPRSS6 pada SNP

ss8296198 pada Mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter Universitas Islam

Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014 Menggunakan Teknik

High Resolution Melting.”

Penyusunan laporan penelitian ini dapat terselesaikan karena bantuan dari

berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada yang

terhormat:

1. Prof. Dr. H. Arif Sumantri, SKM, M.Kes. selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Keseharatan UIN Jakarta,

2. dr. Achmad Zaki,Sp.OT, M.Epid selaku Ketua Program Studi Pendidikan Dokter,

3. dr. Nouval Shahab, SpU, PhD, FICS, FACS selaku Penanggung Jawab Modul

Riset Program Studi Pendidikan Dokter 2012,

4. Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD dan dr. Nouval Shahab, SpU, PhD, FICS,

FACS selaku pembimbing pertama dan kedua saya yang selalu membimbing,

mengajarkan, memfasilitasi, dan menyemangati.

5. dr.Mukhtar Ikhsan, Sp.P(K),MARS dan Nurlaely Mida R. S.Si, M.Biomed,DMS

selaku penguji pertama dan kedua.

6. Kedua orang tua saya, Dedi Abdulmannan dan Leni Nurleni yang selalu

memberikan kasih sayang, cinta, doa, dan semangat, sehingga memotivasi dan

menguatkan saya dalam melakukan penelitian ini.

7. Adik - adik saya tercinta, Adamilyara Aqil Abdulmannan dan Muhammad Fahmy

Abdulmannan yang telah memberikan semangat dalam menyelesaikan penelitian

ini.

vi

8. Laboran di laboratorium biokimia dan biologi yang telah membantu

berlangsungya penelitian ini.

9. Teman sekelompok dan seperjuangan penelitian, Hipni Solehudin, Amatillah

Raifah, Rizky Ananda Marpaung dan Nurul Hasanah yang telah menyemangati,

membantu, dan berjuang bersama di dalam penelitian ini.

10. Semua responden yang telah bersedia untuk menjalani penelitian ini.

11. Seluruh mahasiswa PSPD UIN Jakarta angkatan 2012.

12. Teman – teman Mercy yang selalu memberikan dukungan dan semangat.

Penulis menyadari dalam penyusunan laporan ini masih banyak terdapat kekurangan.

Kritik dan saran yang membangun dari semua pihak akan penulis terima demi laporan

penelitian yang lebih baik. Penulis berharap penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua

pihak yang memerlukan. Akhir kata, semoga segala bantuan yang telah diberikan kepada

penulis akan mendapat balasam, rahmat, dan ridho dari Allah SWT, Amin.

Wassalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh.

Jakarta, 16 Oktober 2015

Penulis

vii

ABSTRAK

Adamilzary Fikry Abdulmannan. Program Studi Pendidikan Dokter. Skrining Gen

TMPRSS6 pada SNP ss8296198 pada Mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014

Menggunakan Teknik High Resolution Melting.

Anemia defisiensi besi merupakan anemia yang paling sering dijumpai terutama di negara

berkembang. Tujuan penelitian ini untuk melakukan skrining alel SS826198 serta

hubungannya dengan kadar hemoglobin dan mengetahui adanya faktor lain yang

menyebabkan anemia defisiensi besi yang disebabkan oleh mutasi gen pada mahasiswa

PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2012 – 2014 dengan menggunakan

teknik High Resolution Melting. Penelitian ini menggunakan metode experimental

dimana terpilih sebanyak 102 orang dari 3 kelas yang telah dipilih secara Simple Random

Sampling untuk diambil darahnya, berat badan, tinggi badan serta kadar hemoglobinnya.

Sebanyak 64 orang berjenis kelamin perempuan dan 38 orang laki – laki dengan rentang

usia dari 17 tahun hingga 23 tahun. Hasil penelitian didapatkan sebanyak 22 orang

memiliki alel Wildtype, 76 orang memiliki alel Heterozygote, 4 orang memiliki alel

Mutant. Berdasarkan analisis bivariat menggunakan uji chi square didapatkan hubungan

yang bermakna antara kadar hemoglobin dengan jenis kelamin sebesar p=0,001 dan

didapatkan nilai p=0,873 yang menunjukan tidak adanya hubungan antara genotip

ss8296198 dengan kadar hemoglobin sebesar 0,873.

Kata kunci: Anemia defisiensi besi, genotip ss8296198, High Resolution Melting.

ABSTRACT

Adamilzary Fikry Abdulmannan. Medical Education Study Program. Skrining Gen

TMPRSS6 pada SNP ss8296198 pada Mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014

Menggunakan Teknik High Resolution Melting.

Iron deficiency anemia is the most common anemia, especially in developing countries.

The purpose of this study was to perform screening SS826198 allele and its relationship

with the levels of hemoglobin and aware of other factors that cause iron deficiency anemia

caused by mutations in a gene on medical student of UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

forces 2012-2014 using High Resolution Melting technique. This research used

experimental method which was chosen as many as 102 people from 3 classes that have

been selected by simple random sampling for blood drawn, weight, height and

hemoglobin levels. A total of 64 female and 38 male with an age range from 17 years to

23 years. The result showed as many as 22 people have wildtype allele, 76 people have

heterozygote alleles, 4 people have a mutant allele. Based on bivariate analysis using chi

square test found a significant association between hemoglobin levels by sex at p = 0.001

and p = 0.873 which showed no association between genotype ss8296198 with

hemoglobin levels.

Keywords: Iron deficiency anemia, genotyping ss8296198, High Resolution Melting

viii

DAFTAR ISI

LEMBAR JUDUL ................................................................................................ i

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................ ii

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................. iii

LEMBAR PENGESAHAN .................................................................................. iv

KATA PENGANTAR .......................................................................................... v

ABSTRAK ........................................................................................................... vii

DAFTAR ISI ..................................................................................................... viii

DAFTAR TABEL ................................................................................................. xi

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xii

DAFTAR SINGKATAN ................................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xiv

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ...................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................................ 2

1.3 Hipotesis ............................................................................................... 2

1.4 Tujuan Penelitian .................................................................................. 2

1.5 Manfaat Penelitian ................................................................................ 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Anemia ................................................................................................ 4

2.1.1 Epidemiologi ......................................................................... 4

2.1.2 Etiologi .................................................................................. 4

2.1.3 Patogenesis ............................................................................ 5

2.1.4 Manifestasi Klinis .................................................................. 5

2.1.5 Diagnosis ............................................................................... 5

2.1.6 Metabolisme Besi .................................................................. 6

2.1.7 Faktor yang Mempengaruhi Penyerapan Besi ....................... 7

2.1.7 Makanan – Makanan Sumber Zat Besi.................................. 9

2.2 Gen ...................................................................................................... 9

2.2.1 Replikasi DNA ...................................................................... 10

2.2.2 Sintesis DNA Baru .............................................................. 11

2.2.3 Pemanjangan Anti Paralel ................................................... 11

2.2.4 Perbaikan DNA ................................................................... 12

2.2.5 Cara Kerja PCR ................................................................... 13

2.3 Kerangka Teori.................................................................................. 14

2.4 Kerangka Konsep .............................................................................. 15

ix

2.5 Definisi Operasional……………………………………………..16

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Metode Penelitian ............................................................................... 17

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian............................................................. 17

3.3 Populasi dan Sampel ........................................................................... 17

3.3.1 Populasi Target .................................................................... 17

3.3.2 Populasi Terjangkau ............................................................ 18

3.3.3 Perkiraan Besar Sampel ....................................................... 18

3.3.4 Kriteria Pemilihan Sampel .................................................. 19

3.3.5 Teknik Pengambilan Sampel ............................................... 19

3.4 Alat dan Bahan ................................................................................... 19

3.5 Cara Kerja Penelitian .......................................................................... 21

3.5.1 Desain Primer ss8296198 .................................................... 21

3.5.2 Desain High Resolution Melting ss8296198 ....................... 21

3.5.3 Isolasi DNA ......................................................................... 22

3.5.4 Tata Kerja PCR – HRM ...................................................... 24

3.5.5 Alur Kerja Penelitian ........................................................... 25

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil .................................................................................................... 26

4.1.1 Data Karakteristik Responden .................................................... 26

4.1.1.1 Jenis Kelamin .................................................................. 26

4.1.1.2 Usia .................................................................................. 27

4.1.1.3 Hasil Pengukuran IMT .................................................... 28

4.1.1.4 Hasil Pengukuran Kadar Hemoglobin ............................. 28

4.1.1.5 Hasil Isolasi DNA Genom dari Whole Blood ................. 29

4.1.1.6 Hasil Analisis Kurva Genotip Wildtype, Heterozygote,

dan Mutant ....................................................................... 30

4.1.1.7 Hasil Gambaran Kurva HRM .............................................. 31

4.1.1.8 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Kadar

Hemoglobin ..................................................................... 33

4.1.1.9 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotip

ss8296198 ........................................................................ 34

4.1.1.10 Hasil Hubungan Genotip ss8296198 dengan

Kadar Hemoglobin (Anemia dan Normal) ...................... 35

4.2.Pembahasan ........................................................................................ 36

4.2.1 ss826198 ................................................................................... 36

4.2.2 Desain Primer ss826198 ........................................................... 37

4.2.3 Hasil Desain Primer .................................................................. 38

4.2.4 Hasil Kurva HRM ..................................................................... 41

4.2.3 Data Statistik ............................................................................. 43

4.3. Keterbatasan penelitian..................................................................... 43

x

BAB V SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan ............................................................................................. 44

5.2 Saran ................................................................................................... 44

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 45

LAMPIRAN ........................................................................................................ 47

xi

DAFTAR TABEL

Tabel 3.1 Alat dan Bahan ..................................................................................... 19

Tabel 3.2 Isolasi DNA .......................................................................................... 22

Tabel 3.3 Prosedur HRM ...................................................................................... 24

Tabel 4.1 Karakteristik Jenis Kelamin Responden ............................................... 26

Tabel 4.2 Kemurnian dan Konsentrasi Hasil Isolasi Genom DNA Responden ... 30

Tabel 6.1 Hasil Pengukuran Kemurnian dan Konsentrasi DNA genom

Responden ............................................................................................ 52

xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Patofisiologi Mutasi gen TMPRSS6 ss826198 menyebabkan

IRIDA ............................................................................................... 7

Gambar 2.2 Skema metabolisme zat besi didalam tubuh manusia....................... 9

Gambar 2.3 Bagan cara kerja PCR ....................................................................... 13

Gambar 2.4 Kerangka Teori ................................................................................. 14

Gambar 2.5 Kerangka Konsep.............................................................................. 15

Gambar 3,1 Alur Kerja Penelitian ........................................................................ 25

Gambar 4.1 Karakteristik Jenis Kelamin Responden ........................................... 26

Gambar 4.2 Karakteristik Usia Responden .......................................................... 27

Gambar 4.3 Karakteristik IMT responden ............................................................ 28

Gambar 4.4 Kadar Hemoglobin Responden ......................................................... 29

Gambar 4.5 Dokumentasi hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom DNA

sampel ............................................................................................... 30

Gambar 4.6 Genotype SNP ss8296198 ................................................................ 31

Gambar 4.7 Kurva HRM ...................................................................................... 31

Gambar 4.8 Hasil sekuensing ss826198 Untuk wild type .................................... 32

Gambar 4.9 Hasil sekuensing ss826198 untuk heterozygote type no 70 ............. 32

Gambar 4.10 Hubungan Kadar Hemoglobin dengan Jenis Kelamin .................. 33

Gambar 4.11 Menunjukan hubungan jenis kelamin dengan genotip ss8296198 . 34

Gambar 4.12 Hubungan Genotip ss8296198 dengan Kadar Hemoglobin

(Anemia dan Normal) .................................................................... 35

Gambar 4.13 Letak lokasi mutasi gen ss8296198 ................................................ 36

Gambar 4.14 Lokasi Mutasi IRIDA ..................................................................... 37

Gambar 4.15 Area desain primer untuk ss8296198 ............................................. 40

Gambar 4.16 Optimasi PCR Fase Annealing ....................................................... 40

Gambar 4.17 Gel Documentation Elektroforesis Agarose dari Isolasi Genom

PCR-HRM ...................................................................................... 41

Gambar 4.18 Contoh Kurva HRM ....................................................................... 42

Gambar 7.3.1 Elektroforesis ................................................................................. 49

Gambar 7.3.2 Centrifuge Eppendorf .................................................................... 49

Gambar 7.3.3 Alat Inkubator ................................................................................ 49

Gambar 7.3.4 Micropipet & Tip ........................................................................... 49

Gambar 7.3.5 Cold Room dan Freezer ................................................................. 49

Gambar 7.3.6 vortex ............................................................................................. 49

Gambar 7.3.7 Instrument LightCycler® 480 II Roche ...................................... 49

Gambar 7.3.8 DNA sampel .................................................................................. 50

Gambar 7.3.9 Multiwall Plate Light Cycler® Roche ........................................... 50

Gambar 7.4 Bahan isolasi DNA Geneaid (Elution buffer, GB buffer, Wash

buffer, W1 buffer, RBC Lysis buffer dan Ethanol absolute 70%). 50

Gambar 7.4.1 Primer TMPRSS6 .......................................................................... 50

Gambar 7.4.2 gBlock TMPRSS6 ......................................................................... 50

Gambar 7.4.3 Mix HRM........................................................................................50

xiii

Gambar 7.4.4 Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom

DNA sampel .................................................................................. 51

xiv

DAFTAR SINGKATAN

PCR Polimerase Chain Reactiom

HRM High Resolution Melting

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

RNA Ribo Nucleic Acid

SNP Single Nucleotide Polymorphism

UIN Universitas Islam Negeri

WHO World Health Organization

RBC Red Blood Cell

PSPD Program Studi Pendidikan Dokter

HJV Hemojuvelin

BMP Bone Morphogenic Protein

IRIDA Iron Refractory Iron Deficiency Anemia

xv

LAMPIRAN

Lampiran 1 Lembar Permohonan Ethical Approval Penelitian............................ 47

Lampiran 2 Lembar Persetujuan Responden ........................................................ 48

Lampiran 3 Alat dan Bahan Penelitian ................................................................. 49

Lampiran 4 Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom

DNA sampel ..................................................................................... 51

Lampiran 5 Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel .............................. 52

Lampiran 6 Hasil Uji Statistik .............................................................................. 55

Lampiran 7 Curriculum Vitae Peneliti ................................................................. 59

1

BAB I

1.1.Latar Belakang

Semakin maju dan canggihnya perkembangan ilmu pengetahuan

menyebabkan semakin banyak ditemukannya berbagai macam penyakit yang

disebabkan oleh gangguan yang terjadi tidak hanya pada sel, tetapi sampai

genetika. Diantaranya adalah mulai ditemukannya bahwa mutasi gen dapat

memunculkan berbagai macam jenis penyakit dan sindrom, termasuk di dalamnya

adalah IRIDA (Iron Deficiency Iron Refractory Anemia) yang seringkali kita

memasukannya ke dalam anemia defisiensi besi.

Anemia defisiensi besi sendiri merupakan jenis anemia yang sering dijumpai,

terutama banyak ditemukan pada negara berkembang. Menurut Martoatmodjo et

al diperkirakan di Indonesia sekitar 16- 50 % laki – laki menderita penyakit

tersebut dan 25- 48 % pada perempuan tidak hamil. Di Bali, ditemukan angka

anemia pada pegawai pensiunan sebesar 36 – 61 %, sedangkan pada perempuan

hamil ditemukan sekitar 50 – 75 %.1

Menurut WHO, diketahui sekitar 2 juta orang mengalami anemia dan

diperkirakan lebih dari 30 % populasi dunia mengalami anemia. Kebanyakan

diakibat oleh asupan besi yang kurang, daerah dengan sosioekonomi rendah, dan

daerah yang memiliki tingkat prevalensi penyakit infeksi tinggi seperti penyakit

Malaria, HIV/AIDS, Cacing tambang, Schistosomiasis, dan penyakit lain seperti

Tuberkulosis.2

Menurut data riskesdas pada tahun 2013, jumlah penduduk dengan usia ≥ 1

tahun dengan keadaan anemia mencapai 21, 7 %, dimana persentase pada balita

sebesar 28,1 % diikuti pada anak sekolah, remaja sampai dewasa muda (34 tahun)

dan persentase kembali meningkat pada kelompok umur yang lebih tinggi.

Sedangkan berdasarkan jenis kelamin, pada perempuan lebih banyak mengalami

anemia dibandingkan laki – laki..3

2

Tingginya angka penderita penyakit anemia yang disebabkan oleh defisiensi

besi khususnya pada negara – negara berkembang seperti Indonesia, maka

diperlukannya suatu tindakan yang efektif, murah dan efisien serta tepat laksana

dalam penanggulangan masalah anemia defisiensi besi sehingga diharapkan

kedepannya minimal dapat mengurangi angka kejadian dari penyakit anemia

defisiensi besi.

Teknik PCR-HRM sendiri telah diketahui sebelumnya bahwa metode ini

dapat mendeteksi adanya mutasi hingga konsentrasi DNA mutan dalam campuran

DNA Wild type sebesar 12,5%. 4

1.2.Rumusan Masalah

- Apakah terdapat hubungan antara mutasi pada SS8296198 dengan angka

hemoglobin yang rendah pada pasien

- Berapakah frekuensi populasi mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

yang memiliki SNP genotype SS8296198

1.3.Hipotesis

Terdapat hubungan antara mutasi gen pada SNP SS826198 dengan rendahnya

kadar Hemoglobin pada darah.

1.4.Tujuan Penulisan

a. Tujuan Umum

Untuk melakukan skrining SNP SS8296198 menggunakan teknik HRM

pada mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2012 –

2014.

b. Tujuan Khusus

3

a. Mengetahui hubungan antara antara mutasi pada SS8296198 dengan

angka hemoglobin yang rendah pada mahasiswa PSPD UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta angkatan 2012 – 2014.

b. Mengetahui terdapat atau tidaknya faktor lain yang menyebabkan

terjadinya mutasi pada SNP SS8296198.

1.5.Manfaat Penulisan

Hasil penelitian diharapkan memiliki manfaat untuk :

1.5.1. Bagi Peneliti

a. Memiliki Keterampilan dalam molekuler untuk mengetahui adanya

mutasi gen dengan teknik HRM.

b. Merupakan syarat kelulusan preklinik Program Studi Pendidikan Dokter

c. Menambah pengetahuan mengenai mutasi gen pada SS8296198.

d. Dapat memberikan edukasi tenaga kesehatan dalam menanggapi masalah

anemia yang disebabkan IRIDA.

1.5.2. Civitas Akademika

Sebagai sumber pengetahuan dan referensi bagi peneliti selanjutnya

yang akan melakukan penelitian yang berkaitan dengan penelitian ini.

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Anemia

2.1.1 Epidemiologi

Anemia defisisensi besi merupakan penyakit paling umum dan penyakit yang

berhubungan dengan nutrisi yang paling luas sebarannya di dunia. Dimana penyakit

ini menurut angka kejadiannya banyak dialami pada anak – anak dan perempuan

pada negara berkembang. Diketahui sekitar 2 juta orang mengalami anemia dan

diperkirakan lebih dari 30 % populasi dunia mengalami anemia, yang kebanyakan

diakibatkan dari asupan besi yang kurang, daerah miskin, dan daerah yang memiliki

tingkat prevalensi penyakit infeksi tinggi seperti penyakit Malaria, HIV/AIDS,

Cacing tambang, Schistosomiasis, dan penyakit lain seperti Tuberkulosis .2

Menurut studi literatur melaporkan anemia defisiensi besi telah terjadi pada 2

% laki – laki dewasa, 9-12 % perempuan berkulit putih, dan 20 % pada orang

berkulit hitam dan pada perempuan Mexico – Amerika. Selain itu ditemukan bahwa

9 % penderita anemia defisiensi besi dengan usia lebih dari 65 tahun diketahui

menderita kanker gastrointestinal. 1

2.1.2 Etiologi

Anemia defisiensi besi dapat disebabkan oleh beberapa hal, seperti : Peningkatan

penggunaan besi dan hematopoiesis akibat pertumbuhan yang terlampau cepat,

kehamilan, dan pengobatan eritropoietin. Selain itu dapat juga disebabkan oleh

meningkatnya tingkat kehilangan besi akibat dari perdarahan kronik, menstruasi,

kehilangan darah akut, donor darah, dan phlebotomi pada pengobatan polisitemia

vera. Dan dapat juga disebabkan oleh penurunan pemasukan dan absorpsi besi

akibat pemasukan konsumsi besi yang tidak adequat, terdapatnya kelainan

5

penyerapan seperti penyakit Sprue dan penyakit Crohn, dan juga akibat

pembedahan gastrektomi, dan inflamasi akut dan kronik.2

2.1.3 Patogenesis

Pada proses pematangan eritrosit akan melibatkan sintesis dari hemoglobin dan

pembentukan suatu badan kecil, berbentuk bikonkaf dan tanpa inti. Dalam proses

pematangannya, eritrosit dapat mengalami beberapa hal seperti pengurangan

volume dan inti sel, lalu anak inti akan mengecil dan menghilang. Selanjutnya

kromatin akan menjadi semakin padat sampai inti terlihat piknotik sampai akhirnya

didorong keluar sel. Lalu terjadi pengurangan jumlah dari poliribosom yang diikuti

dengan peningkatan jumlah hemoglobin di dalam sitoplasma. Organel lain dan

mitokondria pun berangsur – angsur akan menghilang.3

2.1.4 Manifestasi Klinis

Gejala umum anemia biasanya didapatkan apabila kadar anemia turun

dibawah 7-8 gr/dl dengan gejala berupa badan lemah, pucat, kelelahan, pusing,

Dyspneu d’effort, mata berkunang – kunang, telinga mendenging dan gejala umum

hipoksia lainnya. Pada gejala kronik dan respon kardiovaskular yang terjadi adalah

takikardi, peningkatan curah jantung, vasodilatasi. Sedangkan gejala khusunya

berupa Koilonychia (Kuku berbetuk seperti sendok), atrofi papil lidah, Stomatitis

Angularis, Disfagia, Atrofi mukosa gaster yang menyebabkan akhloridia, dan Pica

(keinginan memakan makanan yang tidak lazim).1,5

2.1.5 Diagnosis :

Seseorang dikatakan anemia apabila pada balita usia 12- 59 bulan kadar Hb

dibawah 11,0 gr/dL. Anak – anak sekolah usia 6 -12 tahun kadar Hb, 12,0 gr/dL.

Ibu hamil, 11,0 gr/dL. Laki – laki ≥ 15 tahun bila kadar Hb <13 gr/dL dan wanita

subur 15 – 49 tahun bila kadar Hb <12 gr/dL.3

6

2.1.6 Metabolisme Besi

Besi membentuk inti dari cincin besi – porfirin yang bersama globin berbentuk

hemoglobin. Pada keadaan anemia defisiensi besi, akan terbentuk eritrosit yang

berukuran kecil dan tidak cukup mengandung hemoglobin sehingga dapat

memberikan gambaran berupa anemia mikrositik hipokromik.4

Di alam, besi inorganik bebas bersifat toksik, namun besi juga merupakan zat

yang penting untuk tubuh. Agar dapat digunakan, besi harus melewati berbagai

macam proses terlebih dahulu seperti absorpsi, transpor, dan penyimpanan besi

hingga akhirnya dapat benar – benar digunakan oleh tubuh.8

Pada tubuh manusia, besi hanya dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit, Hal

tersebut disebabkan hanya sedikit jumlah besi yang hilang dari tubuh setiap harinya.

Sehingga dengan asupan diet besi dalam jumlah kecil saja sudah cukup untuk

memenuhi kebutuhan besi harian setiap individu pada berbagai macam makanan.

Meskipun begitu, terdapat beberapa masyarakat khusus yang dalam kondisinya

membutuhkan asupan jumlah besi lebih tinggi dibandingkan masyarakat pada

umunya masyarakat tersebut seperti pada anak yang masih dalam masa

pertumbuhan, ibu hamil dan juga pada perempuan yang sedang menstruasi.8

Anemia defisiensi besi dapat terjadi tidak hanya disebabkan oleh gangguan

pada proses masuknya ataupun pengeluaran besi. Namun, terjadi karena adanya

mutasi gen TMPRSS6 sehingga mempengaruhi kerja enzim matriptase – 2 (MT2)

yang memiliki fungsi sebagai regulator negatif pada transkripsi dari hepsidin. Jika

terjadi peningkatan kadar hepsidin maka akan menghambat proses penyerapan

besi.5

Penyakit dengan gangguan mutasi pada TMPRSS6 disebut juga dengan Iron

Refractory iron deficiency anaemia (IRIDA). Dimana IRIDA sendiri merupakan

penyakit autosomal resesif yang tergolong anemia hipokrom mikrositik berat.

7

Dalam temuan laboratorium dapat ditemukan serum besi dan saturasi transferin

yang rendah, normal – tinggi ferritin dan tingginya hormon hepsidin. Menurut studi

pustaka, pasien yang mengalami penyakit ini akan tidak berespon terhadap

pengobatan besi secara oral dan keterlambatan respon pada asupan besi melalui

jalur intravena.

Gambar 2.1 Patofisiologi Mutasi gen TMPRSS6 SS826198 menyebabkan IRIDA5

(Sumber : Goncalves L, Nobre JG, Afonso C et al. The Role of TMPRSS6 gene variants in

different types of Iron Deficiency Anaemia from The Rare Severe Hereditary IRIDA to The

Common Mild Acquired IDA. 2014)

Mekanisme gambar 2.1 : A) Matripase – 2 mencegah ekspresi berlebih

hepsidin dengan mendegradasi Hemojuvelin (HJV). Hemojuvelin sendiri memiliki

fungsi sebagai Co-reseptor dari BMP (Bone Morphogenic Protein). Sedangkan

BMP berperan dalam pengekspresi gen HAMP. B) Apabila terjadi defisiensi dari

matriptase – 2 akan menyebabkan tingginya jumlah dari HJV yang dapat

meningkatkan jalur BMP, dengan begitu overekspresi hepsidin akan terjadi

sehingga menyebabkan penghambatan absorpsi, pengeluaran dan pembentukan

kembali dari besi penyebab IRIDA.9

2.1.7 Faktor – faktor yang mempengaruhi penyerapan zat besi

1. Tingginya kebutuhan tubuh akan zat besi. Pada kondisi seperti simpanan zat besi

yang berkurang akan merangsang respon tubuh berupa peningkatan penyerapan besi

8

2. Rendahnya HCl (Asam Klorida) pada lambung (Kondisi basa) akan menurunkan

penyerapan. Hal ini disebabkan fungsi HCl yang dapat merubah besi Fe 3+ menjadi

Fe2+ dimana Fe2+ lebih mudah diserap oleh mukosa usus.

3. Vitamin C gugus S1-I dan asam amino sulfur dapat meningkatkan absorpsi zat besi.

Karena sifat Vitamin C yang dapat dapat merubah besi Fe3+ menjadi Fe2+ dan juga

melalui pembentukan kompleks ferro askorbat yang dapat meningkatkan penyerapan

besi sebesar 25 – 50 %.

4. Protein hewani dapat meningkatkan penyerapan Fe.

5. Kelebihan besi fosfat menyebabkan besi tidak dapat diserap. Disebabkan karena besi

akan membentuk kompleks besi fosfat.

6. Terdapat Fitat menurunkan penyerapan Fe.

7. Penyakit yang menyebabkan gangguan pada usus dapat menurunkan penyerapan

pada usus seperti pada penyakit diare.

8. Penyakit infeksi menurunkan penyerapan Fe.6

9

Gambar 2.2 Skema metabolisme zat besi didalam tubuh manusia 5 7

2.1.8 Makanan – Makanan Sumber Zat Besi

Sereal (1-22 mg) Remis ( 23,7 mg), Nasi (9,73 mg), Kacang (8,2 mg), Kerang

(5,9 mg), Hati sapi (5,24 mg)8

2.2 Gen

DNA merupakan materi genetik berupa polimer dari nukleotida – nukleotida,

yang terdiri atas 3 komponen nukleotida : basa nitrogen, gula pentosa

(deoksiribosa), dan gugus fosfat. Dimana basa dapat berupa Adenin (A), Timin (T),

Guanin (G), Sitosin (C). Menurut penelitian dari Chargaff mengatakan bahwa

10

jumlah Adenin akan sama dengan jumlah Timin, sedangkan jumlah Guanin akan

sama dengan jumlah Sitosin.

2.2.1 Replikasi DNA

Replikasi dimulai dari suatu tempat khusus yaitu titik mula replikasi, bentangan

pendek DNA yang memiliki sekuens nukleotida spesifik. Protein – protein yang

menginisiasi replikasi DNA mengenali sekuens ini dan melekat ke DNA,

selanjutnya memisahkan kedua DNA dan membuka gelembung replikasi. Setelah

itu replikasi DNA berlanjut ke kedua arah sampai keseluruhan molekul tersalin.

Pada setiap ujung gelombang replikasi terdapat garpu replikasi, yaitu wilayah

berbentuk Y tempat untai induk sedang dibuka. Helikase adalah enzim – enzim

yang membuka uliran heliks ganda di garpu replikasi yang memisahkan dua untai

induk dan menjadikan keduanya tersedia sebagai untaian cetakan. Setelah

pemisahan untai induk, Single Strand Binding Protein berikatan dengan untai- untai

DNA tak berpasangan dan menstabilkan untai tersebut. Pembukaan uliran heliks

ganda menyebabkan uliran dan tegangan yang lebih ketat di depan garpu replikasi.

Topoisomerase membantu mengurangi tegangan ini dengan cara mematahkan,

memuntirkan dan menggabungkan kembali untai – untai DNA.

Bagian – bagian untai DNA induk yang terbuka kini tersedia sebagai cetakan

untuk sintesis untai – untai DNA komplementer baru. Akan tetapi, enzim – enzim

yang menyintesis DNA tidak dapat menginisiasi sintesis polinukleotida. Enzim

tersebut hanya dapat menambahkan nukleotida – nukleotida ke untai cetakan.

Rantai nukleotida yang dihasilkan pertama kali merupakan bentangan rantai pendek

RNA. Dimana rantai RNA disini disebut primer dan disintesis oleh enzim primase.

Primase mengawali rantai RNA dari satu nukleotida RNA tunggal, lalu

menambahkan nukleotida - nukleotida RNA satu persatu, menggunakan untai

DNA induk sebagai cetakan.

11

2.2.2 Sintesis DNA Baru

Enzim yang disebut DNA polimerase mengkatalisis sintesis DNA baru dengan

cara menambahkan nukleotida – nukleotida ke rantai DNA yang telah ada

sebelumnya. Dimana sebagian DNA polimerase membutuhkan primer dan untai

cetakan DNA selain jejeran nukleotida DNA komplementer.

Setiap nukleotida yang ditambahkan ke untai DNA berasal dari nukleosida

trifosfat, yang merupakan suatu nukleosida (gula dan basa) dengan tiga gugus

fosfat. Dimana gulanya sebagai nukleosida trifosfat yang memberikan nukleotida

adenin ke DNA. Gula tersebut berupa deoksiribosa, dimana nukleosida trifosfat

yang digunakan untuk sintesis DNA secara kimiawi bersifat reaktif, karena

sebagian ekor trifosfat memiliki gugus muatan negatif yang tidak stabil. Ketika

setiap monomer bergabung ke ujung untai DNA yang sedang tumbuh, dua gugus

fosfat hilang sebagai suatu molekul pirofosfat. Hidrolisis pirofosfat yang terjadi

setelahnya menjadi dua molekul fosfat anorganik adalah reaksi eksergonik

tergandengkan yang membantu menggerakan reaksi polimerisasi.

2.2.3 Pemanjangan Anti Paralel

Pada kedua ujung untai DNA berbeda satu sama lain sehingga setiap untai

memiliki keterarahan (direksionalitas). Selain itu, kedua untai DNA dalam suatu

heliks ganda bersifat anti paralel , yang berarti terorientasi ke arah yang berlawanan.

DNA polimerase hanya dapat menambahkan nukleotida – nukleotida hanya ke

ujung 3’ bebas dari suatu primer atau untai DNA yang sedang tumbuh, tidak pernah

ke ujung 5 ‘ sehingga dapat dikatakan bahwa untai DNA baru hanya dapat

memanjang dari 5’ 3’.

DNA polimerase III dapat menyintesis suatu untai komplemeter secara terus

menerus dengan memperpanjang daerah baru kearah 5‘3’. DNA pol III

menempel ke garpu replikasi di untai cetakan dan terus menerus menambahkan

nukleotida ke untai komplementer baru seiring majunya garpu replikasi. Dimana

hal tersebut merupakan untai DNA maju (Leading Strand).

12

Selain leading strand DNA, terdapat untai DNA lain yaitu untai lambat (

Lagging Strand ) dimana pada untai ini prosesnya disintesis secara tersendat –

sendat, sebagai rangkaian dari segmen – segmen . Segmen – segmen ini sering

disebut sebagai fragmen Okazaki.

Pada Fragmen Okazaki, setiap masing-masing segmen untai lambat

membutuhkan satu primer tersendiri tidak seperti pada untai maju yang hanya

membutuhkan satu buah primer saja. DNA Polimerase I pada untai lambat

berfungsi sebagai pengganti nukleotida RNA primer dengan nukleotida versi DNA.

Dimana yang bersangkutan menambahkan nukleotida satu demi satu sampai ke

ujung 3’ Fragmen Okazaki yang bersebelahan. Tetapi pada penggabungan

nukleotida terakhir dari segmen DNA ke nukleotida DNA Fragmen Okazaki akan

digantikan oleh DNA ligase sebagai penggabung gula fosfat dari fragmen Okazaki

menjadi untai DNA tidak terputus.

2.2.4 Perbaikan DNA

Seringkali DNA salah dalam berpasangan, oleh sebab itu terdapatlah

mekanisme pengecekan dan perbaikan DNA atau biasa disebut sebagai Mismatch

Repair. Disini, enzim – enzim berperan sebagai penyingkir serta pengganti

nukleotida yang salah berpasangan pada replikasi. Hal ini diduga terjadi akibat dari

penemuan yang mengatakan bahwa telah ditemukannya hubungan yang terjadi

antara cacat herediter pada suatu enzim dengan kejadian kanker usus besar.9

13

2.2.5 Cara kerja PCR

Gambar 2.3 Bagan cara kerja PCR

(Sumber : Campbell NA, Reece JB, Urry LA. Biologi. 8th ed Jilid 1. Jakarta : Erlangga. 2010)

14

2.4 Kerangka Teori

Gambar 2.5 Kerangka Teori 1,8,9

15

2.5 Kerangka Konsep

Gambar 2.5 Kerangka Konsep

16

2.6 Definisi Operasional

No Varabel Definisi Alat Ukur Skala Skor

1 SNP 826198

Variasi

Sekuensing

DNA pada gen

TMPRSS6

Light Cycler

480® Roche

04 909 631

001

Nominal

1. Wildtype

2.Mutant

3.Heterozygote

2 Kadar

Hemoglobin

Kadar

metaloprotein

dalam sel

darah merah

yang

berfungsi

sebagai

pengangkut

oksigen.

Dengan

satuan g/dL

Strip dan

alat cek

kadar Hb

Easy Touch®

GCHB meter

Ordinal

Laki - laki :

1. Anemia : < 13

2. Nonanemia :

>13,1

Perempuan :

1. Anemia : <12

2. Nonanemia :

>12,1

17

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Metode Penelitian

Metode yang digunakan peneliti adalah metode experimental. Penelitian ini

dilakukan dengan merancang primer dan gBlock spesifik ss8296198. Rancangan

primer dan gBlock tersebut digunakan untuk mendeteksi dan melakukan skrining

ss8296198 dengan teknik High Resolution Melting pada mahasiswa jurusan PSPD

Universitas UIN Syarif Hidayatullah. Tahapannya berupa :

- Merancang primer dan gBlock yang spesifik untuk mendeteksi mutasi pada gen

TMPRSS6 SNP ss8296198.

- Mengaplikasikan metode High Resolution Melting untuk mendeteksi mendeteksi

mutasi pada gen TMPRSS6 SNP ss8296198.

- Melakukan skrining ss8296198 pada mahasiswa jurusan PSPD Universitas UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta menggunakan metode High Resolution Melting untuk

mendeteksi mendeteksi mutasi pada gen TMPRSS6 SNP ss8296198.

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Mei 2015 sampai Agustus 2015. Penelitian

dilaksanakan di Laboratorium Riset, Biokimia, dan Biologi Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan, Universitas UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.3 Populasi dan Sampel

3.3.1 Populasi Target

Populasi target adalah responden laki – laki dan perempuan mahasiswa FKIK UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta.

18

3.3.2 Populasi Terjangkau

Populasi terjangkau penelitian ini adalah responden laki – laki dan perempuan

mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter Angkatan 2012-2014 UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

3.3.3 Perkiraan Besar Sampel

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel DNA yang diperoleh

dari 300 mahasiswa Jurusan PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Kontrol

digunakan dengan menggunakan sampel DNA SS8296198. Dalam penentuan jumlah

sampel, peneliti menggunakan perhitungan Slovin dengan alasan total jumlah

mahasiswa PSPD dari 2012-2014 kurang dari 500 orang. Rumus perhitungan yang

dipakai adalah:

Keterangan:

n = Besarnya sampel

N = Jumlah sampel

e = Batas toleransi kesalahan 10 % (0.1)

Maka ditemukan:

n = 300/(1+300x0.12)

= 75 Orang

19

3.3.4 Kriteria Pemilihan Sampel

Kriteria pemilihan dalam penelitian ini terdiri dari kriteria inklusi dan ekslusi.

Kriteria inklusi adalah mahasiswa aktif PSPD UIN Jakarta, laki - laki atau

perempuan. Untuk kriteria eksklusi tidak dibatasi karena peneliti ingin melihat hasil

skrining seluruh sampel dan melihat apakah terdapat gen abnormal atau tidak. Dan

mahasiswa yang menolak sebagai responden.

3.3.5 Teknik Pengambilan Sampel

Sampel yang diambil berdasarkan Simple Random Sampling dimana sampel

dipilih secara acak dari jumlah yang telah ditentukan. Subjek yang terlibat terlebih

dahulu menyatakan kesediaannya untuk menjadi subjek penelitian dengan

menandatangani lembar informed consent. Selanjutnya subjek yang bersedia mengisi

dan menandatangani informed consent secara sukarela memberikan 3-5 mL darahnya

untuk dilakukan pemeriksaan skrining genetik. Sampel darah dimasukan ke tabung

EDTA dan diberi nomor, selanjutnya disimpan dalam cold room untuk dilakukan

isolasi DNA, kemudian dilakukan PCR-High Resolution Melting. Pengambilan

sampel ini telah mendapat persetujuan etik dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan,

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4 Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdapat dalam tabel dibawah

ini:

20

Tabel 3.1 Alat dan Bahan

Alat Bahan

Pengambilan sampel (darah)

Spuit 3 cc

Torniquet

Tabung berisi EDTA

Sarung Tangan

Kapas alkohol

EDTA dalam tabung

Isolasi Genom DNA dari darah

Tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml steril,

Penangas air (Water bath) AS ONE TRW-

42TP 80 high temperature version,pipet

mikro BIOHIT berbagai ukuran,vortex

DADD,2 mL collection tube,Alat

sentrifugasi eppendorf ,mikrotip Biologix

ukuran 10µL, 200µL dan 1000µL,

incubator EYELA NDO-400,biomedical

freezer SANYO

RBC Lysis Buffer

GB Buffer

Elution Buffer

Ethanol Absolut

W1 Buffer

Wash Buffer

Pengukuran konsentrasi hasil isolasi DNA

Maestro Nano Drops

Elektroforesis genom DNA

Elektroforesis ATTO My Power II 300 AE-

8135,Timbangan analtik AdventureTM, gel

doc system, penggaris sumur,

Agarosa,ethidium

bromida,loading dye, plastic wrap

21

3.5 Cara Kerja Penelitian

3.5.1 Desain Primer ss8296198

Langkah kerja desain yang spesifik untuk primer ss826198 adalah sebagai berikut:

1. Penentuan area mutasi dilakukan dengan data yang diperoleh dari situs

Ensembl

2. Perancangan primer spesifik ss8296198 dilakukan sendiri secara manual

oleh peneliti

3. Perancangan primer yang spesifik untuk ss8296198 dilakukan sesuai

dengan syarat primer yang baik

4. Hasil rancangan primer selanjutnya dianalisis dengan menggunakan

program Primer Blast pada situs NCBI

5. Hasil rancangan primer dimasukan pada program Primer – Blast di situs

NCBI untuk membuktkan bahwa primer hasil rancangan merupakan primer

yang baik dan sekaligus untuk mengetahui Tm primer serta panjang produk

PCR atau area hasil pemotongan oleh primer tersebut

Langkah selanjutntya setelah mendapatkan rancangan primer yang dilakukan

adalah melakukan optimasi menggunakan PCR. Optimasi PCR sendiri disini

bertujuan untuk memperoleh reaksi, kondisi, dan hasil yang optimal dalam

melakukan proses PCR. Proses optimasi PCR dilakukan dengan cara

memvariasikan kondisi yang digunakan pada proses PCR meliputi suhu dan waktu

fase annealing serta jumlah dan konsentrasi bahan – bahan yang digunakan dalam

proses PCR.

3.5.2 Desain High Resolution Melting ss8296198

Langkah kerja desain High Resolution Melting untuk mendeteksi ss8296198

adalah sebagai berikut :

1. Penentuan area mutasi yang diperoleh dari situs Ensembl.

2. Perancangan spesifik SS8296198 dilakukan sendiri secara manual oleh

peneliti.

22

3. Hasil perancangan dianalisis dengan menggunakan program software

Roche HRM desain

4. Pada hasil desain diuji terhadap sampel DNA kontrol positif ss8296198

3.5.3 Isolasi DNA

Setelah sampel darah diambil, dilakukan isolasi DNA untuk mendapatkan genom

DNA dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) Geneaid

dengan langkah kerja sebagai berikut.

Tabel 3.2 Isolasi DNA

Persiapan

Sampel Fresh Blood

1. Darah sebanyak 300 μL dimasukan kedalam 1,5 ml tabung

mikrosentrifugasi

2. Kemudian Tambahkan 900 μL RBC Lysis Buffer dan dikocok.

3. Tabung diinkubasi 10 menit dalam suhu ruangan

4. Tabung disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 3000 rpm

selama 5 menit, supernatant dibuang.

5. Tambahkan 100 μL RBC Lysis Buffer untuk meresuspensi endapan

leukosit, kocok, kemudian diproses dengan cell lysis

Langkah

1

Cell

Lysis

6. Tambahkan 200 μL GB Buffer kedalam tabung tadi

7. Inkubasi tabung pada suhu 60o C selama 10 menit untuk

memastikan sampel terlisiskan.

8. Pada saat yang sama tabung lain berisi 50 μL Elution Buffer untuk

tiap satu sampel disiapkan, kemudian diinkubasi pada suhu 60o C.

9. Setelah sampel tabung diinkubasi, tabung didinginkan di suhu

ruangan.

Langkah

2

DNA

binding

10. Tambahkan 200 μL ethanol absolute ke dalam tabung, kemudian

secara cepat dikocok selama 10 detik.

11. Siapkan GD Column pada 2 mL Collection Tube.

12. Pindahkan campuran ethanol tadi kedalam GD Column

13. Sentrifugasi tabung pada 14.000 – 16.000 x g selama 5 menit

14. Buang cairan pada 2 ml Collection Tube

15. Tempatkan kembali GD Column pada 2 ml Collection Tube

23

Langkah

3

Wash

16. Tambahkan 400 μL W1 Buffer kedalam GD Column kemudian

disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit

17. Buang cairan pada 2 ml Collection Tube

18. GD Column ditempatkan kembali pada 2 ml Collection Tube

19. Tambahkan 600 μl Wash Buffer kedalam GD Column

20. Sentrifugasi tabung pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit

21. Buang cairan pada 2 ml Collection Tube

22. Tempatkan kembali GD Column pada 2 ml Collection Tube

23. Sentrifugasi kembali tabung selama 1 menit untuk mengeringkan

matriks kolum

Langkah

4

DNA

Elution

Volume standar Elution Buffer untuk 1 sampel adalah 100 μl. Jika

sampel yang digunakan dalam volume sedikit, volume elusi sekitar

30 – 50 μl dapat meningkatkan konsentrasi DNA.

24. Pindahkan GD Column yang sudah kering ke dalam tabung

mikrosentrifugasi yang steril

25. Tambahkan 50 μl Elution Buffer yang sudah diinkubasi kedalam

matriks kolum, biarkan selama 3 menit

26. Sentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit untuk

mendapatkan hasil

Genom DNA yang sudah diisolasi dilakukan pengecekan dengan cara

elektroforesis dan dibaca menggunakan alat Gel doc system.

Hasil isolasi DNA dinilai jumlah konsentrasi DNA nya dengan menggunakan

alat Maestro Nano Drops. Sampel diambil sebanyak 1 μL, kemudian diletakkan di

lensa nano, lalu tekan enter.

3.5.4 Tata Kerja PCR – HRM

Langkah memulai genotyping analisa:

1. Primer Mix

1. Buat pengenceran primerForward dan Reverse induk dengan konsentrasi

akhir 50 µM

2. Gabungkan primer induk yang telah diencerkan dengan menambahkan

dH20 hingga mencapai konsentrasi 5 µM (Primer Mix)

2. Template DNA

24

1. Ukur Konsentrasi DNA template

2. Lakukan 2x pengenceran DNA template

3. Lakukan Prosedur HRM

Tabel 3.3 Prosedur HRM

Bahan – bahan 25 µl rxn

HRM Kit 7,5 µl

MgCl2 1,2 µl

Primer (mix) 0,75 µl

dH2O 1,8 µl

Template DNA 3,75 µl

25

3.5.5 Alur Kerja Penelitian

Gambar 3,1 Alur Kerja Penelitian

Desain primer

Optimasi produk PCR

meliputi formulasi dan

program PCR

Uji coba deteksi gen

SS826198 sampel

kontrol positif

dengan teknik PCR-

HRM

Desain HRM

Sampel darah

Isolasi DNA

dengan metode

Geneaid

Analisis DNA

genom dengan

teknik elektroforesis

Pita DNA diamati

menggunakan alat

gel doc sistem

26

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Anemia

2.1.1 Epidemiologi

Anemia defisisensi besi merupakan penyakit paling umum dan penyakit yang

berhubungan dengan nutrisi yang paling luas sebarannya di dunia. Dimana penyakit

ini menurut angka kejadiannya banyak dialami pada anak – anak dan perempuan

pada negara berkembang. Diketahui sekitar 2 juta orang mengalami anemia dan

Gambar 4.1 Karakteristik Jenis Kelamin Responden

Tabel 4.1 Karakteristik Jenis Kelamin Responden

Frekuensi Persentase (%)

Jenis Kelamin Laki – laki 38 37,3

Perempuan 64 62,7

Total 102 100

37%

63%

Jenis Kelamin

Laki - laki Perempuan

27

Berdasarkan tabel 4.1 dari 102 sampel diketahui bahwa laki – laki berjumlah 38

orang dan perempuan berjumlah 64 orang dengan persentasi perempuan sebesar 63,75

% dan laki – laki sebesar 37,25 %.

4.1.1.2 Usia

Gambar 4.2 Karakteristik Usia Responden

Berdasarkan gambar 4.2 diketahui dari 102 sampel variasi usia responden dalam

penelitian terdiri dari usia 17 tahun sebanyak 2 orang, usia 18 tahun sebanyak 16 orang,

usia 19 tahun sebanyak 29, usia 20 tahun sebanyak 30 dengan persentase 29,4 % , usia 21

tahun sebanyak 22 orang, usia 23 tahun sebanyak 3 orang dengan persentase 2,9 %.

Melihat data tersebut dapat disimpulkan bahwa usia responden termuda pada penelitian

ini adalah 17 tahun dan usia tertua yang menjadi responden dalam penelitian ini adalah

23 tahun . Sedangkan jumlah terbanyak berada pada rentang usia 20 tahun.

Mean = 19,65

Std Deviasi = 1,208

N = 102

28

4.1.1.3 Hasil Pengukuran IMT

Berdasarkan gambar 4.3 diketahui bahwa sebaran sampel apabila dikelompokan

berdasarkan IMT menurut kriteria asia pasifik terbanyak berada pada berat badan normal

sebesar 62 orang dengan persentase 60,78 %. Sedangkan rerata IMT sebesar 2,24 ± 0,925

Gambar 4.3 Karakteristik IMT responden

4.1.1.4 Hasil pengukuran Kadar Hemoglobin

Berdasarkan hasil statistik deskriptif diketahui bahwa rentang kadar Hemoglobin

terendah pada responden didapatkan sebesar 8 sedangkan tertinggi didapatkan 18,5

Sedangkan rerata kadar Hemoglobin sebesar 11,526 dengan standar deviasi 2,022.

61%16%

9%

12%2%

Index Massa Tubuh

Normal Underweight Overweight Obese 1 Obese 2

29

Gambar 4.4. Kadar Hemoglobin Responden

Berdasarkan data diatas didapatkan bahwa persentase responden yang mengalami

anemia sebesar 72,5 %, sedangkan yang normal sebesar 27,5 % Hal ini merujuk kepada

standar yang diberikan oleh WHO yaitu pada laki – laki dikatakan anemia apabila kadar

Hemoglobin < 13 g/dL dan pada perempuan apabila kadar Hemoglobin <12 g/dL.

4.1.1.5 Hasil Isolasi DNA Genom dari Whole Blood

Penelitian ini menggunakan sampel berupa sampel DNA yang diperoleh dari

isolasi sel darah (Whole Blood). Sampel yag digunakan berjumlah 102 orang yang

seluruhnya merupakan mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Isolasi dan purifikasi DNA dilakukan dari sampel darah (Whole Blood) dilakukan

berdasarkan protokol Geneaid. Selanjutnya untuk pengecekannya dilakukan dengan gel

elektroforesis dengan hasil sebagai berikut :

Anemia; 72,5

Normal; 27,5

KADAR HEMOGLOBIN RESPONDEN

30

Gambar 4.5. Dokumentasi hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom DNA sampel

Dilanjutkan dengan pemeriksaan kemurnian dan konsentrasi dari 102 sampel DNA

genom yang dapat dilihat pada tabel berikut

Tabel 4.2. Kemurnian dan Konsentrasi Hasil Isolasi Genom DNA Responden

Kemurnian DNA Konsentrasi

Total 194,21 5530,23

Mean 1,8 50,7

4.1.1.6 Hasil Analisis Kurva Genotip Wildtype, Heterozygote, dan Mutant

Sampel yang telah dilakukan pemeriksaan mutasi gen dengan RT- PCR HRM akan

memberikan gambaran berupa hasil kurva yang berbeda berdasarkan temperatur lelehnya.

Hasil analisis kurva HRM dari genom DNA sampel didapatkan data genotyping sebagai

berikut :

Isolasi Genom yang baik Isolasi Genom yang tidak baik

31

Gambar 4.6 Genotype SNP ss8296198

Berdasarkan gambar 4.6 diketahui bahwa dari 102 sampel, didapatkan persentase alel

Wildtype sebesar 22 orang , Heterozygote sebesar 31 orang , Mutant sebesar 24 orang.

Prevalensi terbanyak pada Heterozygote.

4.1.1.7 Hasil Gambaran Kurva HRM

Gambar 4.7 kurva HRM

0

5

10

15

20

25

30

35

Wildtype Mutant Heterozygote

2224

31

Sebaran Alel

Heterozygote

Homozygote

32

Pada gambaran HRM tampak kurva yang paling kanan merupakan Wildtype , sedangkan

yang kedua merupakan Mutant, dan yang paling kiri adalah Heterozygote

Gambar 4,8 hasil sekuensing ss826198 Untuk wild type

Gambar 4.9 hasil sekuensing ss82916198 untuk heterozygote type no 70

Tanda panah di sekeunsing wildtype menunjukkan area yang berubah pada mutant type

ss8296198. Pada pola heterozygote type, kadang dijumpai ganda heterozygote. Adanya

ganda heterozygote ini, akan menyebabkan perubahan pola kurva HRM heterozygote

pada produk PCR untuk SS8296198.

33

4.1.1.8 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Kadar Hemoglobin

Gambar 4.10 Hubungan Kadar Hemoglobin dengan Jenis Kelamin

Berdasarkan data diatas didapatkan jumlah perempuan yang normal sebesar 10 orang dan

yang menderita anemia sebesar 54 orang .Pada laki – laki jumlah yang normal sebesar

18 orang dan menderita anemia sebesar 20 orang. Ini menunjukkan bahwa jumlah

perempuan yang mengalami anemia lebih tinggi dibandingkan laki – laki. Uji Chi-Square

didapatkan nilai Pearson Chi-Square sebesar 0,001 yang memiliki arti terdapat hubungan

yang signifikan antara jenis kelamin dan kadar hemoglobin.

0 10 20 30 40 50 60 70

Laki - laki

Perempuan

20

54

18

10

Hubungan Jenis Kelamin dengan Kategori Hemoglobin

Anemia Nonanemia

34

4.1.1.9 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotip SS8296198

Gambar 4.11 Menunjukkan Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotip ss8296198.

Hasil dari uji Chi-Square didapatkan hasil perhitungan sebesar 0,248, dengan demikian

dapat disimpulkan tidak terdapat hubungan yang bermakna antara Jenis Kelamin dengan

Kategori Genotip ss8296198.

Wildtype

Mutant

Heterozygote

0

5

10

15

20

25

30

Laki - laki Perempuan

12 12

14

23

12

29

Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotip

Wildtype Mutant Heterozygote

35

4.1.1.10 Hasil Hubungan Genotip ss8296198 dengan Kadar Hemoglobin (Anemia

dan Normal)

Gambar 4.12 Hubungan Genotip ss8296198 dengan Kadar Hemoglobin (Anemia dan

Normal)

Hasil data yang diperoleh kemudian dicari hubungan yang terjadi antara kategori genotip

(Wildtype, Heterozygote, Mutant) dengan Kadar Hemoglobin (Anemia dan Normal).

Kemudian dilakukan pengujian dengan uji Chi-Square sebesar 0,403, dengan begitu

dapat disimpulkan tidak terdapat hubungan yang bermakna antara genotip ss8296198

dengan kadar hemoglobin (Anemia dan Normal). Sedangkan menurut Gichiobi-wainaina

WN et al terdapat adanya hubungan antara ss8296198 terhadap rendahnya kadar

hemoglobin pada suatu populasi. Hal ini dapat terjadi disebabkan terdapat perbedaan

lokasi serta ras dari populasi yang diteliti. 22

0

5

10

15

20

25

30

35

Wildtype Heterozygote Mutant

19

31

24

5

10

13

Hubungan Genotip dengan Kadar Hemoglobin

Anemia Nonanemia

36

4.2 Pembahasan

4.2.1 ss8296198

1

Gambar 4.13 Letak lokasi mutasi gen ss8296198

ss8296198 merupakan SNP yang terletak pada kromosoom 22 pada daerah exon.

Exon sendiri adalah salah satu bagian dari DNA yang memiliki fungsi sebagai

pengkonversi menjadi mRNA yang matang. Prosesnya sendiri disebut sebagai transkripsi

dimana DNA digunakan sebagai template untuk membentuk mRNA. Selanjutnya mRNA

berperan dalam proses transalasi dalam proses sintesis protein lewat tRNA. Dapat diambil

kesimpulan bahwa exon secara tidak langsung berperan dalam sintesis protein sehingga

apabila terdapat gangguan berupa mutasi pada salah satu exon, maka akan terjadi

gangguan dalam proses sintesis protein pada DNA yang bersangkutan. 2,3

37

Gambar 4.14 Lokasi Mutasi IRIDA4 (Sumber : Benyamin B, Ferreira MA, Willemsen G et al. Common Variants in TMPRSS6 are Associated

with Iron Status and Erythrocyte Volume. Nature Genetics. November 2009)

4.2.2 Desain Primer ss8296198

Desain primer pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan primer – blast

pada situs NCBI. Sedangkan sequence serta urutan basa diperoleh dari Ensembl.

Sequence tersebut digunakan sebagai acuan dalam merancang primer untuk mendeteksi

ss8296198.

Pada penelitian ini, desain primer dilakukan secara manual oleh peneliti dengan

tujuan untuk merancang primer yang lebih spesifik untuk mendeteksi SNP ss826198

38

pada gen TMPRSS6. Primer yang dihasilkan, haruslah dapat menempel dan memotong

area target dan tidak menempel pada area lain

Panjang primer sendiri merupakan salah satu faktor yang berpengaruh dalam PCR

karena panjang primer dapat dapat menentukan suhu dan waktu fase annealing yang

optimal.5

4.2.3 Hasil desain Primer

1. gen TMPRSS6 ss8296198 A/G

Area yang berubah:

(https://www.lifetechnologies.com/order/genome-

database/browse/genotyping/keyword/rs855791?ICID=uc-snp-rs855791).

GCGTGGCGTCACCTGGTAGCGATAG[A/G]CCTCGCTGCACAGGTCCTG

TGGGAT

Area sekuensing untuk disain HRM-PCR ss8296198:

GGCAGCATCCTTTCTCCCTCCTCTCTCCCTCCCATGCCCGGGGGAC

TCACCTGACAGGCA TCCTTCTTGC CCTTGCGGTAGCCGGCACAC

AGCATGCGTG GCGTCACCTG GTAGCGATAG (G/A) CCTCGCTGCA

CAGGTCCTGT GGGATCAACT GCACATCCAC TTTCTGCAGA

GCGTTGCTGATGGGGCCTGT CCGTGGTCAA GGGCAGAAGTGAGA

TCTCAG GAGCCTGGAG CCCCTGTTCT

Panjang urutan basa nukleotida: 241 bp

gBlock Homozygote Wildtype sebagai kontrol

39

GGCAGCA TCC TTT CTC CCT CCT CTC T CCCTCCCATGCCCGGGG

GACTCACCTGACAGGCATCCTTCTTGCCCTTGCGGTAGCCGGCACAC

AGCATGCGTGGCGTCACCTGGTAGCGATAG

g

CCTCGCTGCACAGGTCCTGTGGGATCAACTGCACATCCACTTTCTGCA

GAGCGTTGCTGATGGGGCCTGTCCGTGGTCAAGGGCAGAAGTGAG

ATCTCAGGAGCCTGGAG CCCCTGTTCT

gBlock Homozygote Mutant sebagai kontrol

GGCAGCATCCTTTCTCCCTCCTCTCTCCCTCCCATGCCCGGGGGAC

TCACCTGACAGGCATCCTTCTTGCCCTTGCGGTAGCCGGCACACAGC

ATGCGTGGCGTCACCTGGTAGCGATAG

a

CCTCGCTGCACAGGTCCTGTGGGATCAACTGCACATCCACTTTCTGCA

GAGCGTTGCTGATGGGGCCTGTCCGTGGTCAAGGGCAGAAGTGAG

ATCTCAGGAGCCTGGAG CCCCTGTTCT

Urutan primer untuk ss8296198

Forward: TCC TTT CTC CCT CCT CTC T (G/C 0.53; TM 57)

Reverse: TCT CAC TTC TGC CCT TGA C (G/C 0.53; TM 57)

Hasil amplifikasi:

TCCTTTCTCCCTCCTCTCTCCCTCCCATGCCCGGGGGACTCACCTGA

CAGGCATCCTTCTTGCCCTTGCGGTAGCCGGCACACAGCATGCGTGG

CGTCACCTGGTAGCGATAGaCCTCGCTGCACAGGTCCTGTGGGATCA

ACTGCACATCCACTTTCTGCAGAGCGTTGCTGATGGGGCCTGTCCGT

GGTCAAGGGCAGAAGTGAGA

40

Gambar 4.15 Area desain primer untuk ss826198

Panjang produk PCR : 208 bp

Hasil produk PCR yang dihasilkan dari pemotongan primer forward dan primer

reverse adalah sepanjang 208 bp sehingga panjang dari hasil produk tersebut sudah

memenuhi persyaratan sebesar 300 – 2000 basa.6

Gambar 4.16 Optimasi PCR Fase Annealing21

Hasil optimasi PCR menunjukan bahwa suhu fase annealing yang optimal yaitu pada

suhu 62C. Pada suhu tersebut pita DNA produk PCR yang terbentuk hanya terdapat pada

area pemotongan primer yaitu pada 208 bp secara spesifik tanpa terbentuk pita DNA lain.

Hal tersebut membuktikan bahwa proses PCR telah terjadi secara optimal dimana semua

41

komponen bahan – bahan PCR telah bereaksi secara optimal tanpa menghasilkan bahan

sisa reaksi.

4.2.4 Hasil Kurva HRM

Gambar 4.17 Gel Documentation Elektroforesis Agarose dari Isolasi Genom PCR-HRM

Hasil kurva HRM – PCR dengan menggunakan software HRM-Roche menunjukkan

tiga pola grafik. Sesuai dengan nama metodanya, yaitu HRM yang berarti perubahan satu

basa akan menyebabkan perubahan temperatur leleh atau melt temperature setiap

fragmen produk PCR (amplicon). Dengan demikian, kita dapat mengamati pola wildtype,

heterozygote maupun mutant dari suatu produk PCR. Metoda ini sangat sensitif

dibandingkan metoda realtime PCR yang tidak menggunakan probe, karena pada metoda

ini digunakan suatu senyawa fluorescent dye konsentrasi tinggi yang akan berikatan

hanya pada DNA untai ganda. Ini berarti fluorescent dye hanya berikatan pada amplicon

tidak pada DNA untai tunggal. Saat DNA membentuk untai ganda dan dye berikatan pada

untai tersebut, maka akan dihasilkan sinyal fluorescence yang tinggi. Namun saat suhu

ditingkatkan secara perlahan, maka untai ganda tersebut secara perlahan akan terurai

membentuk untai tunggal, dan sinyal fluorescence turun. Dengan demikian, setiap

amplicon wildtype, heterozygote dan mutant akan dapat terbaca. Hal ini dapat dilihat pada

gambar 4.7 – 4.9, dimana perubahan basa nukelotida dalam satu amplikon DNA akan

mengubah pola grafik. Berdasarkan penelitian ini, menunjukkan bahwa HRM-PCR

memiliki sensitivitas yang baik namun tidak spesifik hanya pada satu area mutasi yang

Dimer 208 bp

M s1 s2 s3 s4 s5

M: DNA Ladder

S : Sampel

42

kita amati. Penggunaan metoda HRM-PCR sebaiknya diikuti dengan melakukan

sekuensing DNA7

Gambar 4.18 Contoh Kurva HRM

Pada gambar di atas memperlihatkan pada suhu kurang dari 770C, pancaran sinyal

fluoro sangat tinggi sedangkan pada suhu lebih dari 820C, pancaran melemah. Hal ini

diakibatkan, pada suhu 77C semua amplikon dalam bentuk untai ganda, dan perlahan

untai ganda terlepas dengan peningkatan suhu. Pancaran sinyal fluoro heterozygote GA

mulai melemah pada suhu sekitar 78C, sedangkan mutan AA pada suhu sekitar 78,5 dan

wildtype GG pada suhu 79C. Dengan demikian kita dapat membuat pengelompokan tipe

genotip masing-masing sampel. Walaupun teknik HRM-PCR dapat digunakan untuk

deteksi mutasi, polimorfisme dan epigenetik, namun jika ada mutasi lain atau mutasi yang

dituju bukan yang diinginkan dalam satu amplikon yang sama, maka pola grafik akan

berubah. Untuk itu diperlukan pemeriksaan lanjutan yaitu sekuensing DNA amplikon.

43

4.2.5 Data Statistik

Hasil uji bivariat antara jenis kelamin dengan kadar hemoglobin menggunakan uji Chi

Square, didapatkan nilai p-value 0,01 dengan standar nilai p-value ≤0,05 sehingga dapat

disimpulkan terdapat hubungan antara jenis kelamin dengan kadar hemoglobin.

Sedangkan hasil uji bivariat antara jenis kelamin dengan Genotip SS826198

menggunakan uji Chi Square, didapatkan nilai p-value sebesar 0,873 dengan begitu nilai

p-value ≥0,05 sehingga dapat disimpulkan tidak terdapat hubungan antara Jenis kelamin

dengan Genotip SS826198.

4.3 Keterbatasan Penelitian

1. Tidak mencari data mengenai status menstruasi responden

2. Tidak mencari data mengenai asupan zat besi responden

44

BAB V

Simpulan dan Saran

3.6 Simpulan

Berdasarkan penelitian yang sudah dilakukan menunjukan bahwa mutasi

gen pada Gen TMPRSS6 SNP ss826198 memiliki hubungan dengan jenis

kelamin hal ini dibuktikan dengan cenderung lebih banyaknya responden yang

perempuan yang mengalami mutasi pada Gen TMPRSS6 SNP ss826198 yang

diikuti dengan kadar hemoglobin yang rendah. Sedangkan hubungan antara

mutasi gen pada Gen TMPRSS6 SNP SS826198 tidak memiliki hubungan

dengan rendahnya kadar hemoglobin. Hal ini dibuktikan dengan hasil uji statistik

yang membuktikan bahwa tidak semua pasien yang mengalami mutasi pada Gen

TMPRSS6 SNP SS826198 memiliki kadar hemoglobin yang rendah, begitu pula

sebaliknya kadar hemoglobin yang rendah tidak selalu menunjukan mutasi pada

Gen TMPRSS6 SNP ss826198.

3.7 Saran

Pada penelitian selanjutnya perlu dilakukan pengujian kadar hemoglobin

yang lebih spesifik karena pada penelitian kali ini tidak menggunakan

pemeriksaan darah rutin lengkap seperti di laboratorium yang disebabkan oleh

keterbatasan biaya.

45

Daftar Pustaka

1. Sudoyo AW, Setiyohadi B, Alwi A et al. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam 5 th ed.

Jilid II. Jakarta : Interna Publishing; 2009. p : 1130

2. World Health Organization [Internet]; 2015 [cited 2015 September 25]. Available

from: http://www.who.int/nutrition/topics/ida/en/

3. Riskesdas 2013. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian

Kesehatan RI. 2013

4. Ridwanuloh AM. Analisis mutasi gen EGFR dan kras berbasis PCR-HRM (High

Resolution Melting) dan RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisme)

terhadap cairan pleura pasien kanker paru yang disimpan pada kertas saring.

Bogor : Repository IPB; 2013

5. Prevalence Iron Deficiency [Internet]; 2015 [cited 2015 September 25].

http://www.aafp.org/afp/2007/0301/p671.html

6. Longo DL. Harrison’s Hematology and Oncology. New York : Mc Graw- Hill;

2010. p: 73

7. Mascher AL. Histologi Dasar Junqueira Teks dan Atlas 12th ed. Jakarta : EGC p:

213 - 215

8. Katzung BG. Farmakologi Dasar & Klinik Ed 10. Jakarta : EGC; 2007 p:539 -

541

9. Goncalves L, Nobre JG, Afonso C et al. The Role of TMPRSS6 gene variants in

different types of Iron Deficiency Anaemia from The Rare Severe Hereditary

IRIDA to The Common Mild Acquired IDA. 2014

10. Lubis H. Anemia Defisiensi Besi : Manifestasi dan Perawatannya. Usu

Repository. 2002

11. Wahyuni AS. Anemia Defisiensi Pada Balita. Repository Usu . 2004

12. Mahan LK, Stump SE. Krause’s Food & Nutrition 12th ed . 2008 . Hal 817

13. Campbell NA, Reece JB, Urry LA. Biologi. 8th ed Jilid 1. Jakarta : Erlangga.

2010

46

14. Exon Function [Internet]; 2015 [cited 2015 September 25].

www.dartmouth.edu/~cbbc/courses/bio4/bio4-lectures/EukGenes.html

15. Exon Function [Internet]; 2015 [cited 2015 September 25].

www.nature.com/.../translation-dna-to-mrna-to-protein-393

16. Benyamin B, Ferreira MA, Willemsen G et al. Common Variants in TMPRSS6

are Associated with Iron Status and Erythrocyte Volume. Nature Genetics.

November 2009.

17. Design Primer [Internet]; 2015 [cited 2015 September 25].

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/view/?q=rs855791&filters=source:dbsnp

&assm=GCF_000001405.28

18. Kalender, Ruslan,David Lee, Alan H. Schulman. 2011. Java Web Tools for PCR

, in Silico PCR, and Oligonucleotide Assembly and Analysis. Genomics,98 : 137

– 144

19. Olsen, Jayme. 2008. Introduction to “primer Design” for PCR. Weinem : Wiley-

VCH Verlag GmbH & Co. KgaA

20. S Taylor et al. A Practical Guide To High Resolution Melt Analysis Genotyping.

BioRad Tech Note 6004. 2010

21. Tm Calculator [Internet]; 2015 [cited 2015 September 25].

http://tmcalculator.neb.com/#!/

22. Gichiobi-wainaina WN . Towers WG . Swinkels DW, et al . Inter-ethnic

differences in genetic variants within the transmembrane protease, serine 6

(TMPRSS6) gene associated with iron status indicators: a systematic review with

meta-analyses. Genes Nutr. November 2014

Lampiran 1. Lembar Permohonan Ethical Approval Penelitian

Permohonan Ethical Approval Penelitian

No. :

Hal : Permohonan Ethical Approval Penelitian

Kepada:

Yth. Ketua Komite Etik Penelitian

FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Di Ciputat

Dengan Hormat,

Bersama ini kami mohon bantuan kepada komite etik penelitian kedokteran FKIK UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta dapat memberikan keterangan Lolos Kaji Etik (Ethical

Approval) untuk penelitian kami yang berjudul “Skrining Gen TMPRSS6 pada Alel

SS8296198 pada Mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012

– 2014 Menggunakan Teknik High Resolution Melting”.

Terlampir kami sampaikan (masing-masing 4 kopi),

1. Proposal Penelitian

2. Formulir informed consent

Dengan permohonan kami, atas bantuan dari Ibu/Bapak kami mengucapkan banyak

terimakasih.

Hormat saya,

Peneliti, Pembimbing,

Adamilzary Fikry Abdulmannan Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD

NIM 1112103000001 NIP 19721103 200604 1 001

Mengetahui,

Ketua Program Studi Pendidikan Dokter

dr. Achmad Zaki,M.Epd,Sp.OT

NIP. 19780507 200501 1 005

Lampiran 2. Lembar Persetujuan Responden

SURAT PERSETUJUAN PENELITIAN

Saat ini saya Adamilzary Fikry Abdulmannan mahasiswa PSPD UIN Jakarta angkatan

2012 sedang melakukan penelitian dengan judul Skrining Gen TMPRSS6 pada Alel

SS8296198 pada Mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012

– 2014 Menggunakan Teknik High Resolution Melting. Pada penelitian ini saya akan

melakukan pemeriksaan dengan pengambilan darah partisipan sebanyak satu kali yaitu

3-5 cc. Darah tersebut akan dibawa ke laboratorium untuk dilakukan skrining.

Pengambilan darah dilakukan oleh analis yang sudah berpengalaman. Untuk itu, dengan

hormat saya memohon kesediaan Anda untuk ikut serta dalam penelitian ini.

Setelah membaca penjelasan diatas, bahwa yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama:

Umur: tahun

Alamat:

Dengan sukarela diikutsertakan dalam penelitian ini. Segala hal yang menyangkut

kerahasiaan tentang partisipan akan terjaga dengan baik oleh peneliti.

Jakarta, Mei 2015

Mengetahui,

(________________) ( Adamilzary Fikry Abdulmannan )

Mahasiswa Peneliti

Lampiran 3. Alat dan Bahan Penelitian

Gambar 7.3.1. Elektroforesis Gambar 7.3.2. Centrifuge Eppendorf

Gambar 7.3.3. Alat Inkubator Gambar 7.3.4. Micropipet & Tip

Gambar 7.3.5. Cold Room dan Freezer

Gambar 7.3.6. vortex Gambar 7.3.7. Instrument LightCycler® 480 II

Roche

Gambar 7.3.8. DNA sampel Gambar 7.3.9. Multiwall Plate Light Cycler®

Roche

Gambar 7.4. bahan isolasi DNA Geneaid (Elution buffer, GB buffer, Wash buffer, W1

buffer, RBC Lysis buffer dan Ethanol absolute 70%).

Gambar 7.4.1. Primer TMPRSS6 Gambar 7.4.2. gBlock TMPRSS6

Gambar 7.4.3 Mix HRM

Lampiran 4. Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom DNA

sampel

Gambar 7.4.3. Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom DNA

sampel

Lampiran 5. Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel

Tabel 6.1 Hasil Pengukuran Kemurnian dan Konsentrasi DNA genom Responden

No No sampel A260/A230 Kemurnian (A

260/A 280)

Konsentrasi

(ng/µl)

1 1 1.963 2.053 25.77

2 2 1.802 1.968 108.99

3 3 1.97 2.094 17.4

4 4 2.523 2.007 113.35

5 5 1.395 1.438 16.86

6 6 1.881 1.881 55.25

7 8 -9.226 1.858 28.51

8 9 -10.04 1.835 21.32

9 10 3.208 1.935 20.64

10 11 -1.66 1.986 6.27

11 12 -0.921 2.089 9.02

12 13 2.019 1.849 46.13

13 15 -16.772 1.775 5.37

14 16 -14.587 2.042 14.42

15 17 -1.423 1.72 15.32

16 18 -2.028 1.912 6.01

17 19 -0.4 1.409 24.79

18 20 9.182 1.973 11.75

19 21 -847.665 1.898 10

20 22 -71.179 1.845 36.13

21 23 4.325 1.964 41.38

22 24 4.438 1.887 47.55

23 25 -1.081 1.768 54.87

24 26 -2.704 1.684 11.87

25 27 -0.782 2.235 22.06

26 28 2.31 1.827 9.75

27 29 10.382 1.329 49.08

28 30 5.609 2.081 50.46

29 31 0.881 1.505 40.05

30 32 1.684 1.395 113.23

31 33 9.122 1.406 73.01

32 34 2.971 1.805 41.78

33 35 9.734 1.734 186.52

34 36 1.771 2.04 54.05

35 37 1.933 1.56 106.42

36 38 3.387 1.462 81.35

37 39 10.468 1.281 35.73

38 40 6.385 1.98 50.63

39 41 1.707 1.98 59.49

40 42 -2.042 1.403 74.07

41 43 7.681 1.78 17.36

42 44 2.129 2.022 55.04

43 45 -2.418 1.571 108.1

44 46 -3.51 1.679 17.81

45 47 -6.562 1.641 20.7

46 48 1.804 2.1 32.42

47 49 1.157 1.503 65.18

48 50 4.532 1.339 56.06

49 52 -2.105 1.934 62.66

50 53 3.131 1.972 15.1

51 58 3.554 1.815 72.22

52 59 2.019 1.725 48.24

53 60 3.371 1.464 64.24

54 61 -0.765 2.054 96.98

55 62 3.81 1.161 6.71

56 63 6.324 1.282 2.41

57 64 3.145 1.289 3.77

58 65 4.118 2.331 5.88

59 66 5.251 1.102 77.03

60 67 4.474 2.102 11

61 68 2.248 1.766 89.14

62 69 5.05 1.724 47.27

63 70 -3.076 1.642 50.4

64 71 10.417 1.838 63.03

65 72 -186.279 1.72 51.05

66 73 4.2 1.835 60.72

67 74 -33.861 1.439 67.78

68 75 -3.872 1.869 54.73

69 51 10.173 1.775 20.35

70 76 7.513 1.671 42.62

71 77 39.492 1.804 37.87

72 78 5.564 1.709 49.61

73 79 4.446 1.806 34.16

74 80 -0.765 1.92 23.64

75 81 2.899 1.676 40.8

76 82 3.448 1.571 43.01

77 83 1.96 1.459 34.27

78 84 1.446 1.382 49.4

79 85 1.892 1.732 46.86

80 86 23.765 1.733 60.37

81 114 12.113 2.108 101.16

82 115 3.557 1.73 262.43

83 116 1.591 1.808 82.2

84 117 1.613 1.44 59.1

85 118 5.783 2.136 45.56

86 119 2.078 2.092 43.72

87 120 2.177 1.958 49.6

88 121 1.313 1.265 190.37

89 122 4.829 1.428 80.95

90 123 3.02 1.891 57.47

91 124 3.885 1.652 69.51

92 125 1.681 1.901 59.5

93 126 2.296 1.778 98.96

94 127 37.568 2.055 47.14

95 128 2.899 2.077 115.31

96 129 2.186 2.152 84.84

97 130 4.521 1.622 42.08

98 131 -1.311 1.906 52.11

99 132 -4.868 2.038 35.36

100 133 -46.279 1.79 136.37

101 134 3.278 1.893 55.83

102 135 -0.267 1.944 12.53

Lampiran 6. Hasil Uji Statistik

Jenis Kelamin

Frequency Percent Valid Percent Cumulative

Percent

Valid

Laki - Laki 38 37,3 37,3 37,3

Perempuan 64 62,7 62,7 100,0

Total 102 100,0 100,0

Karakteristik Umur

N Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Umur 102 17 23 19,65 1,208

Valid N

(listwise) 102

Rentang Umur

Frequency Percent Valid Percent Cumulative

Percent

Valid

17 2 2,0 2,0 2,0

18 16 15,7 15,7 17,6

19 29 28,4 28,4 46,1

20 30 29,4 29,4 75,5

21 22 21,6 21,6 97,1

23 3 2,9 2,9 100,0

Total 102 100,0 100,0

Statistics

IMT

N Valid 102

Missing 0

Mean 2,24

Std. Deviation ,925

Sebaran IMT

Frequency Percent Valid Percent Cumulative

Percent

Valid Underweight 16 15,7 15,7 15,7

Normal 62 60,8 60,8 76,5

Overweight 10 9,8 9,8 86,3

Obese I 12 11,8 11,8 98,0

Obese II 2 2,0 2,0 100,0

Total 102 100,0 100,0

Karakteristik Hb

N Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Hb 102 8,0 18,5 11,526 2,0222

Valid N (listwise) 102

Kategori Hb

Frequency Percent Valid Percent Cumulative

Percent

Valid

Anemia 74 72,5 72,5 72,5

Nonanem

ia 28 27,5 27,5 100,0

Total 102 100,0 100,0

Hubungan Jenis Kelamin dengan Hemoglobin

Hemoglobin Total

Anemia Nonane

mia

Jenis Kelamin

Laki – Laki

Count 20 18 38

Expected

Count 27,6 10,4 38,0

Perempuan

Count 54 10 64

Expected

Count 46,4 17,6 64,0

Total Count 74 28 102

Expected

Count 74,0 28,0 102,0

Uji Chi Square

Value df Asymp. Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(2-sided)

Exact Sig.

(1-sided)

Pearson Chi-Square 12,064a 1 ,001

Continuity

Correctionb 10,522 1 ,001

Likelihood Ratio 11,840 1 ,001

Fisher's Exact Test ,001 ,001

Linear-by-Linear

Association 11,945 1 ,001

N of Valid Cases 102

a. 0 cells (0,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is

10,43.

b. Computed only for a 2x2 table

Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotip ss 826198

gblockAG Total

Wildty

pe

Mutant Heteroz

ygote

Jenis Kelamin

Laki -

Laki

Count 9 2 27 38

Expected

Count 8,2 1,5 28,3 38,0

Perempua

n

Count 13 2 49 64

Expected

Count 13,8 2,5 47,7 64,0

Total

Count 22 4 76 102

Expected

Count 22,0 4,0 76,0 102,0

Chi-Square Tests

Value df Asymp. Sig. (2-

sided)

Pearson Chi-Square 2,792a 2 ,248

Likelihood Ratio 2,776 2 ,250

Linear-by-Linear Association ,577 1 ,447

N of Valid Cases 102

a. 0 cells (0,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count

is 8,94.

Hubungan Hemoglobin dengan Genotip ss826198

gblockAG Total

WIldtype Mutant Heterozy

gote

Hb

Anemia

Count 15 3 56 74

Expected

Count 16,0 2,9 55,1 74,0

Nonane

mia

Count 7 1 20 28

Expected

Count 6,0 1,1 20,9 28,0

Total

Count 22 4 76 102

Expected

Count 22,0 4,0 76,0 102,0

Chi-Square Tests

Value df Asymp. Sig. (2-

sided)

Pearson Chi-Square 1,818a 2 ,403

Likelihood Ratio 1,799 2 ,407

Linear-by-Linear Association 1,645 1 ,200

N of Valid Cases 102

a. 0 cells (0,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count

is 6,59.

Lampiran 7. Curriculum Vitae Peneliti

CURICULUM VITAE

Nama : Adamilzary Fikry Abdulmannan

Panggilan : Fikry

Jenis Kelamin : Laki-laki

Tempat, Tanggal Lahir : Bandung,11 Januari 1995

Usia : 20 Tahun

Golongan Darah : B

Mobile : 085813620311

Agama : Islam

E-mail : adamilzaryfikryy@gmail.com

Alamat : Jln Tirta Nirwana Raya Cluster Tirta Nirwana No. 35

Bogor

Pendidikan

a. Elementary School : SDIT Ummul Quro Bogor

b. Yunior High School : SMPIT Insan Kamil Bogor

c. Senior High School : SMA Negeri 5 Bogor

d. University : UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Pengalaman Organisasi :

Anggota OSIS SMAN5 Bogor

Anggota Rohis Ithri SMAN5 Bogor

Ketua Organisasi MERCY (Medical Research Of Syahid)

Anggota Tim Medis USMR UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Anggota BEMPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Penghargaan :

Juara 1 Lomba Azan SDIT Ummul Quro

Juara 3 Lomba Nasyid se-jabobeka di SMAN 1 Bogor

Juara 1 lomba TBM FK se-Indonesia dalam lomba Meridian Cup

10 Finalis LKTI Muhammadiyah Jakarta Scientific Competition tingkat Nasional 2013

Delegasi PSPD UIN Jakarta dalam Olimpiade SPORA Cabang Jantung di FK UNSRI

Delegasi PSPD UIN Jakarta dalam Indonesian Medical Olympiad (IMO) Cabang

Cardiorespi di Padang 2014

Karya Tulis :

Potensi Z-din dalam Arachis Hipogaea L sebagai inhibitor Reseptor P2X7 untuk

alternatif Penetalaksanaan Hepatitis C

Carica Papaya Leaves, Psidium Guava Leaves Sebagai Terapi Tambahan dalam

Penanganan Penyakit Demam Berdarah Dengue