METODE ANALISIS DNA FINGER PRINTINGMETODERFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM)DNA (deoxyribonucleic acid) dalam bahasa Indonesia lebih dikenal dengan asam deoksiribonukleat. Itu merupakan jenis asam nukleat yang menyimpan semua informasi genetika manusia. DNA merupakanblueprintsegala aktivitas sel yang nanti diturunkan ke generasi berikutnya. Jadi secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagaimateri genetik. DNA umumnya terletak di dalaminti sel.Sehingga DNA juga berperan dalam menentukan jenis rambut, warna kulit, dan sifat-sifat khusus manusia. Jadi, seorang anak pasti memiliki ciri tidak jauh berbeda dengan orang tuanya. Hal ini disebabkan karena komposisi DNA-nya sama dengan sang orang tua. Struktur DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk strukturdouble helix. Satu untai berasal dari ibu dan satu untai lagi dari ayah. Masing-masing untai terdiri atas rangka utama dan basa nitrogen yang menyatukan dengan untai DNA lain.DNA merupakanpolimeryang terdiri dari tiga komponen utama, yaitu gugus fosfat, gula deoksiribosa, dan basa nitrogen. Sebuah unitmonomerDNA yang terdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakannukleotida, sehingga DNA tergolong sebagaipolinukleotida. Rangka utama untai DNA terdiri dari gugusfosfatdangulayang berselang-seling. Gula pada DNA adalah gulapentosa(berkarbon lima), yaitu 2-deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melaluiikatan fosfodiesterantara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya. Salah satu perbedaan utama DNA dan RNA adalah gula penyusunnya, gula RNA adalahribosa.Empat basa yang ditemukan pada DNA adalahadenin(dilambangkan A),sitosin(C, daricytosine),guanin(G), dantimin(T). Adenin berikatan hidrogen dengan timin, sedangkan guanin berikatan dengan sitosin.DNAfingerprintingadalah teknikuntukmengidentifikasi seseorang berdasarkan pada profil DNAnya.Ada2 aspek DNA yang digunakan dalamDNA fingerprinting,yaitu di dalam satu individu terdapat DNA yang seragam dan variasi genetik terdapat diantara individu.Prosedur DNA fingerprinting memiliki kesamaan dengan mencocokkan sidik jari seseorang dengan orang lain. Hanya saja perbedanya adalah proses ini dilakukan tidak menggunakan sidik jari, tetapi menggunakan DNA individu karena secara individu DNA seseorang itu unik. Digunakan DNA karena DNA memiliki materi hereditas yang berfungsi untuk menentukan suatu urutan keturunan dalam suatu keluarga secara turun-menurun dengan pola yang acak (karena berasal dari fusi inti ovum dan sperma) sehingga dapat digunakan untuk identifikasi pelaku kejahatan walaupun telah berganti wajah.Metode DNAfingerprintingdapat diaplikasikan untuk keperluan sebagai berikut:Menentukan paternityUntuk keperluan forensikUntuk identifikasi pelaku ataupun korban kejahatanUntuk memprediksi apakah ada hereditary desease yang bisa diantisipasi untuk masa mendatang.Pada umunya DNA yang digunakan untuk analisis adalah DNA mitokondria dan DNA inti sel. DNA yang paling akurat untuk tes adalah DNA inti sel karena inti sel tidak bisa berubah, sedangkan DNA mitokondria dapat berubah karena berasal dari garis keturunan ibu sehingga dapat berubah seiring dengan perkawinan. Dalam bidang forensik, penggunaan kedua tes DNA tergantung pada barang bukti apa yang ditemukan di TKP (Tempat Kejadian Perkara). Untuk kasus pemerkosaan diambil sampel dari spermanya tetapi yang lebih utama adalah kepala spermatozoanya, karena terdapat DNA inti sel didalamnya. Namun bila di TKP ditemukan satu helai rambut, sampel ini dapat diperiksa asal ada akarnya. Namun untuk DNA mitokondria tidak harus ada akar, cukup potongan rambut karena diketahui bahwa pada ujung rambut terdapat DNA mitokondria sedangkan akar rambut terdapat DNA inti sel.Pada umunya bahan kimia yang digunakan untuk isolasi adalah Phenolchloroform dan Chilex. Phenolchloroform berfungsi untuk mengisolasi darah yang berbentuk cairan sedangkan Chilex digunakan untuk mengisolasi barang bukti berupa rambut. Lama dari waktu proses tergantung pada kemudahan suatu sampel di isolasi. Tahap isolasi bisa selesai hanya dalam beberapa hari atau bahkan berbulan-bulan.DNAfingerprintingbergantung pada sebagian kecil dari genom. Setiap DNA tersusun dari ekson yang merupakan daerah yang mengkode protein dan intron yang berupa daerahnon-coding, biasanya disebutjunk DNA. Dalam DNA kromosom terdapat sekuens berukuran 20-100 bp yang berulang.Potongan pengulangan ini dikenal sebagai VNTRs (VariableNumberTandemRepeats)yang dapat diisolasi dari DNA seseorang.Setiap individu memiliki VNTRs yang diturunkan oleh ayah dan ibu sehingga tidak ada individu yang memiliki VNTRs sama persis. Perbedaan VNTRs dari setiap individu terletak dalam pada berapa kalisequenceini diulang dalam daerah VNTRs. Perbedaan jumlah pengulangan ini akan menyebabkan setiap individu memiliki panjang VNTRs yang berbeda sehingga memungkin untuk mengetahui indentitas seseorang melalui profil DNAnya.Ada 2 prinsip utama dalam menganalisa data VNTRs, yaitu:Identity Matching.Jika dua sample memiliki pola alel VNTRs yang sama, maka dapat disimpulkan kedua sample tersebutberasal dari individu yang sama.Inheritance Matching.Alel VNTR harus mengikuti pola keturunan. Seorang anak harus memilikisebuah alel yang cocok dengan salah satu dari masing-masing orang tuanya.Berikut ini adalah macam-macammetode untuk melakukanDNAfingerprint, yaitu:1.Analisa menggunakan PCR ataudot blot(slot blot)DNAfingerprintdengan menggunakan PCR,kelebihannyayaitu kemampuan untuk membedakannya lebih akurat dan dapat digunakan untuk menganalisa sampel yang tersedia dalam jumlah kecil maupun yang telah terdegradasi oleh cahaya matahari.PCR mampu mengamplifikasi sejumlah daerah spesifik yang terdapat pada DNA menggunakan primer oligonukleotida dan DNA polimerase yang termostabil. Salah satu contoh DNA profilling menggunakan PCR adalah denganHLA-DQ alpha reverse dot blot strips. Pada teknik ini digunakan strips yang mengandung titik (dot) dimana setiapdotmengandun DNA probe yang berbeda dari DNA manusia (HLA). Probe DNA berupa dot padastripnitroselulosa ditempeli dengan enzim yang dapat merubah substrat yang tidak berwarna menjadi berwarna ketika probe berikatan dengan DNA.Jika DNA hasil PCR berikatan dengan probe yang komplemen pada strip, maka titik (dot) padastripakan berwarna.2.Analisa STR (Short Tandem Repeats)STRmerupakanpolimorfisme DNA yang terjadi karena adanya 2 atau lebih nukleotida yang berulang.Pola pengulangannyaadalahterdiri dari 2-10 bp dan terjadi pada daerah intron dari DNA. Dengan menganalisa loci dari STR dan menghitung berapa banyak perulangan dari sekuens STR yang terjadi di setiap locus, maka dapat terbaca profil genetik yang unik dari setiap individu.Analisa dengan STR memerlukan teknik PCR dan elektroforesis gel agarosa. DenganPCR daerah polimorfik dari DNA diamplifikasi dan kemudian fragmen STR dipisahkan dengan elektroforesis agarosa sehingga jumlah perulangan yang terjadi dapat dihitung dengan membandingkan perbedaan ukuran dengan alelic ladder. Analisa dengan STR ini tidak dapat dilakukan apabila 2 individu merupakan kembar monozigot.3.AmpFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)DNA profillingdengan menggunakan teknik AmpFLP memiliki beberapa keunggulan, yaitu lebih cepat daripada analisa dengan RFLP dan biaya yang dibutuhkan lebih murah. Teknik ini berdasarkan pada polimorfisme VNTR untuk membedakan alel yang berbeda. Teknik ini menggunakan PCR untuk mengamplifikasi daerah VNTR dan kemudian hasil amplifikasi dipisahkan dengan gel poliakrilamid dan diwarnai dengan tekniksilver stained. Salah satu locus yang sering digunakan dlam teknik ini adalah locus D1S80. Contoh hasil amplifikasi locus D1S80 :

4.Analisa kromosom YDNA profillingdengan teknik analisa kromosom Y menggunakan primer spesifik yang akan mengamplifikasi daerah polimorfisme pada kromosom Y (Y-STR). Pada kasus pemerkosaan, teknik ini menghasilkan resolusi yang lebih baik karena biasanya DNA sampel yang didapat dalam keadaan tercampur dengan DNA korban (wanita). Kromosom Y diturunkan oleh ayah sehingga analisa kromosom Y juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi hubungan paternal seorang pria.5.Analisa DNA mitokondria.DNA mitokondria terdapat dalam jumlah banyak dalam sel, tidak seperti DNA kromosom yang hanya terdapat 1 atau 2 dalam setiap sel. Hal ini memungkinkan apabila sampel yang ada telah rusak DNA kromosomnya, maka dengan DNA mitokondriapunDNA profillingtetap dapat dibuat. Dalam pembuatanDNA profillingdengan DNA mitokondria, bagian yang diamplifikasi adalah daerah HV1 dan HV2 dari DNA mitokondria dimana sekuens hasil amplifikasi yang didapat dapat dibandingkan dengan pola band referensi. DNA mitokondria ini diturunkan oleh ibu.6.Analisa RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)RFLP adalah ukuran fragmen DNA yang diperoleh oleh pemotongan sequence VNTRs sampai 30 urutan dengan enzim restriksi di situs spesifik. VNTRs bervariasi antara spesies tanaman, seperti melakukan nomor dan lokasi antara enzim restriksi dan situs pengenalan.Prinsip dasar dari analisa RFLP ini adalah enzim restriksi akan memotong DNA pada sekuens yang spesifik dimana hasil pemotongan tersebut kemudian dianalisa dengan elektoforesis gel agarosa. Sekuens RFLP ini berbeda pada setiap individu sehingga enzim restriksi akan memotong pada daerah yang berbeda untuk setiap individu. Ukuran fragmen yang dihasilkan bergantung pada alel yang dimiliki individu tersebut dan panjang sekuens VNTR sehingga analisa menggunakan RFLP ini dapat digunakan untuk analisa genetik.Pada sebuah gel agarose, RFLPs dapat terlihat menggunakan radiolabel yang komplemen dengansequenceDNA. Tidak memerlukan teknik PCR untuk amplifikasi DNA dalam metode ini.

Permasalahanyang umumRFLPpadametode DNA fingerprintingadalah sebagai berikut:Hasil tidak secara spesifik menunjukkan kesempatan kecocokan antaradua organismeProses yang melibatkan banyak uang dan tenaga kerja, banyak laboratorium yang tidak mampu.Teknik yang digunakandalam analisaDNAfingerprintingadalah dengan menggunakanteknikRFLP. Pembuatan DNAfingerprintingdengan taknik analisa RFLP meliputi dua tahap, yaitu :1.Pemotongan DNA dengan enzim restriksiTabungeppendorfyang berisi larutan DNA ditambahkanbufferrestriksi dan BSA (Bovine Serum Albumin).Buffer restriksi (RE buffer) berfungsi untuk membuat dan mempertahankan suasana pH,ionic strength, dan kation yang sesuai (optimum) dengan kerja enzim restriksi sehingga enzim restriksi dapat bekerja secara optimal. Sedangkan BSA berperan sebagai stabilisator bagi enzim restriksi serta mencegah terjadinya adesi antara enzim dengan dinding tabung reaksi. BSA tidak akan berpengaruh pada enzim yang tidak membutuhkan stabilisator.2.Pemisahan hasil pemotongan dengan elektroforesis gel agarosa.Setelah DNA dipotong dengan enzim restriksi, DNA dianalisis dengan gel elektroforesis. Gel elektroforesis merupakan salah satu metode yang digunakan untuk pemisahan, pendeteksian dan pemurnian molekul-molekul Biologi, seperti asam nukleat dan protein. Pemisahan dilakukan pada matriks yang berupa gel. SampelDNA yang terpotong akan bergerak dalam gel agarosa yang telah dialiri listrik bertegangan 90mV. Kemudian DNA tersebut akan membentuk band-band yang dapat dilihat menggunakan alat berupa transiluminator UV.Kemudian akan nampak band-band, dari band tersebutdapat dibuat peta restriksi DNA plasmid dari ukuran fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan pada pemotongan dengan enzim restriksi dan jarak antara sisi pengenalan enzim.Enzim restriksi yang digunakan terdiri dari campuran EcoRI dan PstI. Enzim EcoRI berasal dari bakteriEschericia coli, sedangkan enzim PstI berasal dari bakteriProvidencia stuartii.Enzim EcoRI akan memotong pada sekuens GAATTC . Gambar sisi pemotongan enzim EcoRI adalah sebagai berikut :

Enzim EcoRI diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC ( sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC ). Didalam sekuens pengenal tersebut, Enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Potongan-potongan DNA untai ganda yang dihasilkan akan memliki ujung beruntai tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilahsticky end.Sedangkan enzim PstI akan memotong pada sekuens sebagai berikut :5' - CTGCAG - 3' 3' - GACGTC - 5'5' - CTGCA|G - 3' 3' - G|ACGTC - 5'5'-CTGCAG- 3' 3' -GACGTC- 5'Kerja dari enzim restriksidapat dipengaruhi oleh faktor-faktorsebagai berikut :Komposisi BufferEnzim restriksi yang berbeda membutuhkanionicstrength(konsentrsi garam) dan kation yang berbeda pula. Beberapa enzim tidakdapatbekerja bilakomposisibuffernya tidak sesuai. Penggunaan buffer yang berbeda akan menyebabkan kerja enzim dalam memotong menjadi tidakoptimal.Adanya DNA yang termetilasiSebagian besar enzim restriksi tidak dapat memotong DNA yang termetilasi karena enzim tersebut tidak mampu mengenali sisi pemotongannya, hal inidisebabkan oleh adanya modifikasiataumetilasi.SuhuinkubasiSuhu inkubasi suatu enzim bergantung pada asal enzim restriksi tersebut diambil. Suhu inkubasi enzim restriksiumumnyaadalah 37oC. Namun apabila enzim restriksi tersebut diperoleh dari bakteri termofil, suhu inkubasinya adalah sekitar 50 65oC.Dalam pemotongan DNA dengan enzim restriksi sering terjadi kesalahan positif yang disebut star activity.Star activityadalah suatu kondisi dimana enzim restriksi kehilangan spesifisitasnya dalam memotong suatu rantai DNA pada sekuens tertentu dimana sekuens yang dipotong menjadi berbeda dengan sekuenscanonicalnya sehingga enzim akan memotong DNA pada tempat yang salah dan abnormal. Adanyastar activityditunjukkan oleh adanya smear ataupun jumlah band yang terlalu berlebih pada visualisasi hasil elektroforesis.Star activityini dapat disebabkan oleh berbagai faktor sebagai berikut:Inkubasi yang terlalu lamaBila inkubasinyaterlalu lama, maka enzim akan memotong sisi lain selain sisispesifiknya, sehinga fragmen yang terbentuk menjadi kecil kecil.Sehingga ketikadivisualisasimenyebabkanband yang terlihat smear.Konsentrasi enzim yang terlalu tinggiKonsentrasi enzimyangterlalu tinggi akanmenyebabkan enzimmemotong secara berlebihan sehingga fragmen yang terbentuk menjadi sangat kecil dan ketika divisualisasi akan terlihat bertumpukdan banyak.Konsentrasi gliserol yang terlalu tinggiKonsentrasi gliserol dalam buffer RE terlalu tinggidapat menghambat kerjaenzimkarena larutan menjadi sangat viscous sehingga enzim sulit untuk bekerja.Kekuatan ionik (ionic strength) pada buffer reaksiKekuatan ionik dari buffer dapat berubah ketika diinkubasi. Hal ini disebabkan oleh adanya sebagian dari air yang menguap sehingga kekuatan ionik dari buffer menjadi turun.pH buffer reaksi yang suboptimalPenggantian Mg2+dengan ion divalen lain seperti Mn2+atau Co2+.Adanya pelarut organik seperti etanol, DMSO, dll yang dapatmenghambat kerja dari enzim.(Kresna,2009).RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RFLP)Analisis Restriction fragment length polymorphism (RFLP) adalah salah satu teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuen DNA. Deteksi RFLP dilakukan berdasar pada adanya kemungkinan untuk membandingkan profil pita-pita yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan dengan enzim restriksi terhadap DNA target/dari individu yang berbeda. Berbagai mutasi yang terjadi pada suatu organisma mempengaruhi molekul DNA dengan berbagai cara, menghasilkan fragmen-fragmen dengan panjang yang berbeda. Perbedaan panjang fragmen ini dapat dilihat setelah dilakukan elektroforesis pada gel, hibridisasi dan visualisasi. Aplikasi teknik RFLP biasa digunakan untuk mendeteksi diversitas genetic, hubungan kekerabatan, sejarah domestikasi, asal dan evolusi suatu spesies, genetic drift dan seleksi, pemetaan keseluruhan genom, tagging gen, mengisolasi gen-gen yang berguna dari spesies liar, mengkonstruksi perpustakaan DNA.Langkah-langkah kerja untuk mendeteksi RFLP di laboratorium meliputi :-Isolasi DNA-Pemotongan dengan enzim restriksi (digesti restriksi) dan elektroforesis gel-Transfer DNA dengan Southern blotting-Hibridisasi DNAA.ISOLASI DNAIsolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel yaitu pada mitokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan membran inti, dan dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang lain. Pada saat melakukannya harus dijaga agar DNA tidak rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang. Proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak. Untuk membantu terjadinya lisis biasanya dilakukan inkubasi pada suhu sekitar 60oC. Dalam proses ini biasa digunakan senyawa senyawa phenol, chloroform dan isoamyl alcohol untuk memaksimalkan proses lisis. Proses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau kontaminan yang tidak diinginkan.Pemisahan DNA dari komponen sel yang lain, termasuk debris sel, dilakukan dengan sentrifugasi. Kontaminan yang umum ditemukan adalah polisakarida yang dapat mengganggu proses PCR dengan cara menghambat aktivitas Taq polymerase, atau poliphenol yang dalam bentuk teroksidasi akan mengikat DNA secara kovalen. Untuk menghindarkan hal ini jaringan yang digunakan dijaga tetap dingin sebelum dan selama proses ekstraksi. Selain itu dilakukan penambahan antioksidan seperti PVP. Setelah dilakukan ekstraksi dilakukan presipitasi DNA dengan menggunakan ethanol atau isopropanol. Selain DNA semua bahan yang lain kan larut dalam ethanol dingin. Sehingga saat dilakukan sentrifugasi DNA akan mengendap dan terpisah dari senyawa-senyawa/bahan lain.Sebagai bahan untuk RFLP harus digunakan DNA yang bersih dari kontaminan (mempunyai kemurnian tinggi) dan dengan berat molekul yang tinggi. Selama proses ekstraksi DNA beberapa hal yang dapat terjadi adalah :-DNA patah-patah selama proses isolasi-DNA terdegradasi oleh enzim nuclease-Terjadi kontaminasi oleh polisakarida-Metabolit sekunder ikut terisolasiB.PEMOTONGAN DENGAN ENZIM RESTRIKSI (DIGESTI RESTRIKSI)DNA hasil isolasi kemudian dipotong dengan enzim restriksi tertentu yang dipilih dengan hati-hati. Setiap enzim restriksi pada kondisi yang sesuai akan mengenali dan memotong DNA sehingga dihasilkan fragmen-fragmen DNA. Fragmen-fragmen tersebut selanjutnya dielektroforesis pada gel agarosa. Karena fragmen-fragmen tersebut tidak akan terlihat sebagai smear berkesinambungan bila diwarnai dengan ethidium bromide, maka pewarnaan saja umumnya tidak dapat mendeteksi adanya polimorfisme. Dengan demikian perlu dilakukan hibridisasi dan visualisasi untuk mendeteksi fragmen tertentu. Hibridisasi dan visuali sasi dilakukan dengan Southern blotting.C.TRANSFER DNA Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari gel agarose ke nilon berpori atau membrane nitroselulosa. Transfer DNA disebut Southern blotting, mengacu kepada nama penemu teknik tersebut yaitu E.M. Southern (1975). Pada metode ini mula-mula gel didenaturasi dengan larutan dasar dan diletakkan pada suatu nampan. Selanjutnya di atas gel hasil elektroforesis diletakkan nilon berpori atau membrane nitroselulosa, kemudian di atasnya diberi pemberat. Semua fragment hasil pemotongan dengan enzim restriksi yang pada awalnya berada pada gel akan ditransfer secara kapiler ke membrane tersebut dalam bentuk untai tunggal. Pola fragmen akan sama dengan yang berada pada gel.

Gambar. Proses capillary transfer DNA dari gel agarose ke membrane.D.HIBRIDISASI DAN VISUALISASIDNA yang ditransfer pada nilon berpori atau membrane nitroselulosa selanjutnya dihibridisasi dengan probe. Membran diinkubasi bersama probe DNA.Bila antara probe dan DNA target merupakan komplemen maka akan terjadi hibridisasi. Bila probe yang digunakan dilabeli maka selanjutnya dupleks yang terjadi dapat dideteksi. Bila kondisi hibridisasi yang digunakan mempunyaistringencyyang tinggi(highly stringent), maka tidak akan terjadi hibridisasi dengan DNA yang mempunyai kekerabatan yang jauh atau non homolog. Jadi probe DNA akan mengenali hanya sekuen yang komplemen dan secara ideal homolog diantara beribu-ribu atau bahakan berjuta-juta fragmen yang bermigrasi sepanjang gel. Fragmen yang diinginkan dapat dideteksi setelah dilakukan pemaparan membrane yang telah mengalami hibridisasi pada film.

Gambar:Prosedur DNA hybridisasi dari membran hasil transfer dan diekspose dengan x-ray film.Probe DNA umumnya berasal dari perpustakaan DNA (DNA library), baik dari genom maupun cDNA, yang merupakan sekumpulan vector yang mengandung wakil dari DNA original yang dipotong menjadi banyak potongan. Vektor tersebut dapat ditransfer pada bakteri sehingga DNA yang dibawanya dapat dilipatgandakan. Probe DNA juga dikonversi menjadi molekul untai tunggal dan dilabeli menggunakan metode standar seperti radioisotope dan digoxygenin, dan selanjutnya digunakan untuk hibridisasi.Hasil visualisasi dari fragmen-fragmen RFLP dapat digambarkan sebagai berikut :

Gambar : Visualisasi potongan DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi dan dilabel dengan marker spesifik.Mutasi akan menghasilkan sisi pengenalan enzim restriksi yang baru pada suatu sekuen DNA. Pada gambar di atas terlihat munculnya 2 pita baru yang lebih kecil pada mutan. Teknologi RFLP secara ideal akan menghasilkan sutau seri pita pada gel, yang dapat diskor berdasarkan ada atau tidaknya pita tertentu atau sebagai marker kodominan. Perbedaan antar genotip biasanya divisualisasikan sebagai pola fragmen restriksi yang berbeda.Pada diagram di atas, adanya mutasi menghasilkan sisi pengenalan enzim restriksi yang baru pada lokasi pengenalan probe. Sebagi konsekuensinya probe akan berhibridisai dengan kedua fragmen baru tersebut, sementara pada segmen B, dimana tidak terjadi mutasi, hanya satu segmen yang terhibridisasi oleh probe. Pada saat dilakukan elektroforesis, kedua segmen dari A akan bermigrasi lebih jauh sepanjang gel dibandingkan dengan segmen B yang berukuran lebih besar menghasilkan polimorfisme seperti terlihat pada inset disebelah kanan.KELEBIHAN DAN KEKURANGAN TEKNIK RFLPRFLP merupakan metode yang mempunyai akurasi yang tinggi dan mudah ditransfer antar laboratorium, bersifat kodominan sehingga dapat mendeteksi adanya heterozigositas, tidak diperlukan informasi sekuen target, dan arena berdasar pada homologi sekuen maka sering direkomendasikan untuk analisis filogenetik antar spesies yang berkerabat. RFLP cocok untuk membuat peta linkage, merupakan marker yang locus specific, dan mempunyai kemampuan memisahkan yang tinggi baik pada tingkat populasi, spesies atau individual. RFLP merupakan teknik yang sederhana, bila probe tersedia.Kekurangan RFLP adalah dibutuhkan DNA dengan kemurnian tinggi dalam jumlah banyak, tidak mungkin dilakukan outomatisasi, pada beberapa spesies mempunyai level polimorfisme yang rendah, sedikit lokus yang terdeteksi, memerlukan perpustakaan probe yang sesuai, membutuhkan waktu yang banyak, membutuhkan biaya yang banyak (Fachtiyah,2006).