molekul kloning, urutan karakterisasi, deteksi snp, dan jaringan analisis ekspresi gen bebek fmo3

DOI 10.1007/s11010-013-1636-4Molekul kloning, urutan karakterisasi, Deteksi SNP, dan jaringan analisis ekspresi gen bebek FMO3

Peng Wang antara Zheng Lujiang Qu Ling Lian Guiyun Xu Ning YangMenerima: 10 Oktober 2012/diterima: 27 Maret 2013/diterbitkan online: 28 April 2013

Springer Science + Business Media New York 2013Abstrak yang mengandung Flavin monooxygenase 3 (FMO3) adalah monooxygenase penting untuk oksigenasi katalitik banyak berbahaya xenobiotik. Mutasi pada gen FMO3 telah diidentifikasi sebagai penyebab trimethylaminuria dalam manusia dan mencurigakan off-rasa di sapi susu dan ayam telur. Dalam studi ini, urutan penuh cDNA Pekin bebek FMO3 gen kloning, sequencing, dan ditandai. Urutan penuh cDNA terdiri dari 1,846 bp dan berisi bingkai terbuka-membaca bp 1,599 pengkodean 532 asam amino. Bebek FMO3 gen bersama struktur sembilan ekson-delapan intron serupa dengan ayam dan manusia. Bebek FMO3 diduga protein urutan menunjukkan identitas tinggi dengan ayam (82%), dan relatif rendah identitas dengan mamalia (61-66%). Kami juga menemukan bahwa gen bebek FMO3 secara dramatis dinyatakan dalam hati, paru-paru dan ginjal dibandingkan dengan bahwa dalam jaringan lainnya di bebek, menunjukkan mungkin peran FMO3 gen bisa bermain dalam tiga jaringan. Oleh bidirectional sequencing, kami juga menemukan satu mutasi omong kosong, 5 nonsynonymous, dan 21 identik mutasi di daerah FMO3 gen dalam keturunan 11 bebek dan beberapa di antaranya yang diperkirakan berpotensi dikaitkan dengan kegiatan FMO3 protein.Kata kunci bebek FMO3 analisis ekspresi Off-rasa amisSingkatanFMOFlavin yang mengandung monooxygenase

TMATrimethylamine

TMAUTrimethylaminuria

QTLLokus sifat kuantitatif

cDNADNA komplemen

RT-PCRTranskripsi terbalik PCR

RRIKatalisis inhibitor

ESTUrutan dinyatakan tag

RASCepat amplifikasi berakhir cDNA

GSPGen-spesifik primer

ORFFrame terbuka-membaca

pITitik isoelektrik

MWBerat molekul

UTRDiterjemahkan daerah

PENGENALANYang mengandung Flavin (FMOs, EC1.14.13.8), monooxygenases FMO1-FMO5, telah ditemukan untuk mengkatalisasi biotransformasi reaksi di pusat-pusat heteroatom nukleofilik seperti belerang, fosfor dan selenium dalam manusia [1, 2]. Mereka memainkan peran kunci dalam detoksifikasi xenobiotik berbahaya,

Peng Wang dan di antara Zheng sama berkontribusi studi ini.P. Wang J. Zheng L. Qu L. Lian G. Xu N. Yang (&) Departemen hewan genetika dan berkembang biak, NasionalLaboratorium teknik untuk Pemuliaan hewan, MOA kunciLaboratorium genetika hewan dan peternakan, College hewanIlmu pengetahuan dan teknologi, China Agricultural University, Beijing 100193, Cina e-mail: [email protected]; [email protected] obat-obatan, pestisida dan senyawa yang berasal dari makanan [3-5]. Selain itu, FMO3 adalah salah satu isoform paling penting dan terkait untuk trimethylaminuria (TMAU) pada manusia dan sifat-sifat dari rasa amis pada spesies lain [68].Gen FMO3 yang telah diidentifikasi dalam berbagai macam spesies burung dan mamalia. Dalam manusia, FMO3 adalah bentuk dominan FMOs hadir dalam hati manusia dewasa dan memainkan peran penting dalam metabolisme trimethylamine bau gratis amina (TMA) [9]. TMA adalah sebuah produk yang berasal dari makanan kimia seperti TMA N-oksida (TMAO), Kolin, Lesitin, mungkin karnitin, dan lain betaines oleh tindakan reduktif bakteri usus [10]. Beberapa kerugian dari fungsi mutasi pada gen FMO3 dapat menghapuskan atau parah mengganggu aktivitas enzim, sehingga mengarah ke rusak N-oksigenasi bau TMA ke non-yg berbau baik N-oksida [6, 11]. Gangguan ini dikenal sebagai TMAU yang telah terbukti diwariskan secara resesif. Hal ini juga disebut fishodour sindrom karena jumlah berlebihan TMA dikeluarkan dari menderita ' napas, keringat, dan urin dan bau busuk ikan [12]. FMO3 gen telah banyak diidentifikasi sebagai kandidat utama gen offflavor yang mencurigakan, yang juga disebabkan oleh akumulasi TMA, di sapi susu [7] dan telur ayam [8]. Babi FMO3 gen juga ditemukan untuk menemukan di daerah QTL untuk off-rasa, yang memberikan indikasi Asosiasi antara gen FMO3 dan mati rasa di babi [13].Telur bebek umumnya hadir ikan-bau dan gen FMO3 seharusnya gen calon fenotipe ini. Namun, penuh dan struktur gen masih ditemukan di bebek. Di sini, kami kloning urutan penuh cDNA FMO3 gen, menganalisis struktur utama dan terdeteksi mutasi dalam pengkodean urutan gen FMO3 di bebek. Profil ekspresi gen FMO3 Bebek dalam jaringan tubuh yang berbeda juga diperiksa untuk memahami fungsi jaringan tersebut.Bahan dan metodeHewan dan jaringan koleksiEmpat laki-laki dan empat perempuan Pekin bebek (56-minggu tua) yang mendapat dari Beijing golden bintang bebek perusahaan. Semua bebek ini disembelih pada waktu yang sama, dan 15 jaringan tubuh yang berbeda, otak, otak kecil, jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, pankreas, kelenjar perut, usus kosong, usus buntu, ovarium, testis, otot payudara dan kulit yang dikumpulkan dan disimpan dalam nitrogen cair segera, dan kemudian disimpan di-80 C untuk total ekstraksi RNA.Sampel darah dari 11 bebek keturunan, Pekin bebek, Chaohu bebek, bebek Xingyi, Weishan Sheldrake, Enshi Sheldrake, Youxian Sheldrake, Jingjiang Sheldrake, putih Liancheng bebek, Guangxi kecil Sheldrake, Putian hitam bebek dan bebek Cherry Valley, sudah siap untuk deteksi SNP. Semua prosedur dilakukan sesuai dengan peraturan dan pedoman yang ditetapkan oleh Komite perawatan hewan China Agricultural University.Sintesis RNA isolasi dan cDNARNA diasingkan dari jaringan yang berbeda yang telah disimpan pada-80 C dengan menggunakan TRIZOL total RNA ekstraksi reagen (Invitrogen, AS) menurut produsen protokol. Kualitas total RNA diekstrak diteliti oleh 1% agarose Elektroforesis menggunakan 1 ll RNA. Dan konsentrasi terdeteksi oleh Nanovue (GE Healthcare, AS). CDNA strand pertama disintesis dari RNA dimurnikan oleh transkripsi terbalik PCR (RTPCR). Satu mikrogram total RNA terbalik ditranskripsi transkriptase M-MLV (Promega, Madison, WI), oligo dT primer (10 pmol/ll) dan katalisis inhibitor (RRI) pada total volume 50 reaksi ll sesuai instruksi dari pabriknya.Kloning cDNA bebek FMO3 genUrutan FMO3 ayam adalah ledakan dalam ENSEMBL database dan beberapa urutan EST sangat dilestarikan bebek yang diambil. Menurut urutan EST bebek untuk ayam FMO3 gen, sepasang primers (tabel 1) dirancang untuk memperkuat bagian dari daerah bebek FMO3 gen. cDNA salah satu dari empat hati digunakan sebagai template. Dan reaksi PCR dilaksanakan dalam volume akhir 15 ll dengan 1.2 ll pertama-strand cDNA, 7,5 ll 29 Taq PCR MasterMix dan 0,2 ll setiap primer (10 pmol). PCR Bersepeda kondisi yang optimal termasuk pra-denaturasi 94 C selama 5 menit, dan 35 siklus denaturasi 94 c selama 30 s, pelunakan 63 c selama 30 s, ekstensi pada 72 C untuk 60 s, maka akhir ekstensi pada 72 C selama 8 menit. Setelah Diperiksa oleh 1% agarose Elektroforesis gel, PCR produk yang bidirectionally diurutkan dengan menggunakan maju dan reverse primers (GENEWIZ, Beijing, Cina).Kami melakukan cepat amplifikasi berakhir cDNA (ras) untuk mendapatkan ukuran penuh dari Pekin bebek FMO3 mRNA urutan. Menurut fragmen sequencing parsial cDNA, dua gen-spesifik primers (GSP1 dan GSP2, tabel 1) dirancang oleh perangkat lunak Primer 5.0. Urutan-urutan pertama-strand cDNA yang disintesis menurut protokol 30-ras dan 50-ras sistem (Clontech, USA). Kemudian 30-mengakhiri urutan cDNA dan 50-akhir cDNA urutan yang disintesis oleh PCR menurut 30-ras dan 50-instruksi ras amplifikasi Kit Clontech SMARTTM (Clontech, USA), masing-masing. Reaksi PCR dilaksanakan di total volume 50 ll reaksi campuran. Dan gol berikut yang PCR dilakukan sebagai berikut: pertama dengan lima siklus 94 C untuk 30 s dan 72 C selama 30 menit, kemudian lima siklus pra-denaturasi 94 c 3 s, pelunakan 68 c untuk 30 s, dan ekstensi di 72 C untuk 3 menit, akhirnya dengan 30 siklus 94 c selama 30 s , 67 C untuk 30 s, 72 C selama 3 menit. RAS PCR produkNamaUrutan (50 ? 30 )Penggunaan

FMO3-pF: ATCTACCGCACCGTCTTCACCR: GATGAATTATCTGGGTAACGAGCCFragmen PCR

GSP1GGGTCTGCCATCCCGACAGC3 0 -PCR ras

GSP2CCCATCTCTCTGCGTAACCACCTC5 0 -PCR ras

Primer 1F: AAGCAAGGATGGATGGAAAAR: TCAGGCATGACAGCTACAGGMendeteksi SNP

Primer 2F: CCCTTCATCCCCTCTAACCCR: AACAGAGCCCACCGTCAAAAMendeteksi SNP

Primer 3F: ATGTGCTGGTGATACCTGCTACTR: GCCTCACGCTTACCTGTTGAMendeteksi SNP

Primer 4F: AGGCCATCCGTTCCCAAAGCR: GTGCCAAATCCATGTTCTTCAGCTMendeteksi SNP

Primer 5F: GCCCAGACCTTGATTCCAAAR: CTTCCCCTTGCCCTTTTCTCMendeteksi SNP

Primer 6F: CTGCCCACCCTTGCTGATR: GGGTAACGAGCCAAGCAGMendeteksi SNP

FMO3-rt-PCRF: TCTACCGCACCGTCTTCACCR: TCAGGGCGCTTCCTTATGTTRT-PCR

GAPDH-rt-PCRF: CTGCCCAGAACATTATCCCR: TCAGGGCGCTTCCTTATGTTRT-PCR

Tabel 1 Primers digunakan dalam kajian ini

pelem Elektroforesis pada gel agarose (1%) yang mengandung ethidium bromida, berubah menjadi pMD 19-T vektor (TaKaRa, Dalian, Cina) kemudian dan sequencing bidirectionally (GENEWIZ, Beijing, Cina). Untuk memastikan keakuratan Sekuensing, setidaknya lima-independen klon yang diurutkan untuk setiap PCR produk.Urutan analisisMenurut fragmen sequencing tiga, urutan penuh cDNA dirakit menggunakan urutan CAP3Program perakitan (http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php). Frame (ORF) dan urutan asam amino yang disimpulkan menggunakan ORF Finder membaca-terbuka (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf /). Bebek urutan genom (http://pre.ensembl.org/ Anas_platyrhynchos/Info/Index), cDNA urutan ayam FMO3 (penaikan nomor: NM_204579), dan urutan genom ayam yang digunakan untuk menentukan genom organisasi oleh perangkat lunak Splign (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/sutils/splign/splign.cgi ). Titik isoelektrik teoritis (pI) dan berat molekul (Mw) protein dihitung menggunakan menghitung pI/Mw alat (http://web.expasy.org/ compute_pi /). Peptida sinyal ditentukan oleh perangkat lunak sinyal P4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Segmen transmembran yang diperkirakan dengan TMHMM2 program (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/). Nukleotida serta asam amino diturunkan urutan bebek FMO3 gen yang terkutuk dengan orang-orang melaporkan FMO3 urutan dari spesies yang berbeda di Pusat Nasional untuk Bioteknologi informasi (NCBI) server (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ). Diduga motif dianalisis dalam cetakan database (http://www.bioinf.manchester.ac.uk/ dbbrowser cetakan/). Dilestarikan domain protein disimpulkan bebek FMO3 dianalisis oleh NCBI CD-Cari alat (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi). Kedua struktur ini diprediksikan oleh SOPMA software (http://npsa-pbil.ibcp.fr/). Pohon filogenetik dibangun dengan menggunakan molekul evolusi genetika analisis (MEGA) versi 5.0 (http://www.megasoftware.net/mega _ signup.php) [14].Identifikasi mutasi pada gen bebek FMO3DNA genom bebek diekstrak dengan metode fenol kloroform dari sampel darah yang dikumpulkan. Enam pasang dari primers (urutan primer yang ditunjukkan dalam tabel 1) untuk memperkuat seluruh pengkodean wilayah dari urutan genom dirancang untuk mendeteksi varian gen FMO3 bebek di 11 berbeda ras. Semua produk PCR adalah bidirectionally diurutkan dengan menggunakan primers maju dan sebaliknya.Jaringan analisis ekspresi gen FMO3 dalam bebekGambar 1 full-length Pekin bebek FMO3 cDNA urutan dan urutan disimpulkan asam amino. Inisiator kodon dan berhenti kodon menunjukkan dalam kotak hitam, dan segmen transmembran (509aa-531aa) yang diprediksi oleh TMHMM2 programmenggarisbawahi . Urutan sebelum inisiator kodon dan sesudah stop kodon yang 50UTR dan 30- UTR,masing-masing

Untuk menyelidiki mRNA profil ekspresi gen FMO3 Pekin bebek, kami diekstrak total RNA dari 15 jaringan, otak, otak kecil, jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, pankreas, kelenjar perut, usus kosong, usus buntu, ovarium, testis, otot dan kulit, dan dilakukan secara real-time RT-PCR. Bebek glyceraldehyde fosfat dehidrogenase gen (GAPDH, nomor induk: GU564233) digunakan sebagai referensi internal gen untuk menormalkan kadar transkripsi gen target. Spanned intron primers untuk FMO3 gen dan gen GAPDH dirancang oleh 5.0 Primer (tabel 1). Realtime PCR ekspresi gen dilakukan dengan menggunakan metode Ct komparatif. Untuk menentukan efisiensi PCR target dan pengendalian internal gen, sepuluh kali lipat serial pengenceran (10-110-5) cDNA dibuat dan diuji dalam rangkap tiga untuk menghasilkan standar kurva. Identitas produk diperkuat dikukuhkan oleh Sekuensing.Gambar 2 A skema presentasi gen bebek FMO3 (a) dan (b) FMO3 ayam gen. Exons yang ditampilkan sebagai kotak abu-abu padat dan dicap oleh angka-angka ekson pada mereka. Garis di antara mereka yang berdiri untukintron. Codons mulai dan berhenti codons ditunjukkan oleh panah. Panjang dua gen dicap oleh angka-angka abu-abu di bawah setiap gambar struktur. Jarak yang ditunjukkan tertarik untuk skala

Fig. 3 struktur kedua Pekin bebek FMO3 diperkirakan oleh perangkat lunak SOPMA. Jalur terpanjang, kedua garis-garis terpanjang, ketiga jalur terpanjang dan jalur terpendek berdiri untuk Alpha helixs, diperpanjang helai, ternyata beta, dan acak kumparan, masing-masing

Real-Time PCR dilakukan pada sistem ABI 7300 (Terapan Biosystems, USA) yang menggunakan kekuatan SYBR PCR Master Mix (Terapan Biosystems, USA). Semua real-time PCR reaksi dilakukan menggunakan plat optik 96-baik reaksi dan menjalankan dalam rangkap tiga. Setiap plat termasuk dua tidak ada template kontrol (NTCs). PCR reaksi yang dilakukan pada final volume 15 ll termasuk 1.2 ll cDNA, 0.2 ll primer gen-spesifik masing-masing, 7.5 ll 19 PCR campuran dan 5.9 air akan dimurnikan. Program ini dijalankan menggunakan kondisi Bersepeda termal berikut optimal: satu siklus 95 c selama 10 menit, 40 siklus 95 60 C untuk 15 s, 60 C untuk 1 min, 95 C untuk 15 s, 60 C untuk 30 s, dan 95 C untuk 15 s. Semua pengendalian internal dan NTC diuji bersama dengan sampel tidak diketahui dalam jangka masing-masing. Ekspresi relatif bebek FMO3 mRNA dihitung relatif terhadap jumlah GAPDH hadir.Real-time PCR data dianalisis dengan menggunakan metode Ct komparatif. Nilai Ct yang berarti triplicate sampel yang diuji. Data telah dinormalkan menggunakan tata graha gen GAPDH sebagai standar internal. Ekspresi gen dihitung sebagai 2-DCt (DCt = target Ct - pengendalian internal Ct) dan nilai ditunjukkan n-lipat perbedaan relatif terhadap ekspresi gen pengendalian internal. Semua data yang juga mengalami satu arah analisis varians (ANOVA) antara jaringan yang berbeda. Perbandingan dianggap signifikan di P\0.05 dan sangat signifikan di P\0.01.ImmunohistochemistryBlok hati dikumpulkan dan tetap semalam dalam fiksatif di 4 C. Pendekatan operasional immunohistochemistry menurut cara yang digambarkan oleh Novick et al. [15]. Antibodi terhadap FMO3 untuk ayam itu dibeli dari SRB laboratorium. Bagian dilihat menggunakan Eclipse-600 photomicroscope (Nikon, Tokyo, Jepang) dilengkapi dengan kamera digital Spot (Instruments, Inc., Sterling Heights, MI).HasilUrutan analisisBerdasarkan primers dirancang dari Bebek dilestarikan EST urutan untuk ayam FMO3 gen, wilayah pengkodean fragmen sekitar 1,490 bp ini diperkuat A Khusus 623 bp band 30-akhir dan spesifik 527 bp fragmen lain 50-akhir yang diperoleh. Oleh menyelaraskan dan penyambungan daerah parsial (1,490 bp), 30- dan 50-ras-PCR produk urutan, bp 1,846 cDNA full-length Pekin bebek FMO3 gen diperoleh, yang mengandung 153 bp 30-wilayah diterjemahkan (30- UTR), 1,599 bp coding wilayah dan 94 bp 50diterjemahkan wilayah (50- UTR) (Fig. 1).Analisis urutan nukleotida cDNA menggunakan on-line ledakan alat mengungkapkan bahwa urutan cDNA 1,846 bp tidak homolog ke salah satu gen dikenal bebek dan itu kemudian disimpan ke dalam GenBank database (penaikan nomor: JX126807). Full-length cDNA urutan dan urutan disimpulkan asam amino yang ditampilkan dalam gambar 1. Menganalisis melalui NCBI-ORF Finder mengungkapkan bebek FMO3 cDNA urutan terkandung 1,599 bp ORF dan dikodekan 532 asam amino residu (Fig. 1). Analisis Splign mengungkapkan bahwa bebek FMO3 gen memiliki struktur sembilan ekson-delapan intron yang menunjukkan dalam Fig. 2, dan semua situs sambatan sesuai dengan aturan GT-AG. PI teoritis dan Mw ini disimpulkan protein yang dihitung dengan menggunakan menghitung pI/Mw alat. PI ini Pekin bebek FMO3 protein adalah 7.87. Mw protein ini diduga adalah analisis Da. 60,711.25 dengan perangkat lunak sinyal P 3.0 mengungkapkan bahwa peptida disimpulkan berisi satu diduga konsensus sekresi sinyal peptida dari 1 untuk 17 asam amino residu, yang menunjukkan bahwa protein sekresi. Hasil yang diprediksi oleh TMHMM2 program menunjukkan bahwa

b Urutan gambar beberapa 4 keberpihakan FMO3 protein urutan sepuluh spesies menggunakan ESPript 2.2 dari Expasy Web server. Dilestarikan residu yang hitam. Kotak residu semi dilestarikan. Motif tertentu penting disajikanjuga memiliki segmen transmembran (509aa-531aa) (Fig. 1). Struktur sekunder diduga urutan disimpulkan asam amino disajikan dalam Fig. 3.Disimpulkan asam amino urutan analisisCari BLASTX menunjukkan bahwa urutan cDNA bp 1,846 berbagi kesamaan tinggi (nilai E = 0,0) untuk FMO3 ayam (penaikan nomor: NM_204579.1). BLASTP analisis revealedthatthededucedaminoacidsequenceofPekinduck FMO3 berbagi identitas tertinggi (82%) dengan Gallus gallus (accessionnumber:NP_989910.1) FMO3andrelative rendah identitas dengan species,e.g lain., 66% dengan Rattus norvegicus (penaikan nomor: NP_445885.2), 64% dari Mus musculus (penaikan nomor: NP_032056.1), 63% dari Canis lupus familiaris (penaikan nomor: NP_001003060.1), 65% dari cuniculus cuniculus (penaikan nomor: NP_001075715.1), 62% dari Macaca mulatta (nomor induk : NP_001028065.1), 65% dari Bos Taurus (penaikan nomor: NP_776482.1), 62% dari Pantroglodytes (penaikan nomor: NP_001009092.1), 62% dari Pongo abelii (penaikan nomor: NP_001124820.1), dan 61% Homosapiens (penaikan nomor: NP_001002294.1). AlignmentsofduckFMO3proteinwiththoseofotherspecieswere beberapa yang disajikan dalam gambar 4.Beberapa urutan keberpihakan menunjukkan bahwa Pekin bebek FMO3 berisi dua kali lipat Rossmann klasik dinukleotida mengikat motif (DMBs), GXGXXG dan GXGXXG. Mengidentifikasi FMO motif FXGXXXHXXX(Y/F) juga ditemukan berada tepat sebelum motif NAD (P) H-mengikat Pekin bebek urutan. Kami juga mendeteksi motif FATGY dilestarikan di bebek FMO3 protein (gambar 4).Benar-benar, 36 motif, yang melibatkan empat-spesifik motifsfoundbymultiplealignments, wererecognizedforthe

Gambar 5 filogenetik pohon FMO3 protein dari spesies yang berbeda. Cabang-cabang pohon filogenetik diberi label dengan nama spesiesdiduga protein motif mencari di database cetakan dengan nilai P yang signifikan dan berisi 13 FMOXYGENASE motif, 6 motif FMOXYGENASE3, 5 FMOXYGENASE1 motif, motif FMOXYGENASE 6, 2 motif ADXRDTASE, 2 PNDRDTASEI motif, dan 2 FADPNR motif. Antara motif tersebut, beberapa yang tumpang tindih dan beberapa penting motif disajikan dalam gambar 4.Berdasarkan NCBI CD-Cari alat analisis, dua dilestarikan domain termasuk NADB_Rossmann superfamili dan FMO-seperti yang diperkirakan, dan domain FMO-seperti diklasifikasikan sebagai model yang dapat menjangkau lebih dari satu domain.Hubungan filogenetik FMO3 protein antara spesiesUntuk menelaah hubungan genetik bebek FMO3 protein dengan spesies lain, FMO3 protein urutan dari berbagai vertebrata dalam GenBank non-redundant database yang digunakan untuk membangun sebuah pohon filogenetik dengan menggunakan metode bergabung dengan tetangga. Kami membangun sebuah pohon filogenetik berdasarkan urutan multi keberpihakan urutan protein FMO3 dari berbagai spesies termasuk bebek (Anas platyrhynchos), manusia (Homo sapiens), simpanse (Pan troglodytes), orangutan (Pongo abelii), kera (Macaca mulatta), anjing (Canis lupus familliaris), sapi (Bos taurus), kelinci (cuniculus cuniculus), tikus (Rattus musculus), mouse (Mus musculus), xenopus (Xenopus tropicalis dan Xenopus laevis), dan ayam (Gallus gallus). Analisis filogenetik pohon mengungkapkan bahwa semua spesies berkumpul menjadi tiga kelompok yang berbeda. Bebek dan ayam dikelompokkan ke dalam satu klaster dengan jarak terdekat. Dua jenis Afrika katak berkumpul ke dalam kelompok amfibi, dan semua mamalia yang berkumpul dalam kelompok lain (gambar 5), yang menyarankan bahwa bebek FMO3 memiliki hubungan genetik yang lebih dekat dengan burung-burung lain dibandingkan dengan vertebrata lainnya. Dan hasilnya adalah konsisten dengan hasil evolusi molekuler sebelumnya. Tempat-tempat polimorfik ditemukan di bebek FMO3 genBenar-benar, 27 SNP terdeteksi dalam urutan pengkodean gen FMO3 Bebek dalam ras yang berbeda (tabel 2). Ada lima missense mutasi. Satu mutasi omong kosong ditemukan di ekson 2 in 1 Enshi Sheldrake bebek, yang membuat kodon pengkodean tirosin ke kodon berhenti. SNP 21 yang tersisa adalah mutasi-mutasi semua identik.Analisis ekspresi dan immunohistochemistry jaringan-spesifik Pekin bebek FMO3Berdasarkan lereng kurva standar gen target FMO3 dan tata graha gen GAPDH yang dihasilkan olehTabel 2 situs polimorfik ditemukan dalam pengkodean urutan gen bebek FMO3 dalam ras yang berbedaSNP nomorNukleotida posisiLokasiSNPJenis SNPAsam amino perubahan

1NT 112Ekson 2C [TIdentik mutasi

2NT 124Ekson 2G [AIdentik mutasi

3NT 128Ekson 2[GMissense mutasiSaya? V


5NT 223Ekson 2C [AMutasi omong kosongY? X







12NT 849Ekson 6[GMissense mutasiN? S


14NT 976Ekson 7T [CIdentik mutasi

15NT 1030Ekson 7T [GMissense mutasiV? L



18NT 1097Ekson 7C [TMissense mutasiH? Y

19NT 1100Ekson 7C [TMissense mutasiP? S









aNukleotida posisi yang relatif terhadap urutan (penaikan nomor: JX126807)

sepuluh kali lipat pengenceran serial dari cDNA disebutkan di atas, PCR efisiensi (E) dua gen yang dihitung dengan log persamaan E =-1/m, dimana m adalah lereng baris dan E adalah efisiensi [16]. Efisiensi PCR bebek GAPDH gen adalah 0,95 lereng yang kurva standar-3.456, dan bebek FMO3 gen itu 1,00 lereng yang kurva standar adalah-3.308. Jadi banding Ct metode dapat digunakan dan tingkat relatif ekspresi gen FMO3 dalam jaringan tubuh yang berbeda disajikan sebagai 2-DCt 9 100. FMO3 sangat dinyatakan dalam hati, paru-paru dan ginjal, sedangkan tingkat ekspresi cukup rendah yang ditemukan dalam jaringan 12 lainnya termasuk otak, hipotalamus, hati, pankreas, limpa, kelenjar perut, usus kosong, usus buntu, ovarium, testis, kulit dan otot payudara (gambar 6). Hasil analisis SAS mengungkapkan bahwa transkrip Pekin bebek FMO3 transkrip di hati, paru-paru dan ginjal yang signifikan (P\0.01) lebih tinggi daripada yang lain 12 jenis jaringan (gambar 6). Hasil dari immunohistochemistry menunjukkan bahwa ada menyebar FMO3 didistribusikan di bebek hati (gambar 7).DiskusiBinatang termasuk manusia yang terkena jumlah xenobiotik, seperti bahan kimia industri dan pertanian, dan komponen normal diet. Xenobiotik ini mengandung heteroatom nukleofilik adalah semua substrat FMOs [17, 18]. FMO3 adalah anggota keluarga FMO utama dan terutama menyajikan dalam hati manusia yang dewasa, dimana ia memainkan peran penting dalam metabolisme yang mengandung TMA xenobiotik. TMA adalah zat utama yang menyebabkan semacam gangguan metabolisme manusia, TMAU [5], dan noda amis off-rasa susu susu dan mencurigakan di telur ayam [19, 20]. Dan TMA dimetabolisme secara eksklusif untuk TMAO terutama oleh FMO3 pada manusia [21]. Oleh karena itu, FMO3 mungkin memainkan peran penting dalam perlindungan hewan dari produk-produk alami yang berbahaya. Dalam beberapa tahun terakhir, banyak studi berkonsentrasi pada polimorfisme yang hadir di daerah pengkodean protein FMO3 gen pada berbagai spesies [22]. Karena mutasi (P153L) FMO3 gen pertama ditemukan terkait dengan sindrom ikan-bau manusia [6], lebih dari 30 berbeda

Gambar 6 ekspresi relatif mRNA Pekin bebek FMO3 dalam jaringan yang berbeda. Total RNA dari 15 jaringan empat Pekin bebek yang digunakan untuk melakukan qPCR. qPCR berjalan di triplicates. Ekspresi Pekin bebek FMO3 dinormalisasi dengan jumlah GAPDH mRNA. Di atas data yang disajikan sebagai berarti SD. kolom berbagi huruf yang berbeda (A dan B) Tampilkan perbedaan signifikan (P\0.01)

Gambar 7 Immunoreactive FMO3 di bebek hati. Immunoreactivity hepatosit ditunjukkan oleh panahdomain, masing-masing [26]. Semua dari mereka adalah elemen

penyebab mutasi telah mengidentifikasi dikaitkan dengan TMAU dengan merusak atau menonaktifkan kemampuan FMO3 untuk memetabolisme substrat [23]. Mereka mengganggu perakitan holoenzyme atau mempengaruhi kinetik kompetensi FMO3 [9]. Beberapa penyebab mutasi juga telah ditemukan di sapi dan ayam. Omong kosong (R238X) mutasi pada gen FMO3 sapi ditemukan untuk menjadi lapisan bawah amis mati rasa di susu sapi [7]. Dan mutasi nonsynonymous pada ayam FMO3 gen (T329S) telah diverifikasi dikaitkan dengan peningkatan kadar TMA dan mencurigakan noda dalam kuning telur ayam. Dan polimorfisme genetik ini bisa dimanfaatkan untuk penanda-dibantu pilihan untuk susu dan ayam [8].Dalam studi ini, kami mendapat panjang penuh bebek FMO3 gen dan menemukan bahwa gen bebek FMO3 saham struktur ekson-delapan intron sembilan dengan ayam dan manusia [8, 24], yang menunjukkan mungkin memiliki fungsi yang sama dengan ayam dan manusia.BLASTP dan phylogeny hasil menunjukkan bebek FMO3 memiliki hubungan dekat dengan ayam FMO3 dengan perbandingan dengan spesies lain. Hasil ini tersirat ayam FMO3 gen bisa model hewan yang lebih baik untuk memahami fungsi potensi bebek FMOs.Beberapa urutan alignment FMO3 protein urutan dalam berbagai spesies dan dilestarikan motif analysisrevealed Pekin bebek urutan asam amino FMO3 terdapat beberapa motif yang dilestarikan, dan motif tersebut sangat penting untuk fungsi potensi gen ini. FMOXYGENASE motif 1 (GXGXXG) dan PNDRDTASEI motif 3(GXGXXG) telah dijelaskan untuk mengikat ADP yang tidak mode dan H NAD (P), masing-masing [25]. Fungsi FMOXYGENASE motif 2 (GG motif) adalah untuk menstabilkan FADbinding. Motif FMOXYGENASE 7 dan 11 (2 ATG motif) membentuk hubungan antara mode dan NADPH domain, dan hubungan antara NADPH dan situs aktif dinukleotida mengikat motif (DBMs) [27]. FMOXYGENASE motif 12 (GD motif) yang seharusnya untuk mengikat flavin yang FAD tidak [26]. FATGY motif telah diidentifikasi sebagai salah satu komponen dilestarikan hampir semua vertebrata FMO3. Mutasi nonsynonymous (T329S) pada motif dilestarikan FATGY ayam FMO3 gen adalah dikaitkan dengan amis noda dalam kuning telur. Motif ini telah speculated menjadi substrat pengakuan saku FMOs [8]. Motif FMO-tanda tangan, versi yang diperluas FMOOXYGENASE motif 8 (FXGXXXHXXXF/Y), terbukti memberikan kontribusi untuk mengikat NADPH dan tampaknya memiliki fungsi tambahan serta [1].Dalam 27 SNP terdeteksi, ada enam SNP nonsynonymous (nsSNPs) termasuk satu mutasi omong kosong dan lima missense mutasi. Mutasi omong kosong dapat menginduksi perubahan yang paling dramatis karena membuat asam amino normal ke halte kodon, yang mengakibatkan pemotongan dalam urutan protein dan memproduksi protein nonfungsional [28]. Jadi omong kosong terdeteksi mutasi (SNP 5) ekson 2 juga bisa menyebabkan penghentian prematur, menghilangkan [80% enzim FMO3 yang diharapkan terdiri dari 532 asam amino. Dua mutasi omong kosong (E305X, E314X di FMO3 gen manusia) dan omong kosong satu mutasi (R238X) sapi FMO3 gen telah terbukti menyebabkan hilangnya lengkap aktivitas enzim [7, 29]. Terdeteksi lima missense mutasi-mutasi (SNP 2, SNP 12, SNP 15, SNP 18 dan SNP 19) terletak di FMOXYGENASE motif 1, FMOXYGENASE3 motif 3, FMOXYGENASE motif 10, FMOXYGENASE motif 11, dan motif FMOXYGENASE 11, masing-masing. Motif tersebut sangat penting untuk fungsi gen FMO3, sehingga SNP lima di motif dilestarikan tersebut dapat mempengaruhi aktivitas enzim FMO3 bebek.Dalam percobaan kami, bebek FMO3 gen berbeda dinyatakan dalam 15 jenis jaringan. Ini dinyatakan secara dramatis tinggi dalam hati, paru-paru dan ginjal dari jaringan lainnya di dewasa bebek. Percobaan immunohistochemistry juga diverifikasi bahwa FMO3 dinyatakan dalam hati bebek. Hasil ini konsisten dengan yang ditemukan dalam spesies lain. Telah diverifikasi mRNA pengkodean FMO3 adalah berlimpah dalam hati manusia yang dewasa dengan menggunakan kuantitatif RNase perlindungan tes [30]. Beberapa bukti menunjukkan bahwa FMO3 FMO utama yang terlibat dalam sulfoxidation metionin kelinci hati dan ginjal microsomes [31]. Immunoblot dan analisis Utara blot mengungkapkan FMO3 dinyatakan dalam anjing hati dan paru-paru, tetapi tidak dalam ginjal [32]. Analisis blot Barat menunjukkan tingkat ekspresi protein anjing FMO3 dalam hati microsomes lebih tinggi daripada di paru-paru microsomes [33]. Real-Time PCR metodologi analisa manusia menunjukkan bahwa gen FMO3 terutama terdeteksi di hati dewasa, yang merupakan jumlah yang lebih besar secara signifikan bila dibandingkan dengan jaringan lain. Dan tingkat mRNA FMO3 di otak kurang dari 1% dari yang di dewasa hati [34]. Dalam penelitian kami, bebek FMO3 gen juga sangat dinyatakan dalam hati, paru-paru dan ginjal, menunjukkan peran potensial gen FMO3 bebek jaringan tersebut.Kesimpulannya, kami berhasil kloning cDNA penuh FMO3 gen Pekin bebek, dianalisis ekson intron struktur dan karakteristik nukleotida dan asam amino yang diduga urutan andidentified polymorphism dalam codingregioninvariousduckbreeds. Profil ThemRNAexpression FMO3 dalam jaringan 15 disajikan, dan protein juga terdeteksi oleh immunohistochemistry di hati. Studi ini memberikan landasan utama untuk wawasan lebih lanjut ke dalam peran mungkin FMO3 gen pada bebek.Ucapan terima kasih studi ini didukung sebagian oleh dana dari program sarjana Changjiang dan inovatif penelitian di Universitas (IRT0945 dan IRT1191).Referensi1. SK Krueger, Williams DE (2005) mamalia yang mengandung flavin monooxygenases: struktur/fungsi, genetic polymorphism dan peranan dalam metabolisme obat. Pharmacol ada 106:357-387. Doi: 10.1016/j.pharmthera.2005.01.001 2. Hines RN, Cashman JR, Philpot RM, Williams DE, Ziegler DM (1994) mamalia yang mengandung flavin monooxygenases: karakterisasi molekul dan regulasi ekspresi. Toxicol Appl Pharmacol 125:1-6. Doi:10.1006/taap.1994.1042 3. Hodgson E, Rose RL, Cao Y, Dehal SS, Kupfer D (2000) Flavincontaining monooxygenase isoform kekhususan untuk N-oksidasi tamoxifen ditentukan oleh pengukuran produk dan NADPH oksidasi. J Biochem Mol Toxicol 14:118-1204. Hodgson E, Rose RL, Ryu DY, Falls G, Blake BL, PE Levi (1995) pestisida-metabolisme enzim. Toxicol Lett 82-83:73-815. Al-Waiz M, Ayesh R, Mitchell SC, siaga JR, Smith RL (1987) A polimorfisme genetik dari N-oksidasi trimethylamine pada manusia. M.Farm(Klin) Pharmacol ada 42:588-5946. Dolphin CT, Janmohamed A, Smith RL, Shephard EA, Phillips IR (1997) Missense mutasi pada gen monooxygenase 3 yang mengandung flavin, FMO3, mendasari sindrom ikan-bau. NAT Genet 17:491-494. Doi:10.1038/ng1297-491 7. Lund A, Marklund S, Gustafsson V, Andersson L (2002) A omong kosong mutasi pada gen FMO3 mendasari amis mati rasa di susu sapi. Genom Res 12:1885-1888. Doi:10.1101/gr.240202 8. Honkatukia M, Reese K, Preisinger R, Tuiskula-Haavisto M, Weigend S, Roito J, Maki-Tanila A, Vilkki J (2005) Fishy noda dalam telur ayam yang dikaitkan dengan substitusi dalam motif dilestarikan gen FMO3. Genomics 86:225-232. Doi:10.1016 / j.ygeno.2005.04.005 9. Yeung CK, Adman ET, Rettie AE (2007) fungsional karakterisasi varian genetik manusia FMO3 terkait dengan trimethylaminuria. Lengkungan Biochem Biophys 464:251-259. Doi:10.1016/j.ABB.2007.04.01410. Bain MD, Jones M, Samir SP, Reed PJ, Tracey BM, Chalmers RA, Stacey TE (1988) kontribusi metabolisme bakteri usus untuk Penyakit metabolik manusia. Lancet 1:1078-107911. Murphy HC, Dolphin CT, Janmohamed A, Holmes HC, Michelakakis H, Shephard EA, Chalmers RA, Phillips IR, Iles RA (2000) A novel mutasi pada gen monooxygenase 3 yang mengandung flavin, FM03, yang menyebabkan bau ikan sindrom: aktivitas enzim mutan dinilai oleh proton NMR spektroskopi. Pharmacogenetics 10:439-45112. SC Mitchell, RL Smith (2001) Trimethylaminuria: ikan malodor sindrom. Obat Metab Dispos 29:517-52113. Glenn KL, Ramos AM, Rothschild MF (2007) analisis gen FMO dan mati rasa di daging babi. J Anim berkembang biak Genet 124:35-38. Doi:10.1111/j.1439-0388.2007.00631.x 14. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Sari (2011) MEGA5: analisa genetika evolusi molekuler menggunakan maksimum kemungkinan, evolusi jarak dan metode kekikiran maksimum. Mol Evol berbagai 28:2731-2739. Doi:10.1093 / molbev msr121 15. RM Novick, Mitzey AM, Brownfield MS, lokalisasi diferensial AA Elfarra (2009) yang mengandung flavin monooxygenase (FMO) isoforms 1, 3, dan 4 di tikus hati dan ginjal dan bukti untuk ekspresi FMO4 di mouse, tikus, dan manusia microsomes hati dan ginjal. J Pharmacol Exp ada 329:1148-1155. Doi: 10.1124/jpet.109.152058 16. Schmittgen TD, Livak KJ (2008) menganalisis real-time PCR data dengan metode C(T) perbandingan. NAT Protoc 3:1101-110817. Ziegler D (1980) Microsomal yang mengandung flavin monooxygenase: oksigenasi nukleofilik nitrogen dan belerang senyawa. Enzimatik dasar detoxication 1:201-22718. Cashman JR, SB Park, Berkman CE, LE Cashman (1995) peran hepatik yang mengandung flavin monooxygenase 3 dalam metabolisme obat dan kimia pada manusia dewasa. Chem berbagai berinteraksi 96:33 4619. E Butler, Trimethylamine Fenwick G (1984) dan mencurigakan noda di telur. Dunia bintik 40: 38 Sci J-5120. A Lund, Gustafsson V, Imhof M, Gauch R, konsentrasi tinggi trimethylamine JO Bosset (2002) dalam susu dari sapi pada standar diet dinyatakan sebagai off-rasa amis. J susu Res 69:383-39021. Lang DH, Yeung CK, Peter RM, Ibarra C, Gasser R, Itagaki K, RM Philpot, Rettie AE (1998) Isoform kekhususan dari trimethylamine N-oksigenasi oleh manusia yang mengandung flavin monooxygenase (FMO) dan enzim P450: selektif katalis oleh FMO3. Biochem Pharmacol 56:1005-101222. Polimorfisme J Zhou, mutasi Shephard EA (2006), dan perspektif untuk masa depan manusia yang mengandung flavin monooxygenase 3. Mutat Res 612:165-171. Doi:10.1016/j.mrrev.2005.09.001 23. D Hernandez, Addou S, Lee D, Orengo C, Shephard EA, Phillips IR (2003) Trimethylaminuria dan database mutasi FMO3 manusia. Hum Mutat 22:209-213. Doi:10.1002/humu.10252 24. Dolphin CT, Riley JH, Smith RL, Shephard EA, Phillips IR (1997) struktur organisasi yang mengandung flavin monooxygenase 3 gen manusia (FMO3), calon disukai sindrom fishodor, ditentukan secara langsung dari DNA genom. Genomics 46:260-267. Doi:10.1006/geno.1997.5031 25. Wierenga RK, De Maeyer KIA, interaksi Hol WGJ (1985) pirofosfat gugus dengan Alfa-helixes dalam mengikat dinukleotida protein. 24:1346 biokimia-135726. Vallon O (2000) motif urutan baru di flavoproteins: bukti untuk umum keturunan dan alat untuk memprediksi struktur. Protein 38:95-11427. Rossmann MG, Moras D, Olsen KW (1974) kimia dan biologi evolusi dari protein pengikat nukleotida. Alam 250:194-19928. Strachan T, membaca genetika molekuler manusia (1999), edisi ke-2. BIOS ilmiah, Oxford29. Treacy EP, Akerman BR, Chow LM, Youil R, Bibeau C, Lin J, Bruce AG, Knight M, Danks DM, Cashman JR, Forrest SMMutasi-mutasi (1998) yang mengandung flavin gen monooxygenase (FMO3) menyebabkan trimethylaminuria, Cacat detoxication. Hum Mol Genet 7:839-84530. TE dolphin CT, Cullingford, Shephard EA, RL Smith, Phillips IR (1996) diferensial perkembangan dan jaringan-spesifik regulasi ekspresi gen pengkodean tiga anggota keluarga monooxygenase yang mengandung flavin manusia, FMO1, FMO3 dan FM04. EUR J Biochem 235:683-68931. RJ Duescher, Lawton MP, Philpot RM, Elfarra AA (1994) Flavin yang mengandung monooxygenase (FMO)-tergantung metabolisme metionin dan bukti untuk FMO3 menjadi FMO utama yang terlibat dalam metionin sulfoxidation di kelinci microsomes hati dan ginjal. J berbagai Chem 269:17525-1753032. Lattard V, Longin-Sauvageon C, Lachuer J, Delatour P, Benoit E Cloning (2002), sekuensing, dan bergantung pada jaringan ekspresi yang mengandung flavin monooxygenase (FMO) 1 dan FMO3 di anjing. Obat Metab Dispos 30:119-12833. Stevens JC, Melton RJ, Zaya MJ, ekspresi LC Engel (2003) dan karakterisasi fungsional anjing flavin yang mengandung monooxygenase 1. Mol Pharmacol 63:271-27534. J Zhang, analisis kuantitatif Cashman JR (2006) FMO gen mRNA tingkat dalam jaringan manusia. Obat Metab Dispos 19 Banyaklah 26.doi: 10.1124/DMD.105.006171

OriginalThe identity of the amplified products was confirmed by sequencing.

molekul kloning, urutan karakterisasi, deteksi snp, dan jaringan analisis ekspresi gen bebek fmo3

Documents