perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id kloning dan .../kloning... · perpustakaan.uns.ac.id...

45
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id commit to user KLONING DAN ANALISIS MOLEKULER GEN PENYANDI PROTEIN NS4B VIRUS HEPATITIS C 1a (HCV 1a) ISOLAT JAWA TENGAH SKRIPSI Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran FAQIHUDDIN AHMAD NIM. G0007068 FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2010

Upload: hacong

Post on 02-Mar-2019

238 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

KLONING DAN ANALISIS MOLEKULER GEN PENYANDI PROTEIN NS4B

VIRUS HEPATITIS C 1a (HCV 1a) ISOLAT JAWA TENGAH

SKRIPSI

Untuk Memenuhi Persyaratan

Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran

FAQIHUDDIN AHMAD

NIM. G0007068

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA 2010

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

ii

PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi dengan judul : Kloning dan Analisis Molekuler Gen Penyandi Protein NS4B Virus Hepatitis C 1a (HCV 1a) Isolat Jawa Tengah

Faqihuddin Ahmad, G0007068, Tahun 2010

Telah diuji dan sudah disahkan di hadapan Dewan Penguji Skripsi

Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Pada Hari Kamis, Tanggal 23 Desember 2010

Pembimbing Utama

Nama : Afiono Agung Prasetyo, dr., Ph.D NIP : 19770907 200212 1 002 ( ) Pembimbing Pendamping

Nama : Yulia Sari, S.Si., M.Si. NIP : 19800715 200812 2 001 ( )

Penguji Utama

Nama : Betty Suryawati, dr., M.Biomed.Sci. NIP : 19760525 200112 2 001 ( ) Anggota Penguji

Nama : Isdaryanto, dr., MARS NIP : 19500312 197610 1 001 ( )

Surakarta, 23 Desember 2010

Ketua Tim Skripsi

Muthmainah, dr., M.Kes. NIP. 19660702 19980 2 2001

Dekan FK UNS

Prof. Dr. AA Subijanto, dr., MS. NIP. 19481107 197310 1 003

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

vi

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT karena limpahan nikmat, rahmat, hidayah, serta ridho-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Kloning dan Analisis Molekuler Gen Penyandi Protein NS4B Virus Hepatitis C 1a (HCV 1a) Isolat Jawa Tengah”.

Dengan selesainya penulisan skripsi ini, perkenankanlah dengan setulus hati penulis menyampaikan penghargaan dan ucapan terima kasih kepada: 1. Prof. Dr. AA Subijanto, dr., MS, selaku Dekan Fakultas Kedokteran

Universitas Sebelas Maret Surakarta. 2. Afiono Agung Prasetyo, dr., Ph.D selaku pembimbing utama yang telah

berkenan memberikan waktu, bimbingan, saran, dan motivasi bagi penulis. 3. Yulia Sari, S.Si., M.Si. selaku pembimbing pendamping yang telah

memberikan waktu, bimbingan, saran, dan motivasi bagi penulis. 4. Betty Suryawati, dr., M.Biomed.Sci. selaku penguji utama yang telah

memberikan koreksi dan saran untuk menyempurnakan penyusunan skripsi. 5. Isdaryanto, dr., MARS selaku anggota penguji yang telah memberikan

koreksi dan saran untuk menyempurnakan penyusunan skripsi. 6. Muthmainah, dr., M.Kes selaku Ketua Tim skripsi Fakultas Kedokteran

Universitas Sebelas Maret. 7. Bapak dan ibu tercinta Sugeng Indardi, drs., MBA dan Linda Suyati, dra.,

M.Si atas segala do’a restu yang tiada habisnya, bimbingan serta support baik moril maupun materiil.

8. Teman-teman seperjuangan di Kastrat de Geneeskunde, semoga selalu tetap semangat dalam mengobarkan suasana ilmiah di kampus tercinta dan jangan lupa, sifat nekat harus tetap terpelihara.

9. Semua pihak yang telah memberi bantuan secara langsung maupun tidak langsung sehingga terselesainya skripsi ini.

Penulis menyadari sepenuhnya bahwa dalam penyusunan skripsi ini tidak lepas dari kekurangan karena keterbatasan waktu, tenaga, dan pengetahuan penulis. Oleh karena itu, dibutuhkan saran dan masukan untuk menyempurnakan skripsi ini. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi kita semua. Amin.

Surakarta, 23 Desember 2010

Faqihuddin Ahmad

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Hepatitis C virus (HCV) dikenal sebagai salah satu virus yang

menyebabkan problem mendasar dalam dunia kesehatan. Angka kejadian

infeksi HCV pada populasi penduduk dunia mencapai 3 % yang berarti 170

juta orang kini terinfeksi HCV (Alter, 2007; Holmberg, 2009). Di Indonesia

sendiri diperkirakan hingga tujuh juta penduduk kini mengalami infeksi aktif

HCV (Kementrian Kesehatan RI, 2009). Selain itu beberapa laporan

menunjukkan bahwa 70 – 85 % infeksi HCV berlangsung persisten. Hanya 20

– 25 % pasien infeksi HCV yang dapat sembuh sempurna, sementara yang lain

berisiko tinggi untuk mencapai kondisi terminal (Lemon et al., 2007).

Dalam usaha mengeradikasi HCV, dibutuhkan pengetahuan mengenai

strategi replikasi virus maupun proses patofisiologi HCV yang hingga kini

masih belum begitu banyak diketahui. Penelitian lanjutan HCV membutuhkan

plasmid yang mengandung sebagian atau seluruh gen HCV untuk diketahui

aktivitas maupun fungsinya. Selain itu, penelitian lanjutan HCV juga

memerlukan suatu model replikasi yang disebut dengan replikon maupun

sistem infeksius. Proses pembuatan replikon maupun sistem infeksius dapat

secara langsung dikloning dari keseluruhan genom HCV, namun akan lebih

bermanfaat ketika replikon maupun sistem infeksius tersebut dibuat melalui

kloning secara terpisah dari masing-masing gen. Plasmid rekombinan yang

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

2

dibentuk dari masing-masing gen HCV dapat langsung dimanfaatkan untuk

penelitian lanjutan di bidang HCV.

Di Indonesia sendiri penelitian mengenai HCV hingga kini hanya

sampai pada tahap seroprevalensi dan epidemiologi molekuler. Sejauh yang

peneliti tahu, Indonesia masih belum memiliki plasmid, replikon maupun

sistem infeksius HCV. Oleh karena itu, Laboratorium Mikrobiologi dan

Biomedik FK UNS mengadakan penelitian pembuatan plasmid rekombinan

gen HCV, replikon dan sistem infeksius untuk menunjang penelitian HCV

berbasis molekuler di Indonesia. Penelitian epidemiologi molekuler HCV yang

dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Biomedik FK UNS dengan

mengambil sampel dari beberapa daerah di Jawa Tengah mendapatkan isolat

HCV dengan serotipe terbanyak adalah 1a. Oleh karena itu Laboratorium

Mikrobiologi dan Biomedik FK UNS sejak tahun 2010 ini memutuskan untuk

mengkloning HCV 1a terlebih dahulu. Isolat HCV 1a yang ada telah diseleksi

dan diputuskan isolat dengan kode 09IDSKAC-20 yang akan dikloning untuk

pembuatan plasmid gen HCV.

Secara umum gen pengkode protein yang terdapat pada HCV terbagi

menjadi dua yaitu gen pengkode protein struktural dan non-struktural, yang

diketahui salah satunya adalah gen NS4B. Beberapa penelitian yang telah

dilakukan mengarahkan pada teori bahwa NS4B memiliki fungsi penting

dalam siklus HCV dan hal tersebut menarik perhatian peneliti HCV dalam

pengembangan vaksin maupun obat antivirus dengan NS4B sebagai target

utamanya (Lemon et al., 2010). Pembuatan plasmid yang menyandi NS4B

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

3

menjadi sangat penting dalam menunjang penelitian lanjutan mengenai NS4B

tersebut. Gen NS4B akan disubkloning ke dalam vektor pETBlue-1 (Novagen,

Darmstadt, Jerman) sehingga menghasilkan plasmid pET-HCV NS4B. Setelah

gen NS4B tersebut berhasil dikloning, maka diperlukan analisis molekuler.

Analisis molekuler genom HCV pertama kali dilakukan oleh Choo et

al. pada tahun 1989. Hasil penelitian tersebut menunjukkan karakteristik

keseluruhan genom HCV untuk pertama kali. Hasil kloning tersebut menjadi

titik balik pemahaman bahwa produk protein genom HCV, yang dikenal saat

itu sebagai non-A non-B hepatitis virus, dapat diidentifikasi dan dikaji secara

intensif. Kini penelitian mengenai genom virus HCV sudah sangat berkembang

pesat, terlebih pada pengetahuan mengenai struktur topologisnya. Dalam

pembahasan penelitian skripsi, peneliti menitikberatkan pada analisis

molekuler hasil kloning HCV 1a NS4B.

B. Rumusan Masalah

Bagaimana kloning dan analisis molekuler klon gen penyandi protein

NS4B HCV 1a isolat Jawa tengah?

C. Tujuan Penelitan

Tujuan jangka pendek dari penelitian ini adalah mendapatkan plasmid

pET-HCV1a NS4B dan analisis molekuler gen penyandi NS4B virus hepatitis C

1a isolat Jawa Tengah. Sedangkan tujuan jangka panjang dari penelitian ini

adalah sebagai tahap awal dalam pengumpulan koleksi plasmid HCV 1a yang

selanjutnya dapat digunakan dalam pembuatan replikon maupun sistem

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

4

infeksius HCV. Informasi molekuler yang didapatkan dari penelitian ini

berguna sebagai data awal dalam penelitian HCV lanjutan.

D. Manfaat Penelitian

1. Manfaat Teoritis

Penelitian ini dapat memberikan informasi ilmiah mengenai analisis

molekuler gen penyandi protein NS4B virus hepatitis C 1a isolat Jawa

Tengah.

2. Manfaat Praktis

Manfaat praktis penelitian ini adalah didapatkannya plasmid pET-HCV

NS4B isolat Jawa Tengah yang nantinya dapat digunakan sebagai koleksi

plasmid HCV Laboratorium Mikrobiologi dan Biomedik FK UNS.

Plasmid dan analisis molekularnya dapat digunakan langsung sebagai

bahan penelitian lanjutan HCV baik untuk mempelajari strategi replikasi,

patogenesis, diagnosis, terapi, maupun vaksin HCV. Selain itu, plasmid

tersebut dapat pula digunakan sebagai bahan dalam pembentukan replikon

maupun sistem infeksius HCV.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

5

BAB II

LANDASAN TEORI

A. Virus Hepatitis C (HCV)

HCV termasuk dalam famili Flaviviridae dan bergenus Hepacivirus

(ICTVdB Management, 2006). HCV adalah virus penyebab utama penyakit

hepatitis C akut maupun kronis. Pasien hepatitis C kronis sering ditemukan

dalam keadaan asimptomatik. Walaupun dalam keadaan asimptomatik,

proses viremia tetap berlanjut hingga terjadi kerusakan hepar. Kerusakan

hepar baru terlihat ketika dalam keadaan gagal fungsi hepar. Proses

patologis yang berlangsung menyebabkan perubahan susunan histologis

hepar antara lain steatosis, fibrosis, hingga karsinoma hepar (Lemon et al.,

2007).

HCV memiliki genom RNA positif sepanjang kurang lebih 9600

pasang basa. Virus tersebut memiliki Open Reading Frame (ORF) panjang

yang diapit oleh 5’-Untranslated Region (UTR) dan 3’-UTR. Poliprotein

virus yang dihasilkan secara fungsional dapat dibagi menjadi tiga daerah,

yaitu N-terminal, tengah, dan C-terminal. Daerah N-terminal diasosiasikan

dengan daerah penghasil protein struktural yakni protein inti (core/ C),

envelope glycoprotein 1 dan 2 (E1 dan E2). Daerah tengah terdiri dari

protein p7 dan NS2. Daerah C-terminal terdiri dari protein non-struktural

(NS3, NS4A, NS4B, NS5A, dan NS5B) yang dibutuhkan dalam replikasi

RNA (Chevaliez dan Pawlotsky, 2006; Lemon et al., 2007).

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

6

Gambar 1. Struktur Genom Virus Hepatitis C

(Lemon et al., 2007)

Sesuai dengan susunan fungsionalnya, protein C membentuk

nukleokapsid virus yang membungkus materi genetik virus hepatitis C. E1

dan E2 berfungsi sebagai envelope yang dibutuhkan untuk perlekatan dan

tempat masuk virus, sementara protein p7 bertindak sebagai calsium ion

channel. Protein NS2 dikenal sebagai autoprotease di daerah NS2–3. Protein

NS3 memiliki beberapa fungsi antara lain sebagai komponen protease NS2–

3, NS3–4A dan NTPase (helikase). Protein NS4A bertindak sebagai

kofaktor proteinase NS3-4A. Protein NS4B memiliki fungsi menyediakan

daerah perlekatan membran untuk kompleks replikasi virus dan memodulasi

aktivitas RNA-dependent RNA-polymerase (RdRP) dari protein NS5B.

Protein NS5B memiliki aktivitas polimerase RdRP yang penting kaitannya

dalam replikasi virus hepatitis C (Sharma, 2010).

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

7

B. Gen NS4B

Gen penyandi protein non-struktural 4B (NS4B) memiliki berat

molekul sebesar 27 kDa dan merupakan penyandi protein yang sangat

hidrofobik (Aligo et al., 2009; Gouttenoire et al., 2010). Secara topologis,

NS4B terdiri dari tiga bagian yakni C-terminal, tengah, dan N-terminal.

Bagian C-terminal dan N-terminal diyakini terorientasi mengarah pada

bagian sitosol sementara bagian tengah berada di dalam membran retikulum

endoplasma (ER) dan memiliki empat segmen transmembran (Gouttenoire

et al. 2009b, 2010). Secara struktural protein NS4B terbagi menjadi

beberapa domain yakni N-Terminal Domain (NTD) yang berada di daerah

aa 1-69, Transmembran Domain (TMD) yang berada di daerah aa 70-190

dan C-Terminal Domain (CTD) yang berada di daerah aa 191-261

(Gouttenoire et al., 2010). Masing-masing domain memiliki struktur

sekunder dan fungsi spesifik (Lundin et al., 2003).

Gambar 2. Gambaran Skematis Topologi Protein NS4B dalam

Membran Retikulum Endoplasma

(Lemon et al., 2010)

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

8

Fungsi spesifik protein NS4B sejauh ini belum diketahui, namun

beberapa penelitian mengasumsikan bahwa protein NS4B memiliki fungsi

penting dalam mediasi aktivitas virus, antara lain: membentuk kompleks

replikasi HCV yang dinamakan dengan membranous web; bertanggung

jawab dalam modulasi fungsi protein NS5B sebagai RNA-dependent RNA-

polymerase dan berbagai jalur transduksi sinyal sel inang; kemungkinan

berpengaruh dalam proses karsinogenesis; dan lain sebagainya (Gouttenoire

et al., 2010).

NS4B memiliki kemampuan untuk berinteraksi dengan protein HCV

yang lain. Kemampuan tersebut berhubungan dengan fungsi NS4B yang

telah dipostulatkan yakni kemampuan dalam membentuk struktur

membranous web. Hingga kini struktur formasi membranous web tersebut

dipercaya sebagai tempat replikasi RNA HCV. NS4B sendiri merupakan

protein integral yang terdapat dalam membran retikulum endoplasma.

Dalam visualisasi melalui mikroskop elektron, gambaran fusi dari tempat

replikasi HCV berbentuk dot like pattern dan gambaran tersebut terintegrasi

dalam membran retikulum endoplasma sehingga terlihat seperti jejaring

(web). Oleh karena itu, perubahan membran retikulum endoplasma yang

sedemikian rupa dinamakan dengan membranous web (Gouttenoire et al.,

2010).

Mekanisme yang mendasari pembentukan membranous web hingga

kini belum diketahui namun diduga struktur sekunder amphiphatic helix

yang terdapat pada N-terminal maupun C-terminal serta keempat segmen

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

9

transmembran yang terdapat di bagian tengah memiliki peranan yang

signifikan dalam proses pembentukan kompleks replikasi tersebut (Aligo et

al., 2009; Lemon et al., 2010; Gouttenoire et al., 2010).

. Salah satu manifestasi adanya pembentukan kompleks replikasi oleh

protein NS4B adalah terjadinya respons stres pada membran ER. Respons

stres tersebut mengakifkan jalur transduksi sinyal inang yang pada akhirnya

memperparah terjadinya stres pada membran ER. Respon berlebihan pada

membran ER yang disebut dengan EOR (ER overload response)

menyebabkan pelepasan ion kalsium (Ca2+) dari ER ke dalam sitosol.

Perubahan konsentrasi ion Ca2+ di dalam sitosol direspons oleh mitokondria

dengan menangkap ion tersebut sehingga menstimulasi pembentukan

Reactive Oxygen Species (ROS). ROS adalah oksidan potensial penyebab

kanker melalui mekanisme kerusakan oksidatif pada tingkat DNA sehingga

menyebabkan mutagenesis. Penimbunan reaksi mutasi pada sel hepar dapat

menyebabkan keadaan hepatocellular carcinoma (HCC) (Li et al., 2009)

Peranan protein NS4B dalam proses replikasi virus salah satunya

adalah kemampuan protein tersebut dalam memodulasi aktivitas protein

NS5B. Diketahui protein NS5B memiliki aktivitas polimerase yang penting

kaitannya dalam replikasi HCV. Selain NS4B, NS3 juga ditemukan

memiliki fungsi modulasi yang bekerja secara bersamaan dengan NS4B,

namun dalam jalur yang berbeda. NS3 memiliki fungsi helikase yang

memfasilitasi aktivitas NS5B sebagai protein polimerase (Lemon et al.,

2007). Fungsi NS3 tersebut diperkirakan bekerja berlawanan dengan NS4B,

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

10

sehingga dapat dikatakan NS4B merupakan regulator negatif dari aktivitas

NS5B (Sklan dan Glen, 2006; Murayama et al., 2010).

C. Peta Plasmid pETBlue-1

pETBlue-1 merupakan salah satu vektor plasmid ekspresor E. coli

yang dikembangkan oleh Novagen. pETBlue-1 merupakan plasmid sirkuler

yang memiliki panjang 3476 pasang basa. Penomoran sekuens plasmid

pETBlue-1 dimulai dari basa pertama dari sekuens promoter T7. Pada

pETBlue-1 terdapat multiple cloning region di daerah 267-297 diantaranya

oleh enzim EcoR V (278), EcoR I (282) Ava I (291), Sma I (293), dan Srf I

(293). Tempat kloning blunt-end pETBlue-1 tepat berada di belakang daerah

pemotongan enzim EcoR V (Backer et al., 2003; Gaynutdinov et al., 2003).

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

11

Gambar 3. Peta dan Sekuens Vektor Plasmid pETBlue-1

(Backer et al., 2003; Gaynutdinov et al., 2003)

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

12

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Penelitian ini bersifat eksploratif analitik.

B. Lokasi Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran

Universitas Sebelas Maret.

C. Subjek Penelitian

Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat HCV 1a

09IDSKAC-20 hasil penelitian epidemiologi molekuler yang dilakukan

oleh Prasetyo et al. (dalam proses publikasi).

D. Desain penelitian

Analisis molekuler

Purifikasi produk PCR

Isolasi RNA

Sintesis cDNA

Kloning gen dengan PCR

Pembuatan primer

Ligasi dengan plasmid ekspresor

Transformasi ke sel kompeten E. coli

Kultur sel E. coli

Isolasi plasmid

Sekuensing

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

13

E. Instrumentasi Penelitian

1. Alat penelitian

a. centrifuge (Eppendorf, Hamburg, Jerman)

b. thermocycler (Eppendorf, Hamburg, Jerman)

c. micropipet (P1000, P200, P10) (Gilson, Wisconsin, USA)

d. vortex (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)

e. incubator (Memmert, Schwabach, Jerman)

f. bacterial incubator (Memmert, Schwabach, Jerman)

g. incubator shaker (Heidolph, Schwabach, Jerman)

h. waterbath (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)

i. microwave (Panasonic, Osaka, Jepang)

j. deepfreezer (New Brunswick Scientific, New Jersey, USA )

k. tube rack

l. autoclave (Hirayama, Saitama, Jepang)

m. refrigerator (Sharp, Osaka, Jepang)

n. class II safety cabinet (ESCO, Oregon, USA)

o. digital scale (Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland)

p. spreader

2. Bahan penelitian

a. aliquot sampel 09IDSKAC-20

b. filter tips (10 ml, 200 ml dan 1000 ml)

c. microcentrifuge tube

d. PCR tube dan PCR cap

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

14

e. polypropylene (PP) tube 15 ml, 50 ml

f. disposable petri Ø 10 cm

g. glove

h. masker

i. tissue

j. bufer Tris-EDTA (TE)

k. Media Luria Bertani (LB) agar dan cair

l. Glukosa 50 mM

m. Tris-HCl pH 8.0, 25 mM

n. ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 10 mM

o. NaOH 0,2 N

p. SDS 1 %

q. CH3COOH 5 M

r. CH3COOK 5 M

s. phenol-chloroform-isoamylalcohol (25:24:1)

t. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)

u. isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)

v. karbenisilin

w. isopropanol

x. etanol 70 %

y. RNAse free away

z. kit Trizol LS (Invitrogen, California, USA)

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

15

aa. kit SuperScriptTM IIIFirst-StrandSynthesis System for RT-PCR

(Invitrogen, California, USA)

bb. kit AccuPrimeTM Pfx DNA polymerase (Invitrogen, California,

USA)

cc. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Jerman).

dd. pETBlue-1 Perfectly Blunt Cloning Kit (Novagen, Darmstadt,

Jerman)

F. Cara Kerja

1. Desain primer

Desain primer forward dan reverse NS4B yang digunakan

dalam sintesis cDNA menggunakan program FastPCR (Kalendar et al,

2009).

2. Isolasi RNA

Aliquot sampel 09DSKAC-20 dipurifikasi dengan menggunakan

reagen TrizolLS (Invitrogen) dengan protokol sebagai berikut:

a. Menambahkan 0,75 ml reagen Trizol LS ke masing-masing 0,25 ml

sampel, kemudian menginkubasi selama 5 menit dalam suhu

kamar.

b. Menambahkan 0,2 ml chloroform per 0,75 ml reagen Trizol LS.

c. Menutup tube dengan sempurna dan bolak-balik selama kurang

lebih 15 detik, kemudian menginkubasikan selama 2 – 15 menit

dalam suhu kamar. Setelah itu, dilakukan pemusingan dengan

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

16

kecepatan tidak lebih dari 12.000 g selama 15 menit pada suhu 4

OC.

d. Memindahkan fase aqueous ke dalam tube steril, kemudian

mempresipitasi RNA dengan penambahan 0,5 ml isopropyl alcohol

per 0,75 ml reagen Trizol LS yang digunakan.

e. Menginkubasi dalam suhu kamar selama 10 menit kemudian

memusingkan dengan kecepatan 12.000 g selama 10 menit dalam

suhu 4 OC.

f. Membuang supernatan dengan hati-hati, kemudian membilas pelet

RNA dengan menggunakan etanol 70 % dingin sebanyak 1 ml per

0,75 ml reagen Trizol LS yang digunakan.

g. Mencampur sampel dengan vortex, kemudian melakukan

pemusingan dengan kecepatan tidak lebih dari 7.500 g selama 5

menit pada suhu 4 OC.

h. Membuang supernatan dengan hati-hati, lalu mengeringkan dengan

metode air dry.

i. Meresuspensi pelet RNA dengan RNase free water atau larutan

0,5 % SDS dan campurkan dengan perlahan dengan pipetting.

j. Menginkubasi selama 10 menit pada suhu 55 – 60 OC.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

17

3. Sintesis cDNA

Proses sintesis DNA menggunakan SuperScriptTM III First-

Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) dengan protokol

sebagai berikut:

a. masing-masing reagen di-spin down sebelum digunakan.

b. Menambahkan komponen berikut ke dalam PCR tube:

Komponen Jumlah

hingga 5 mg total RNA 0,04 ml

primer 1 ml

dNTP mix 10 mM 1 ml

DEPC-treated water hingga 10 ml

c. Menginkubasi dalam suhu 65 OC selama 5 menit, kemudian

menempatkan ke dalam es sekurang-kurangnya selama 1 menit.

d. Menyiapkan cDNA Synthesis Mix berikut ini ke dalam PCR tube

yang berbeda:

Komponen Jumlah

10X RT buffer 2 ml

MgCl2 25 mM 4 ml

DTT 0,1 M 2 ml

RNaseOUTTM (40 U/ml) 1 ml

SuperScriptTM III RT (200 U/ml) 1 ml

e. Menambahkan 10 ml cDNA Synthesis Mix ke dalam masing-masing

PCR tube yang mengandung RNA, kemudian melakukan pipetting

dengan perlahan untuk mencampur rekasi.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

18

f. Menginkubasi pada suhu 25 OC selama 10 menit, setelah itu

dilanjutkan dengan suhu 50 OC selama 50 menit.

g. Menghentikan reaksi pada suhu 85 OC selama 5 menit, kemudian

mendinginkan ke dalam bak berisi es.

h. Menambahkan 1 ml RNase H pada tiap-tiap tube dan menginkubasi

pada suhu 37 OC selama 20 menit.

i. Hasil sintesis cDNA disimpan dalam suhu – 20 OC.

4. Kloning gen NS4B dengan PCR

Proses kloning DNA menggunakan kit AccuPrimeTM Pfx DNA

polymerase (Invitrogen) dengan protokol sebagai berikut:

a. Menambahkan komponen berikut ke dalam PCR tube dalam suhu

ruangan:

Komponen Jumlah

AccuPrimeTM Pfx Reaction Mix 5 ml

Primer mix (10 mM) 15 ml

Template DNA (44ng) 1 ml

AccuprimeTM Pfx DNA polymerase 1 ml

ddH2O hingga 50 ml

b. Kemudian memasukkan PCR tube tersebut ke dalam thermocycler.

c. Melakukan proses denaturasi pada suhu 95 OC selama 2 menit,

kemudian melakukan 16 siklus PCR sebagai berikut:

Denaturasi: 95 OC selama 15 detik

Annealing: 55 – 64 OC selama 30 detik

Ekstensi: 68 OC selama 1 menit per kilobasa

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

19

d. Mengatur suhu 4 OC setelah siklus selesai. Produk PCR dapat

disimpan pada suhu – 20 OC hingga digunakan.

5. Purifikasi produk PCR

Produk reaksi PCR yang dihasilkan dipurifikasi kembali

sehingga produk PCR terbebas dari sisa reaksi PCR. Proses purifikasi

menggunakan QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) dengan

protokol sebagai berikut:

a. Menambahkan 5 volume bufer PB dengan 1 volume produk PCR,

kemudian mencampurkan dengan pipetting.

b. Menempatkan QIAquick spin column pada collection tube 2 ml.

c. Memindah produk PCR ke dalam QIAquick spin column dan

melakukan pemusingan selama 30 – 60 detik pada kecepatan

13.000 rpm.

d. Membuang cairan yang terdapat dalam collection tube dan

menempatkan kembali collection tube ke QIAquick spin column.

e. Menambahkan 0,75 ml bufer PE ke dalam QIA quick spin collumn

dan melakukan pemusingan selama 30 – 60 detik pada kecepatan

13.000 rpm.

f. Membuang cairan yang yang terdapat dalam collection tube dan

menempatkan kembali collection tube ke QIAquick spin collumn.

g. Melakukan pemusingan kembali selama 1 menit pada kecepatan

13.000 rpm kemudian membuang collection tube.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

20

h. Menempatkan QIAquick spin column pada microcentrifuge tube 1,5

ml steril.

i. Untuk melarutkan DNA, tambahkan 50 ml bufer EB (TrisCl, pH

8.5, 10 mM) ke dalam QIAquick spin column dan melakukan

pemusingan selama 1 menit pada kecepatan 13.000 rpm.

j. DNA telah terpurifikasi dan siap untuk dielektroforesis.

6. Ligasi cDNA dengan plasmid ekspresor

Produk PCR diligasi dengan pETBlue-1 blunt vector (Novagen)

sehingga membentuk DNA rekombinan dengan protokol sebagai

berikut:

a. Menambahkan ke dalam produk PCR yang telah terpurifikasi 1 ml

blunt vector dan 1 ml T4 DNA Ligase, kemudian mencampur

dengan pipetting secara perlahan dan hati-hati.

b. Menginkubasi pada suhu 22 OC selama 15 menit.

7. Transformasi DNA rekombinan ke sel kompeten

DNA rekombinan kemudian ditransformasikan ke dalam sel

kompeten E. coli (NovaBlue competent cells) dengan metode heat

shock:

a. Memindahkan tube sel kompeten E. coli dari freezer sesegera

mungkin ke dalam es dan memastikan seluruh tube masuk ke dalam

es kecuali tutup tube. Biarkan sel tersebut mencair di dalam es

selama 2 – 5 menit.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

21

b. Setelah sel mencair, tapping 1 – 2 kali secara manual dengan lembut

untuk meresuspensi sel kompeten.

c. Meletakkan beberapa microcentrifuge tube 1,5 ml yang dibutuhkan

ke dalam es, kemudian membuat aliquot sel sebanyak 20 ml pada

masing-masing tube.

d. Melakukan tapping dengan lembut untuk mencampurkan dan

mengembalikan tube ke dalam es.

e. Menambahkan 1 ml hasil reaksi ligasi atau plasmid DNA yang telah

dipurifikasi secara langsung ke dalam sel kompeten, kemudian

melakukan tapping secara perlahan dan mengembalikan tube ke

dalam es. Pastikan seluruh bagian tube tertutupi oleh es kecuali pada

bagian tutup tube.

f. Menginkubasi tube tersebut di dalam es selama 5 menit.

g. Memanaskan tube secara cepat di dalam waterbath dengan suhu

42 OC selama 30 detik tanpa dikocok.

h. Kembali menempatkan tube di es selama 2 menit.

i. Menambahkan 250 ml medium SOC suhu kamar ke dalam setiap

tube. Pertahankan tube di dalam es hingga seluruhnya mendapatkan

SOC.

8. Kultur Sel

Kultur sel dilakukan dalam media LB agar (yang mengandung

50 mg/ml karbenisilin, 70 µg/ml X-gal dan 80 µM IPTG) untuk

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

22

menyeleksi sel kompeten yang memiliki insert DNA rekombinan,

kemudian dilanjutkan dengan kultur dalam media LB cair:

a. Mempersiapkan beberapa plate media agar LB.

b. Menempatkan 1, 2, 5, 10, 50, 250 ml sel kompeten pada setiap plate.

c. Menggunakan spreader steril untuk meratakan sel kompeten hingga

terdistribusi secara merata di seluruh permukaan plate. Lalu

menempatkan plate menghadap ke atas di dalam suhu ruangan

selama 15 menit.

d. Menginkubasi plate di dalam inkubator dengan cover plate

menghadap ke bawah dan mengatur suhu temperatur inkubator 37

OC dalam waktu 15–18 jam.

e. Mengambil koloni berwarna putih dan langsung menempatkan ke

dalam media LB cair 2 ml pada PP tube 15 ml.

f. Menginkubasi pada suhu 37 OC dalam waktu 15–18 jam.

9. Isolasi plasmid

Isolasi plasmid menggunakan teknik minipreparasi metode

Chen-Okayama yang telah dimodifikasi oleh Prasetyo (2008).

a. Memindahkan sel kompeten dalam media cair tersebut ke

microcentrifuge tube (1,5 ml), melakukan pemusingan 14.000 rpm

selama 1 menit, lalu membuang supernatan.

b. Menambahkan 0,1 ml larutan I (glukosa 50 mM, Tris-HCl pH 8.0

25 mM, EDTA 10 mM), kemudian mencampur dengan vortex

selama 1 menit sampai sel kompeten teresuspensi sempurna.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

23

c. Menambahkan 0,2 ml larutan II (NaOH 0,2 N, SDS 1 %), tanpa

melakukan vortex.

d. Menambahkan 0,15 ml larutan III (2 bagian CH3COOH 5 M + 3

bagian CH3COOK 5 M), kemudian mencampur dengan vortex

selama 1 menit.

e. Menambahkan 0,1 ml phenol-chloroform-isoamylalcohol (25:24:1),

kemudian mencampur dengan vortex selama 1 menit.

f. Melakukan pemusingan dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3

menit hingga didapatkan dua lapisan cairan.

g. Memindah 0,42 ml cairan di lapisan atas (warna jernih) ke

microcentrifuge tube yang baru. Sisa cairan jernih dan lapisan

dibawahnya dapat dibuang.

h. Menambahkan 0,5 ml isopropanol ke dalam 0,42 ml cairan di atas,

kemudian mencampur dengan cara membolak-balikkan

microcentrifuge tube tersebut.

i. Melakukan pemusingan dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10

menit, kemudian membuang supernatan.

j. Mencuci dengan etanol 70 % dingin.

k. Melakukan pemusingan dengan kecepatan 14.000 rpm selama 5

menit, kemudian membuang supernatan.

l. Mengeringkan dengan alat vakum atau membalik microcentrifuge

tube tersebut sampai semua etanol terbuang dan menguap.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

24

m. Melarutkan DNA dengan 0,1 ml TE (Tris-HCl pH 7.5 10 mM,

EDTA 1 mM) yang sudah ditambahkan RNaseA, kemudian

memasukkan ke inkubator dengan suhu 37 OC selama 30 menit.

n. Plasmid DNA siap dianalisis dengan menggunakan enzim restriksi

dan atau sekuensing.

10. Sekuensing

Sekuensing plasmid menggunakan primer pETBlue UP primer

dan pETBlue DOWN primer (Novagen).

G. Analisis Data

Data sekuens yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan

aplikasi MEGA4 (Tamura et al., 2007) dan ClustalW (Thompson et al.,

1994).

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

25

BAB IV

HASIL PENELITIAN

Isolat yang digunakan dalam penelitian kloning ini adalah isolat hasil

penelitian epidemiologi blood borne virus yang dilakukan oleh Prasetyo et al.

(dalam proses publikasi). Sebanyak 513 sampel terkumpul dalam penelitian

tersebut dan 140 sampel diantaranya memiliki anti-HCV (+). Dari 140 sampel

dengan anti-HCV (+) kemudian dilakukan deteksi molekuler melalui RT-

PCR untuk mengamplifikasi sebagian daerah E1-E2 dan NS5B dengan

menggunakan teknik PCR nested. Produk PCR tersebut kemudian

disekuensing dan didapatkan hasil subtipe isolat terbanyak adalah 1a. Oleh

karena itu, kloning keseluruhan genom dimulai dari subtipe 1a. Pemilihan

kandidat isolat kloning dilakukan dengan skreening isolat subtipe 1a yang

memiliki kriteria tidak terdapat koinfeksi dengan virus lain, titer RNA HCV

lebih dari 105 kopi/ml, hasil sekuensing isolat tersebut ‘relatif bersih’ dan

tidak terdapat beda interpretasi hasil sekuensing di antara regio E1-E2 dengan

NS5B. Sesuai dengan kriteria tersebut didapatkan kandidat isolat terbaik

adalah isolat 09IDSKAC-20.

A. Desain Primer

Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi regio spesifik NS4B

didesain dengan program FastPCR. Desain primer dimulai dengan

mengumpulkan seluruh data complete coding sequence HCV 1a untuk gen

pengkode protein NS4B dari GenBank. Seluruh sekuens tersebut diunduh

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

26

dari GenBank dengan keywords “Hepatitis C virus 1a complete coding

sequence”. Melalui keywords tersebut didapatkan 395 sekuens. Kemudian

gen NS4B secara spesifik dilakukan penyejajaran dengan program ClustalW.

Hasil penyejajaran tersebut lebih dispesifikkan pada 30 nukleotida awal dan

30 nukleotida akhir untuk diketahui konsensus nukleotida awal dan akhir

(lampiran 1). Konsensus tersebut kemudian dimasukkan ke dalam program

FastPCR untuk dianalisis.

Hasil analisis konsensus FastPCR didapatkan pasangan primer terbaik

yakni primer forward NS4B HCV 1a 5’-ATG TCB CAR CAC YTA CCR

TAC ATC G.-3’ dan primer reverse NS4B HCV 1a 5’-TTA GCA CAH GGR

GTR GHR BWM TCC G-3’. Pada primer tersebut ditambahkan initial codon

pada primer forward NS4B HCV 1a dan stop codon pada primer reverse

NS4B HCV 1a agar klon gen NS4B dapat diekspresikan oleh plasmid vektor

pETBlue-1. Dari analisis program FastPCR (lampiran 2), tidak didapatkan

adanya primer dimer yang berarti tidak terdapat daerah yang saling

berkomplementari pada sepasang primer tersebut di atas. Daerah yang saling

berkomplementari sangat mengganggu proses annealing dan dapat

menurunkan efisiensi PCR.

B. Purifikasi RNA HCV

RNA isolat 09IDSKAC-20 dipurifikasi kembali dari aliquot plasma

menggunakan kit TrizolLS® (Invitrogen). Proses isolasi RNA dilakukan

sesuai dengan protokol. Hasil analisis spektrofotometri didapatkan

konsentrasi RNA HCV yang terpurifikasi sebesar 76 ng/µl dalam volume

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

27

total 50 µl. RNA HCV tersebut memiliki nilai absorbansi 260/280 nm sebesar

1,91 yang berarti hasil purifikasi RNA sudah baik dari segi kualitas maupun

kuantitas dan dapat dilakukan manipulasi molekuler selanjutnya.

C. Sintesis cDNA HCV

Setelah RNA HCV 09IDSKAC-20 terpurifikasi, cDNA isolat

09IDSKAC-20 disintesis menggunakan kit SuperScriptsTM III First-Strand

Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) sesuai protokol. Hasil analisis

spektrofotometri didapatkan konsentrasi cDNA HCV 09IDSKAC-20 sebesar

44 ng/µl dalam volume total 20 µl. Produk RT-PCR tersebut memiliki nilai

absorbansi 260/280 nm sebesar 1,87. Interpretasi hasil spektrofotometri

tersebut menunjukkan bahwa produk RT-PCR tersebut memiliki kualitas dan

kuantitas yang baik.

D. Kloning Gen NS4B dan Purifikasi Produk PCR

Produk RT-PCR kemudian diamplifikasi lebih lanjut menggunakan kit

AccuPrimeTM Pfx DNA polymerase (Invitrogen). AccuPrimeTM Pfx DNA

polymerase digunakan dengan tujuan agar produk PCR memiliki ujung

tumpul, oleh karena produk PCR tersebut akan diligasikan dengan vektor

plasmid pETBlue-1 yang menghendaki insert berujung tumpul. Primer yang

digunakan dalam kloning gen melalui proses PCR tersebut adalah primer

forward dan reverse HCV 1a hasil analisis FastPCR. Kondisi PCR yang telah

dianalisis dengan FastPCR telah diuji secara empirik. PCR dilakukan dengan

kondisi paling optimum pada:

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

28

denaturasi awal 95 OC selama 2 menit

denaturasi 95 OC selama 15 detik

annealing 55 OC selama 30 detik

elongasi 68 OC selama 10 menit

Proses PCR tersebut dilakukan selama 16 siklus dan pada akhir siklus

ditambahkan proses elongasi akhir pada 72 OC selama 10 menit.

Produk PCR kemudian dipurifikasi kembali dengan menggunakan

QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) sesuai dengan protokol kit.

Purifikasi tersebut bertujuan untuk membersihkan produk PCR dari sisa

reagen PCR. Hasil analisis spektrofotometri didapatkan produk PCR yang

terpurifikasi tersebut memiliki konsentrasi sebesar 113 pg/µl dalam volume

total 20 µl. Nilai absorbansi 260/280 nm produk PCR yang telah terpurifikasi

adalah 1,83. Hal tersebut menunjukkan bahwa produk PCR telah terpurifikasi

dengan baik dari segi kualitas maupun kuantitasnya.

E. Ligasi dengan Plasmid Vektor pETBlue-1 dan Transformasi ke Sel

Kompeten E. coli

Produk PCR yang telah terpurifikasi kemudian diligasikan ke dalam

plasmid vektor pETBlue-1 (Novagen) dengan menggunakan enzim T4 ligase.

Setelah plasmid rekombinan pETBlue1-HCV1a NS4B terbentuk, plasmid

yang berbentuk sirkuler tersebut kemudian ditransformasikan ke dalam sel

kompeten E. coli (Novagen) dengan metode heat shock.

Bakteri hasil transfeksi kemudian dikultur di dalam media LB agar

yang mengandung karbenisilin, X-Gal, dan IPTG. Kultur dalam media padat

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

29

difungsikan untuk seleksi sel kompeten yang mengandung plasmid

rekombinan hasil transfeksi. Sel kompeten yang mengandung plasmid

rekombinan pETBlue1-HCV1a NS4B akan berwarna putih. Sel kompeten

yang mengandung plasmid rekombinan kemudian dikultur kembali dalam

media LB cair selama 18 jam.

F. Isolasi Plasmid

Setelah perbanyakan plasmid pETBlue1-HCV1a NS4B secara in vivo,

plasmid tersebut diisolasi kembali dengan metode Chen-Okayama yang telah

dimodifikasi oleh Prasetyo (2008). Hasil isolasi plasmid kemudian dianalisis

dengan spektrofotometri dan dihasilkan nilai absorbansi 260/280 nm sebesar

1,85 serta konsentrasi sebesar 94 ng/µl dalam volume total kurang lebih 100

µl. Hal ini menunjukkan bahwa plasmid DNA berhasil diekstrak dengan

kuantitas dan kualitas yang cukup baik.

G. Sekuensing dan Analisis Molekuler

Dalam usaha mendapatkan informasi molekuler dari plasmid yang

telah terpurifikasi, maka dilakukan proses sekuensing. Sekuensing plasmid

pETBlue1-HCV1a NS4B dilakukan oleh FirstBase (Singapura). Hasil

sekuensing tersebut kemudian dianalisis menggunakan program CLC

Sequence Viewer dan MEGA4. Sekuens nukleotida dan asam amino isolat

09IDSKAC-20 terdapat pada lampiran 3-5. Sekuens isolat tersebut

kemudian disejajarkan kembali dengan seluruh sekuens HCV 1a NS4B yang

telah dilaporkan di GenBank menggunakan ClustalW (lampiran 6-7).

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

30

Analisis molekuler dilakukan di dua tempat, yakni dari sekuens isolat

09IDSKAC-20 dan dari hasil penyejajaran isolat 09IDSKAC-20 dengan

seluruh sekuens HCV 1a NS4B yang telah dilaporkan di GenBank (sebanyak

395 sekuens). Beberapa area residu asam amino hasil kloning HCV 1a NS4B

kemudian diidentifikasi sesuai dengan susunan topologi dari HCV NS4B

yang telah dilaporkan sebelumnya. Lebih jauh, peneliti juga melakukan

analisis motif dan mutasi titik pada susunan residu asam amino HCV 1a

NS4B yang diketahui terkonservasi dengan baik.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

31

BAB V

PEMBAHASAN

A. Daerah N-Terminal Domain (NTD) NS4B HCV

N-Terminal Domain (NTD) diketahui sebagai area yang memiliki

variasi paling tinggi di antara ketiga domain yang terdapat pada HCV NS4B.

NTD memiliki dua struktur sekunder yakni struktur amphiphatic α-helix 1 dan

2 (lampiran 8). Penelitian Gouttenoire et al. (2010) melaporkan bahwa NTD

amphiphatic α-helix 2 merupakan faktor penentu utama dalam proses

oligomerisasi. Area NTD amphiphatic α-helix 2 diketahui terkonservasi secara

baik sehingga apabila terjadi mutasi pada daerah tersebut, fungsi oligomerisasi

pada amphiphatic α-helix 2 akan terhambat. Gangguan fungsi oligomerisasi

ini akan menghambat pembentukan membranous web sebagai tempat replikasi

dari RNA HCV. Perubahan residu amino aromatik pada sisi amphiphatic α-

helix 2 NTD (Trp43, Phe49, Trp50, Trp55, Phe57 dan Tyr63) yang menjadi asam

amino Alanine (A) dapat menghentikan proses pembentukan membran dan

mengganggu pembentukan kompleks replikasi fungsional HCV (Gouttenoire

et al., 2009a). Dalam sekuens isolat 09IDSKAC-20 tidak didapatkan mutasi

Alanine pada aa aromatik amphiphatic α-helix 2 NTD. Oleh karena itu, proses

pembentukan membranous web yang salah satunya diinduksi amphiphatic α-

helix 2 NTD pada isolat 09IDSKAC-20 tidak terganggu. Hasil penyejajaran

seluruh isolat NS4B HCV 1a yang telah dilaporkan di GenBank didapatkan

Tyr43, Tyr50, Tyr55, Phe57 dan Tyr63 terkonservasi secara sempurna sedangkan

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

32

pada posisi aa 49 dapat terjadi variasi Phenylalanine atau atau Leucine. Hal

tersebut menunjukkan bahwa seluruh isolat NS4B HCV 1a yang telah

dilaporkan di GenBank kemungkinan memiliki kemampuan fungsional

integrasi membran yang memadai.

Dalam struktur amphiphatic α-helix NTD terdsapat suatu motif yang

diduga terkonservasi sempurna di seluruh genotipe HCV, yakni N-Terminal

basic Leucine Zipper (bZIP). Struktur tersebut dibentuk oleh formasi α-helix

di dalam struktur coiled-coil. Pada aa 22-49 ditemukan adanya daerah

pengulangan setiap tujuh residu selama empat kali. Residu tersebut

dikarakteristikkan sebagai motif bZIP. Tujuh residu tersebut kemudian diberi

identitas ‘a’ hingga ‘g’. Fungsi dari motif bZIP masih belum dimengerti

secara keseluruhan, namun diduga motif bZIP memiliki peran penting dalam

proses interaksi antar protein yang terdapat dalam HCV. Model struktural

bZIP yang dipublikasikan oleh Welsch et al. (2007) menunjukkan adanya inti

hidrofobik Leu yang terkonservasi sempurna di aa 25 dan 46 (lampiran 9).

Sementara itu, residu pada posisi a dan d bersifat non-polar. Posisi a dan d

tersebut diketahui berfungsi membantu pembentukan inti struktur hidrofobik

bZIP.

Pada isolat 09IDSKAC-20 didapatkan inti fungsional motif bZIP adalah

Leu25 dan Leu46. Oleh karena itu, inti fungsional bZIP pada isolat tersebut

baik. Sementara pada hasil penyejajaran seluruh sekuens isolat HCV 1a NS4B

yang telah dilaporkan di GenBank didapatkan adanya kemungkinan variasi

pada inti fungsional bZIP tersebut, yakni L25M dan L46(I/F/V). Hal tersebut

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

33

menarik, mengingat inti struktural bZIP merupakan suatu titik aa yang secara

teoritis seharusnya terkonservasi sempurna sesuai dengan peran pentingnya

dalam proses interaksi antar protein HCV. Perlu adanya pembuktian

laboratorium lebih lanjut mengenai implikasi yang ditimbulkan dari variasi

tersebut.

Dalam isolat HCV 09IDSKAC-20, posisi a dan d pada motif bZIP

memiliki residu a1 Leu22, d1 Leu25, a2 Ser29, d2 Ala32, a3 Ala36, d3 Val39, a4

Trp43, dan d4 Leu46 (pola asam amino motif bZIP pada isolat 09IDSKAC-20

terdapat dalam lampiran 10). Keseluruhan residu a dan d pada motif tersebut

merupakan asam amino non-polar, kecuali pada susunan a2 didapatkan residu

polar yakni Ser29 (sifat polaritas beserta tata nama asam amino terdapat dalam

lampiran 11). Perubahan salah satu asam amino yang seharusnya non-polar

menjadi polar tersebut belum diketahui pengaruhnya dalam susunan struktural

maupun fungsional dari motif bZIP.

Salah satu asam amino penting yang terdapat dalam motif bZIP adalah

Gln26. Mutasi pada Gln26 dilaporkan dapat mempengaruhi fungsi NS4B secara

keseluruhan dan berkontribusi terhadap resistensi interferon-α (Namba et al.,

2004). Tidak terdapat perubahan pada Gln26 pada sekuens isolat 09IDSKAC-

20 yang berarti isolat tersebut masih berespons terhadap interferon-α dan tidak

memiliki perubahan fungsional protein NS4B. Namun pada hasil penyejajaran

seluruh isolat NS4B HCV 1a yang diperoleh dari GenBank, didapatkan

kemungkinan variasi berupa Q26(H/R). Mutasi pada beberapa isolat HCV 1a

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

34

tersebut kemungkinan memiliki konsekuensi adanya resistensi terhadap

respons pemberian interferon-α.

B. Daerah Transmembrane Domain (TMD) NS4B HCV

Kemampuan protein NS4B dalam membentuk struktur membranous

web didukung oleh segmen TMD. Hingga kini diyakini terdapat empat – lima

segmen transmembran (TM) dalam protein NS4B (Welsch et al., 2007).

Empat segmen TM tersebut terletak di aa 72-92, 101-121, 136-156 dan 172-

197 (Gouttenoire et al., 2010). Segmen kelima, Nucleotide-binding Motif

(NBM), terdapat di daerah antara segmen TM kedua dan ketiga, yakni pada

aa 129-135 dengan konsensus motif GXXXXGK. NBM tersebut diketahui

berfungsi mengikat dan menghidrolisis GTP dan terkonservasi sempurna

pada semua isolat HCV. Gangguan atau mutasi NBM menyebabkan

kerusakan fungsi pengikatan dan hidrolisis GTP sehingga pada akhirnya

menghambat proses replikasi RNA HCV (Einav et al., 2004). Einav et al.

(2004) memperkenalkan GSIGLGK sebagai konsensus NBM NS4B pada

HCV. Sementara itu, sekuens NBM pada isolat 09IDSKAC-20 memiliki

susunan motif GSVGLGK. Susunan G dan GK pada awal dan akhir motif

NBM tidak menunjukkan adanya mutasi sehingga fungsi dari NBM pada

isolat HCV tersebut tidak berubah. Namun perbedaan terhadap konsensus

NBM NS4B HCV pada I131V belum diketahui implikasinya terhadap

perubahan fungsi dari NBM. Pada hasil penyejajaran seluruh isolat HCV 1a

NS4B yang telah dilaporkan di GenBank didapatkan kemungkinan variasi

sekuens motif NBM yakni (G/S)(S/G)(V/I)(G/T)L(G/R)K sehingga memiliki

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

35

konsensus XXXLXK. Variasi konsensus motif tersebut masih belum

diketahui implikasinya dalam fungsional NBM sehingga memerlukan

penelitian lebih lanjut.

Residu Gly129 merupakan asam amino yang selalu terkonservasi,

bahkan pada protein NS4B virus Flaviviridae yang lain. Mutasi G129V

mengganggu fungsi pengikatan GTP NBM. Mutasi ganda pada G129V dan

I131N menurunkan ekspresi NBM pada protein NS4B (Einav et al., 2004).

Pada isolat 09IDSKAC-20 didapatkan aa 129 berupa Glycine yang berarti

tidak terjadi mutasi pada residu tersebut, namun pada posisi aa 131 ditempati

oleh asam amino Valine (I131V). Sementara itu, hasil penyejajaran pada

seluruh sekuens HCV 1a NS4B menunjukkan variasi berupa G129S dan

I131V. Mutasi pada I131V belum diketahui implikasinya terhadap fungsi dari

motif NBM, mengingat aa 131 pada hampir seluruh sekuens HCV 1a NS4B

yang telah terlaporkan di GenBank ditempati oleh asam amino Valine (hanya

satu isolat yang memiliki residu Isoleucine di aa 131). Implikasi dari mutasi

tersebut memerlukan studi lebih lanjut.

Mutasi lain dalam NBM adalah K135(S/R) (Einav et al., 2004).

Perubahan pada posisi tersebut meniadakan fungsi GTPase pada NBM.

Dalam isolat 09IDSKAC-20 pada posisi aa 135 didapatkan asam amino

Lysine (K) dan pada penyejajaran seluruh sekuens HCV 1a NS4B posisi

tersebut terkonservasi sempurna dengan asam amino Lysine. Hal ini

menambah bukti pentingnya residu Lys135 pada NBM.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

36

C. Daerah C-Terminal Domain (CTD) NS4B HCV

Daerah C-Terminal Domain (CTD) merupakan daerah yang sangat

terkonservasi dan berada di aa 191-261. Daerah tersebut dilaporkan memiliki

sebuah struktur amphiphatic α-helix dan dua tempat palmitoylation

(perubahan lemak). Struktur amphiphatic α-helix pada CTD berfungsi

membantu segmen TMD dalam pembentukan struktur membranous web.

Struktur sekunder amphiphatic α-helix CTD berada di residu aa 229-253.

Dalam struktur tersebut didapatkan empat asam amino Leucine (L) yang

diduga terkonservasi sempurna yakni Leu237, Leu240, Leu246 dan Leu249.

Mutasi pada asam amino Leucine tersebut menyebabkan kerusakan sifat

hidrofobik pada keseluruhan struktur amphiphatic α-helix CTD. Mutasi

penuh dari keempat Leucine menyebabkan hilangnya kemampuan NS4B

dalam membentuk membranous web (Gouttenoire et al., 2009a). Pada

sekuens isolat 09IDSKAC-20, tidak ditemukan adanya mutasi pada keempat

residu leucine di Leu237, Leu240, Leu246 dan Leu249. Hal tersebut menunjukkan

tidak ada perubahan sifat hidrofobik dari struktur sekunder amphiphatic α-

helix CTD sehingga fungsi struktur tersebut tidak terganggu. Sementara pada

hasil penyejajaran seluruh sekuens HCV 1a NS4B yang telah dilaporkan di

GenBank, didapatkan data bahwa Leu237 dan Leu240 terkonservasi secara

sempurna di seluruh isolat. Namun didapatkan variasi berupa L246M dan

L249I pada hasil penyejajaran tersebut. Mutasi parsial yang terjadi dari

keempat residu Leucine tersebut kemungkinan akan berdampak pada

penurunan efisiensi struktur sekunder amphiphatic α-helix CTD karena

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

37

kemungkinan terdapat perubahan sifat hidrofobik dari struktur sekunder

tersebut (Gouttenoire et al., 2009a).

Struktur helix (H2) CTD diketahui berhimpitan dengan struktur

amphiphatic α-helix CTD di aa 236-253. Struktur tersebut sangat penting

kaitannya dengan kemampuan replikasi HCV karena mutasi pada struktur H2

dapat merusak kemampuan RNA HCV untuk bereplikasi (Guillen et al.,

2010). Konsensus sekuens H2 yang ditemukan oleh Guillen et al. (2010) pada

HCV 1a adalah ILSSLTVTQLLRRLHQWI. Pada isolat 09IDSKAC-20

daerah aa 236-253 berupa ILSSLTVTQLLRRLHQWI. Susunan asam amino

tersebut sesuai dengan konsensus sekuens H2 HCV 1a. Namun, pada

penyejajaran seluruh sekuens HCV 1a NS4B didapatkan adanya

kemungkinan variasi yakni S238(T/G), S239(N/G), V242M, L246M,

R247M, L249I, Q251(D/E/S) dan I235 (L/V). Hanya Ile236, leu237, Leu240,

Thr241, Thr243, Gln244, Leu245, Arg248, His250 dan Trp252 yang terkonservasi

sempurna sehingga mungkin konsensus sekuens H2 HCV 1a NS4B

seharusnya ILXXLTXTQLXXRXHXWX berbeda hasil konsensus H2 yang

telah dilaporkan sebelumnya.

Dua asam amino yang memiliki fungsi penting dan diduga

terkonservasi sempurna di daerah CTD yakni Val233 dan Leu237 (Aligo et al.,

2009). Dua asam amino tersebut merupakan salah satu faktor penentu

pembentukan formasi membranous web. Mutasi pada kedua asam amino

tersebut dapat mengubah distribusi subselular protein NS3 dan NS5A

sehingga proses pemotongan maupun ekspresi dari protein NS4B menjadi

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

38

terhambat. Pada sekuens isolat 09IDSKAC-20 posisi tersebut tetap ditempati

oleh Val233 dan Leu237. Sementara pada hasil penyejajaran dengan seluruh

sekuens HCV 1a NS4B dari GenBank juga didapatkan Val233 dan Leu237

terkonservasi secara sempurna. Hal tersebut menandakan bahwa kedua residu

Val233 dan Leu237 memiliki peran yang sangat penting dalam ekspresi protein

NS4B.

Protein NS4B memiliki kemampuan memodifikasi struktur lipid yang

dinamakan dengan palmitoylation. Selain itu, NS4B juga diketahui memiliki

kemampuan polimerisasi. Struktur penentu dari proses polimerisasi ini

terdapat di daerah NTD, namun proses palmitoylation yang terdapat di CTD

juga berpengaruh secara signifikan dalam proses polimerisasi. Modifikasi

lipid dan polimerisasi merupakan dua kemampuan utama dari NS4B untuk

menginduksi struktur membran yang digunakan sebagai tempat replikasi

RNA HCV (Yu et al, 2006). Tempat palmitoylation protein NS4B terletak

pada Cys257 dan Cys261 di CTD dengan Cys257 sebagai tempat palmitoylation

utama. Penelitian Yu et al. (2006) menunjukkan residu Cys257 dan Cys261

menyebabkan perubahan atau modifikasi lipid yang sangat penting kaitannya

dengan interaksi antar protein dalam pembentukan kompleks replikasi RNA

HCV. Cys261 terkonservasi dengan sangat baik oleh karena merupakan tempat

yang dikenal oleh protein NS3 protease sebagai tempat pemotongan. Cys257

yang merupakan tempat palmitoylation utama terkonservasi sempurna pada

HCV dengan genotipe 1, 2 dan 4. Konsensus sekuens tempat palmitoylation

pada HCV dengan subtipe 1a adalah CTTPC (Yu et al., 2006).

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

39

Sekuens isolat 09IDSKAC-20 menunjukkan pada aa 257 dan aa 261

berupa Cysteine sehingga mengindikasikan bahwa fungsi dari kedua tempat

palmitoylation tersebut tidak berubah. Sekuens isolat 09IDSKAC-20 juga

menunjukkan sekuens CTTPC pada aa 257-261 sesuai dengan konsensus

sekuens yang dilaporkan oleh Yu et al. (2006). Namun, pada penyejajaran

seluruh isolat HCV 1a NS4B didapatkan variasi C257(S/Y/T) sementara

Cys261 terkonservasi sempurna pada seluruh isolat. Mutasi Cys257 pada

beberapa isolat tersebut dapat merubah fungsi palmitoylation NS4B karena

Cys257 diketahui sebagai tempat palmitoylation utama protein NS4B. Cys261

yang terkonservasi secara sempurna pada seluruh isolat HCV 1a

menunjukkan bahwa tempat tersebut memiliki fungsi yang sangat penting

dalam kaitannya dengan pengenalan oleh protein NS3 protease sebagai

tempat pemotongan. Penyejajaran yang dilakukan pada seluruh sekuens HCV

1a NS4B dari GenBank didapatkan variasi berupa (C/S/Y/T)(T/A/D/V/S/M)

(T/A)PC sehingga memiliki konsensus XXXPC. Hanya dua tempat yang

terkonservasi sempurna yakni Pro260 dan Cys261 pada konsensus sekuens

tersebut. Hal ini tidak selaras dengan motif sekuens yang dilaporkan oleh Yu

et al. (2006) dan perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap variasi pada

residu-residu tersebut.

Jones et al. (2009) melaporkan bahwa mutasi N216A dapat

meningkatkan titer antibodi virus lima hingga enam kali pada strain JFH1.

Pada isolat 09IDSKAC-20 didapatkan residu Asn216 yang berarti tidak

terdapat adanya mutasi. Sementara itu, pada hasil penyejajaran seluruh

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

40

sekuens HCV 1a NS4B yang telah dilaporkan di GenBank didapatkan residu

Asn216 terkonservasi sempurna pada seluruh isolat. Hal tersebut menandakan

pentingnya residu Asn216 tersebut dalam mekanisme replikasi HCV.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

41

BAB VI

SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Gen NS4B HCV isolat 09IDSKAC-20 telah berhasil dikloning dan

plasmid pETBlue1-HCV1a NS4B telah didapatkan. Hasil sekuensing gen

tersebut telah dianalisis bersama dengan seluruh gen NS4B isolat HCV 1a

yang dilaporkan di GenBank sejumlah 395 sekuens. Hasil analisis molekuler

adalah sebagai berikut:

1. Isolat 09IDSKAC-20 memiliki sekuens asam amino NS4B yang konsisten

dengan konsensus yang telah dikenal sebelumnya kecuali pada posisi

Ser29. Implikasi perubahan pada posisi tersebut masih belum diketahui.

2. Hasil penyejajaran gen NS4B isolat 09IDSKAC-20 bersama dengan gen

NS4B seluruh isolat yang telah dilaporkan di GenBank menunjukkan data

baru bahwa terdapat beberapa kemungkinan variasi pada:

a. Daerah N-terminal domain (NTD)

1) inti hidrofobik motif bZIP: L25M dan L46(I/F/V)

2) Q26(H/R)

b. Daerah Transmembrane domain (TMD)

1) Nucleotide Binding Motif HCV 1a: XXXXLXK.

c. Daerah C-terminal domain (CTD)

1) Terdapat variasi dua residu Leucine pada struktur amphiphatic α-

helix 1: L246M dan L249I.

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

42

2) konsensus sekuens H2 pada NS4B HCV 1a: ILXXLTXTQLXXR

XHXWX.

3) variasi pada tempat palmitoylation utama NS4B: C257(S/Y/T).

4) motif tempat palmitoylation NS4B HCV 1a: XXXPC.

B. Saran

1. Perlu dilakukan induksi protein dilanjutkan dengan Western Blotting untuk

analisis ekspresi protein plasmid pETBlue1-HCV1a NS4B.

2. Perlu dilakukan penyejajaran sekuens HCV NS4B pada genotipe HCV

lainnya sehingga didapatkan informasi molekuler yang lebih luas.

3. Beberapa variasi asam amino yang didapatkan dalam penelitian ini perlu

dilakukan penelitian lebih lanjut dalam usaha mengetahui implikasi variasi

tersebut terhadap virulensi, patogenesis, replikasi, kekebalan terhadap

regimen obat tertentu dan lain sebagainya.