MAKALAH METODA PEMISAHAN

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Preparatif dan Metoda Densitometri

Disusun Oleh

Kelompok 7

1. Ayu Nurliansari 12482010

2. Agus Riauzi 12482010

3. Olivia 12482010

4. Sri Pitasari 1248201064

5. Siti Zubaidah 1248201057

6. Silvy Febry Andini 1110096140318

7. Ussi Martina 12482010

8. Uswatun Khasanah 1248201064

9. Yessi Seftiara 1248201066

10. Yuliandani 12482010

PROGRAM STUDI ILMU FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN

YAYASAN HARAPAN IBU JAMBI

TAHUN AJARAN 2014/2015

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak berhubungan

dengan sifat spesifik senyawa terukur. Analisis meliputi pengambilan cuplikan,

pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih

dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran. Terdapat banyak teknik pemisahan tetapi

kromatografi merupakan teknik yang paling banyak digunakan.

Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael Tswett, seorangahli botani Rusia, pada

tahun 1906.Kromatografi berasal dari bahasa Yunani ‗Kromatos‘ yang berarti warnadan

‗Graphos‘ yang berarti menulis.

Kromatografi adalah metode pemisahan komponen kimia yang didasarkan pada

perbedaan antara fase bergerak dan fase diam dari komponen-komponen yang terdapat

dalam suatu sampel uji. Komponen yang dipisahkan tersebut dapat dikuantifikasi dengan

menggunakan detektor dan/atau dikoleksi untuk analisa lebih lanjut. Instrumen untuk

mengkuantifikasi adalah Gas and liquid chromatography dengan mass spechtrometry

(GC-MC dan LCMC); Fourier transform infrared spectroscopy (GC-FTIR) dan diode-

array UV-VIS absoprtionspectroscopy (HPLC-UV-VIS). Kromatografi gas (GC)

digunakan untuk memisahkan senyawa organik menguap (volatile). Fase bergerak adalah

gas dan fase diam biasanya cairan. High Performance Liquid Chromatografi (HPLC)

adalah variasi dari khromatografi cairan yang menggunakan pompa bertekanan tinggi

untuk meningkatkan efisiensi pemisahan senyawa kimia. Kromatografi cair (LC)

digunakan untuk menganalisis pemisahan campuran, yang mengandung ion-ion logam

dan senyawa organik. Fase bergerak adalah pelarut dan fase diam adalah cairan yang

mendukung padatan, padatan, dan ion pengganti resin.

Kromatografi dalam berbagai bentuknya telah digunakan secara luas sebagai

teknik pemisahan dan analisis. Pada tahun 1941, Martin dan Synge, yang kemudian

mendapat hadiah Nobel, dalam makalahnya mengemukakan pengertian-pengertian dasar

tentang kromatografi gas (GC) dan HPLC. Tidak kurang dari 10 tahun kemudian, yaitu

pada tahun 1952, James dan Martin untuk pertama kali mengintrodusir penggunaan GC.

Sejak saat itu GC telah menjadi bentuk kromatografi yang paling baik dan berkembang

dengan sangat cepat. Bentuk- bentuk kromatografi yang lain seperti kromatografi kertas,

kromatografi lapis tipis (TLC), kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi

(semuanya termasuk kromatografi cairan), belum memperoleh sukses yang sama seperti

yang telah dicapai oleh GC. Hal ini disebabkan karena efisiensinya yang rendah serta

waktu analisisnya yang panjang: Pada awal tahun 1960-an, Giddings menunjukkan

bahwa kerangka kerja teoritis yang dikembangkan untuk GC berlaku sama baiknya untuk

kromatografi cairan, dan antara tahun 1967 – 1969 Kirkland, Huber, dan kelompok

Horvath, Preiss dan Lipsky mengemukakan penggunaan HPLC yang pertama kali.

Dengan menggunakan tekanan yang tinggi (sampai dengan 5000 psi), HPLC dapat

mengatasi kelemahan-kelemahan dari kromatografi cairan pada umumnya, misalnya

viskositas cairan yang relatif lebih besar dibanding dengan viskositas gas, sehingga

HPLC mampu memberikan waktu analisis (5 - 30 menit) yang kurang lebih sama dengan

waktu analisisnya GC.

Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi campuran menjadi

komponen-komponennya, misalnya senyawa Flavonoida dan isoflavonoida yang terdapat

pada tahu, tempe, bubuk kedelai dan tauco serta Scoparia dulcis, Lindernia anagalis, dan

Torenia violacea. Yang pada senyawa isoflavon memiliki banyak manfaat. Beberapa

kelebihan senyawa isoflavon yang potensial bagi kesehatan manusia, di antaranya adalah

sebagai antioksidan, antitumor / antikanker, antikolesterol, antivirus, antialergi, dan dapat

mencegah osteoporosis. Dan semua kromatografi bekerja berdasarkan metode

kromatografi.

Kromatografi juga merupakan pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa

murninya dan mengetahui kuantitasnya. Untuk itu, kemurnian bahan atau komposisi

campuran dengan kandungan yang berbeda dapat dianalisis dengan benar. Tidak hanya

kontrol kualitas, analisis bahan makanan dan lingkungan, tetapi juga kontrol dan optimasi

reaksi kimia dan proses berdasarkan penentuan analitik dari kuantitas material. Teknologi

yang penting untuk analisis dan pemisahan preparatif pada campuran bahan adalah

prinsip dasar kromatografi.

Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa tekhnik kromatografi.

Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa

yang akan dipisahkan.

Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi

cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase

diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-

komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Dan dalam makalah ini kami

akan membahas mengenai Kromatografi Lapis Tipis (KLT) preperatif dan metoda

densitometri.

Sebelum dilakukan partisi dan KLT maka sampel harus dalam bentuk ekstrak.

Suatu ekstrak perlu di partisi untuk mengetahui pemisahannya terdapat pelarut. Metode

partisi dilakukan dengan ECP selanjutnya dilakukan proses KLT dimana dilakukan

pemisahan berdasarkan tingkat kepolaran menggunakan eluen yang sesuai, sehingga

mendapatkan profil KLT yang baik. Ekstraksi adalah proses penarikan komponen atau

zat aktif suatu simplisia dengan menggunakan pelarut tertentu. Pemikiran metode

ekstraksi senyawa bukan atom dipergunakan oleh beberapa factor, yaitu sifat jaringan

tanaman, sifat kandungan zat aktif serta kelarutan dalam pelarut yang digunakan. Prinsip

ekstraksi adalah melarutkan senyawa polar dalam pelarut polar dan senyawa non polar

dalam senyawa non polar. Secara umum ekstraksi dilakukan secara berturut-turut mulia

dengan pelarut non polar (non heksan) lalu pelarut yang kepolarannya menengah (diklor

metan atau etil asetat) kemudian pelarut yang bersifat polar (methanol atau etanol).

Ekstraksi digolongkan ke dalam dua bagian besar berdasarkan bentuk fase yang

diekstraksi yaitu ekstraksi cair-cair dan ekstraksi cair padat, ekstraksi cair padat terdiri

dari beberapa cara yaitu maserasi, perkolasi dan ekstraksi sinambung.

Prinsip dari pemisahan adalah adanya perbedaan sifat fisik dan kimia dari

senyawa yaitu kecenderungan dari molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan),

kecenderungan molekul untuk menguap (keatsirian), kecenderungan molekul untuk

melekat pada permukaan bentuk serbuk labus (adsorpsi,penserapan).

Kromotgrafi lapis tipis adalah metode pemisahan fitokimia. Lapisan yang

memisahkan terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga

berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah, berupa

larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita (awal), kemudian pelat dimasukkan didalam

bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan

terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan) dan selanjutnya senyawa yang ridak

berwarna harus ditampakkan.

B. Tujuan Penulisan

Mengetahui dan memahami cara pemisahan senyawa dengan menggunakan metode

kromatografi lapis tipis (KLT) preperatif dan metod densitometry

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Definisi

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif merupakan proses isolasi yang terjadi

berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-

komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen oleh karena daya serap

adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan

kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan.

B. Teori

Dalam perkembangan selanjutnya metode KLT tidak hanya digunakan untuk

mengidentifikasi noda akan tetapi juga untuk mengisolasi ekstrak, metode ini kemudian

dikenal sebagai KLT preparatif. Salah satu metode pemisahan yang memerlukan biaya

paling murah dan memakai peralatan sangat sederhana ialah kromatografi lapis tipis

preperatif (KLTP). Walaupun KLTP dapat memisahkan dalam jumlah gram, sebagian

besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram. KLT preperatif dilakukan dengan

menggunakan lapisan tebal ( sampai 1 mm) sebagai pengganti lapisan penyerap yang

tipis.

Kromatografi lapis tipis dibagi menjadi  kromatografi lapis tipis preparatif dan

kromatografi lapis tipis sentrifugal. Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) adalah

salah satu metode yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai peralatan

paling dasar. Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan dalam jumlah gram, sebagian

besar pemakainya hanya dalam jumlah miligram.KLTP bersama-sama dengan

kromatografi kolom terbuka.

Ketebalan penjerap (adsorben) yang paling sering dipakai pada KLTP adalah

sekitar 0,5-2 mm. Ukuran pelat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm.

Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran pelat sudah tentu  mengurangi jumlah bahan

yang dapat dipisahkan dengan KLTP. Penjerap yang paling umum digunakan ialah silika

gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa

hdrofil. Cuplikan pada KLTP dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada

pelat KLTP. Pelarut yang baik adalah pelarut atsiri ( heksana, diklorometana, etil asetat),

karena jika pelarut kurang atsiri akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi cuplikan harus

sekitar 5% - 10%. Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus sesempit mungkin karena

pemisahan tergantung pada lebar pita.

KLTP klasik mempunyai beberapa kekurangan, kekurangan yang utama adalah

pengambilan senyawa dari pelat yang dilanjutkan dengan pengekstrasian dari penjerap.

Jika senyawa beracun harus dikerok dari pelat, dapat menimbulkan masalah yang

serius .Kekurangan yang lainya ialah jangka waktu yang diperlukn untuk pemisahan dan

adanya pencemar dan sisa dari pelat sendiri setelah pengekstrasian pita yang mengandung

senyawa yang dipisahkan dengan pelarut. Pada prinsipnya kromatografi sentrifugal

adalah kromatografi klasik dengan aliran fase gerak yang dipercepat oleh gaya

sentrifugal.

C. Instrumen Alat dan Prinsip

KLT preparatif pada dasarnya, prinsip kerjanya sama dengan KLT. Tetapi, tujuan

dilakukannya berbeda, yaitu untuk memisahkan senyawa dari fraksinya (pemisahan

isolat).

Perbedaan lainnya terletak pada ketebalan pelat atau lapisan absorbannya, di

mana pada KLT biasa untuk analisis ukurannya berkisar antara 0,1-0,25 mm, sedangkan

untuk KLT preparatif berkisar antara 0,5-2,0 mm.

Prinsip dari KLT preparatif ini yaitu berdasarkan perbedaan kemampuan masing-

masing senyawa dalam berinteraksi dengan fase diam dan kelarutan dalam pengembann

yang digunakan. Pengembang yang digunakan biasanya merupakan campuran dari

berbagai jenis pelarut dengan tujuan melakukan pemisahan berdasarkan kepolaran dan

kelarutan terhadap pengembang tersebut.

D. Cara Analisis

Pada kromatografi lapis tipis preperatif cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa

garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada

garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan

dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu tanwarna, dan penyerapyang

mengandung senyawa pita dikerok dari pelat kaca. Kemudian cuplikan dielusi dari

penyerap dengan pelarut polar. Cara ini berguna untuk memisahkan campuran reaksi

sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan

cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan

campurannya rumit dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk mengkalibrasi

kromatografi lapis tipis kuantitatif.

Pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat

menampung beberapa plat. Koefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara

pengembangan berulang. Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak

dengan penyerap maka semakin besar kemungkinan penguraian.