Tanggal PraktikumSelasa, 25 Maret 2014

Praktikum 3.1TEKNIK SAMPLING

PRELAB

1. Bagaimana cara pengambilan sampel sayuran seperti bayam, sawi yang akan dianalisis total E.coli? Jelaskan tahapannya!Metode 11. Siapkan wadah Erlenmeyer yang aseptis2. Pisau yang digunakan diaseptis terlebih dahulu dengan disemprotkan alcohol dan dibakar denganbunsen3. Siapkan Sayuran bayam, sawi yang telah ditimbang seberat 5 gram , lalu dipotong potong4. Masukkan potongan sayuran ke dalam 45 ml peptonMetode 21. Siapkan wadah Erlenmeyer yang aseptis2. Pisau yang digunakan diaseptis terlebih dahulu dengan disemprotkan alcohol dan dibakar denganbunsen3. Sayuran sawi, bayam dipotong (secara aseptis) dengan luas 5x5 cm4. Siapkan cotton wool swab yang dicelupkan dalam larutan pengencer pepton5. Permukaan sayuran di swab/oles dengan menggunakan cotton wool swab sebanyak 3 kali (Dwidjoseputro, 2005).

2. Jelaskan peranan teknik sampling dalam pengujian mikrobiologi? Jelaskan!Teknik sampling dipergunakan untuk memperoleh efisiensi dan efektivitas dalam pelaksanaan pemeriksaan, agar hasil pemeriksaannya dapat dipertanggungjawabkan dari segi mutu pelaksanaan tugas pemeriksaan. Sasaran dari sampling adalah untuk mengambil sampel tanpa mengkontaminasinya dan untuk membawanya ke laboratorium dengan perubahan yang minimum dalam status mikrobialnya (Jaya, 2008).

3. Jelaskan perbedaan tahapan pengambilan sampel cair dan padat untuk pengujian mikrobiologi? Jelaskan tahapannya !a) Sampel Cair Sampel cair sebelum diambil sampel harus diaduk (dihomogenkan) Sampel diambil sebanyak 100-500 ml Tempatkan pada botol steril Bawa ke laboratoriumb) Sampel Padat Gunakan pisau/sendok/alat lain untuk memudahkan pengambilan. Makanan berupa daging, ikan, dan makanan serupa pengambilan dilakukan dilakukan pada permukaan maupun bagian dalam Amati beberapa bagian dari tempat yang berbeda kira kira 100 gram Tulis tanggal pengambilan, nama sampel dan lokasi Bawa ke laboratorium (Waluyo, 2008).

Paraf Asisten

Nama:

DIAGRAM ALIR1. Pengambilan Sampel Padat

Digunakan alat dan bahan

Diambil sampel pada permukaan maupun bagian dalam

Diamati bagian tempat berbeda kira-kira 100 g

Dimasukkan dalam tempat yang telah tersedia secara aseptik dan tutup rapat

Ditulis tanggal pengambilan, nama sampel dan lokasi

Dibawa ke laboraturium

2. Pengambilan Sampel Cair

Jenis sampel cair (susu,sirup,es krim)

Diaduk dan dihomogenkanSampel diambil sebanyak 100-500

Ditempatkan pada botol steril

Dibawa ke laboraturium

3. Surface slicesImpression platesPengambilan Sampel Permukaan

Dicuci dan dibilas

Diusap (swab)

Cotton-wool swab

Ditempel, terus ke media

Impression plates

4. Makanan seperti daging bagian dalam tidak boleh dipaparkanPengambilan Sampel Anaerob

Dimasukkan sampel pada kantung anaerob

Diambil sampel menggunakan wool swab dan kemudian ditempatkan pada botol

Sebelum digunakan wool swab dibasahi dengan media

5. Sampel dipelihara hingga dilakukan tes laboraturium Transportasi dan penyimpanann sampel

Dibekukan makanan dan disimpan dalam frezeer menggunakan CO2

Jenis makanan yang tidak dibekukan disimpan dalam refrigerator (jangan melebihi 3 hari)

6. Penanganan sampel di laboraturium

Diriwayat sampling dan transportasi serta penyimpanan harus dicatat

Diberi label (tanggal penerimaan,nama,jenis dan asal sampel)

Diperiksa sampel sesuai prosedur mikrobiologi

PEMBAHASAN

1. Sebutkan beberapa jenis teknik sampling! Jelaskan pula masing-masing peranannya!Ada dua macam teknik pengambilan sampel yaitu: a). Random SamplingAdalah teknik pengambilan sampel dimana semua individu dalam populasi baik secara sendiri-sendiri atau bersama-sama diberi kesempatan yang sama untuk dipilih sebagai anggota sampel. Cara pengambilan sampel dengan random ada tiga cara:1). Cara undian adalah pengambilan sampel dengan cara memberikan kesempatan kepada setiap individu untuk menjadi anggota sampel.2). Cara ordinal adalah cara pengambilan sampel dengan cara kelipatan dari sampel sebelumnya, misalkan kelipatan dua, kelipatan tiga, dan seterusnya.3). Cara randomisasi adalah pengambilan sampling melalui tabel bilangan random. b). Non Random Sampel Adalah cara pengambilan sampel yang tidak semua anggota sampel diberi kesempatan untuk dipilih sebagai anggota sampel. Cara pengambilan sampel dengan non random sanpel ada tujuh cara yaitu:1) Proportional sampling adalah pengambilan sampel yang memperhatikan pertimbangan unsur-unsur atau kategori dalam populasi penelitian. 2) Stratified sampling adalah cara pengambilan sampel dari populasi yang terdiri dari strata yang mempunyai susunan bertingkat.3) Proporsive sampling adalah cara pengambilan sampel dengan menetapkan ciri yang sesuai dengan tujuan.4) Quota sampling adalah ruang dan tempat belajar baik yang tersedia dirumah maupun dikampus. 5)Double sampling atau sampling kembar sering digunakan dalam research dan penelitian yang menggunakan angket lewat usaha menampung mereka dan mengembalikan dalam angket. 6) Area probability sampling adalah cara pengambilan sampel yang menunjukkan cara tertentu atau bagian sampel yang memiliki ciri-ciri populasi. 7) Cluster sampling adalah cara pengambilan sampel yang berdasarkan pada cluster-cluster tertentu. 8) Combinet adalah gabungan antara beberapa sampling dalam teknik random sampling dan teknik non random sampling di atas sehingga menyiapkan tampilan komunikasi. (Sugiyono,2003).

2. Apa saja faktor yang harus diperhatikan ketika melakukan teknik sampling untuk pengujian mikrobiologi ? Jelaskan!Hal yang harus diperhatikan ketika melakukan teknik sampling: Metode dan alat yang digunakan Siapa yang melakukan sampling Jumlah sampel yang diambil Bagaimana pembagiannya Jenis wadah yang digunakkan Kondisi penyimpanan Selang waktu pengambilan sampel Masalah khusus untuk setiap jenis sampel (Wibowo,2007).

3. Mengapa pengambilan sampel untuk uji mikrobiologi dilakukan dengan aseptis?Karena salah satu teknik dasar dalam analisa mikrobiologi adalah teknik transfer aseptis (suatu metode atau teknik di dalam memindahkan atau mentransfer kultur bakteria dari satu tempat ke tempat lain secara aseptis agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur). Teknik ini sangat esensial dan kunci keberhasilan prosedur mikrobial yang harus diketahui oleh seorang yang hendak melakukan analisis mikrobiologi. Pengambilan sampel harus dilakukan secara statistik agar tidak bias, jadi secara acak (random sampling). Selain itu, digunakan teknik aseptis selama pengambilan sampel agar tidak terjadi pencemaran. Alat-alat yang digunakan harus steril. Bahan makanan cair diambil dengan pipet steril, makanan padat menggunakan pisau, garpu, sendok atau penjepit yang steril (Suriawiria, 2005).

4. Apa perbedaan teknik sampling metode swab dan metode adhesive surface? Jelaskan!1. Metode Apus (Swab) Metode Apus ini dilakukan dengan mengapus / mengusap alat yang kontak dengan produk. Alat yang digunakan adalah Cotton swab. Prosedur Metode Apus untuk kimia residu :1. Cotton swab direndam air dan disimpan dalam tabung tertutup2. Teknik swab dilakukan dengan meletakkan frame standard berukuran 5x 5cm pada lokasi sampling masing-masing peralatan, kemudan di swab.3. Letakkan cotton swab ke dalam tabung reaksi, tutup dan diberi nomor sampel4. Dianalisis kimia residunyaKelebihan Metode Apus : Digunakan untuk bahan yang kering Dapat digunakan untuk perlatan kompleks yang ada komponen listrikKekurangan Metode Apus : Hasil yang diperoleh dapat bervariasi karena tempat pengambilan sampel yang relatif kecil dan terdapat perbedaan tekanan saat swab. Pelarut yang digunakan dapat mempengaruhi residu Jika dilakukan ektraksi saat preparasi sampel, maka proses ekstraksi ini dapat mempengaruhi recovery (Firmansyah ,2012).2. Metode adhesive surface Metode ini dilakukan dengan merekatkan swab pada bagian permukaan sampel yang telah dicuci dan dibilas.Kelebihan:1. Cepat2. MudahKelemahan:Hanya dapat mendeteksi mikroorganisme yang terdapat pada permukaan sampel (Roberts and Greenwood, 2003).

5. Jelaskan teknik sampling untuk mendeteksi mikroorganisme pada produk es krim dan nugget ikan? Jelaskan tipe mikroorganisme yang dapat tumbuh pada produk tersebut!a) Sampel Cair (es krim) Sampel cair sebelum diambil sampel harus diaduk (dihomogenkan) Sampel diambil sebanyak 100-500 ml Tempatkan pada botol steril Bawa ke laboratoriumMikroorganisme yang dapat tumbuh : listeria monicytogens, staphylococcus aureus, bacillus, salmonella, shigella, streptococcus, pseudomonas, camphylobacter, brucella sp dan bakteri koliform

b) Sampel Padat (nugget ikan) Gunakan pisau/sendok/alat lain untuk memudahkan pengambilan. Makanan berupa daging, ikan, dan makanan serupa pengambilan dilakukan dilakukan pada permukaan maupun bagian dalam Amati beberapa bagian dari tempat yang berbeda kira kira 100 gram Tulis tanggal pengambilan, nama sampel dan lokasi Bawa ke laboratorium Mikroorganisme yang dapat tumbuh: eschericia coli, salmonella, dan shigella (Waluyo, 2008).

6. Apa saja yang harus diperhatikan ketika melakukan sampling untuk bahan yang mengandung mikroba anerobik? Jelaskan!Hal-hal yang harus diperhatikan adalah makanan seperti daging bagian dalam tidak boleh dipaparkan oksigen dan masukkan sampel pada kantong anaeron. Lalu gunakan wool swab untuk pengambilan sampel dan letakkan pada botol secara aseptis. Sebelum digunakan, wool swab dibasahi dengan media terlebih dahulu (Roberts and Greenwood, 2003).

7. Bagaimana teknik dan prosedur sampling yang dilakukan jika saudara ingin mengisolasi bakteri termofilik dari lumpur lapindo di Sidoarjo?1. Preparasi Media Xilan Kasar dari Tongkol Jagung Tongkol jagung didapatkan dari Pasar Belimbing Malang Jawa Timur dan digiling sampai lolos saringan 40 mesh. Xilan kasar yang dihasilkan selanjutnya digunakan sebagai media pengkayaan untuk menginduksi pertumbuhan mikroorganisme dalam sampel lumpur Lapindo. 2. Proses Pengambilan Sampel Lumpur Lapindo Sampel diambil secara aseptis dari lumpur panas Lapindo Porong, Sidoarjo Jawa Timur pada 3 titik yang berbeda. Setiap lokasi pengambilan sampel diukur suhu dan pH menggunakan termometer dan pH meter. Sampel selanjutnya dibawa menuju ke laboratorium untuk dilakukan isolasi dan seleksi mikroba. 3. Pengkayaan dan Isolasi Mikroorganisme Termofilik Xilanolitik. Sampel lumpur Lapindo diperkaya dalam media Luria Bertani (LB) yang ditambahkan xilan kasar 1%. Sampel diinokulasikan kedalam media dengan perbandingan 1 : 2 dalam tabung erlemenyer 250 ml dan diinkubasi pada suhu 55C, 120 rpm selama 72 jam. Setelah dilakukan pengkayaan dilakukan pengenceran hingga 10-5 dan diambil 3 pengenceran terakhir. Selanjutnya sampel ditumbuhkan media Nakamura yang mengandung 2 g LB, 0,1 g KH2PO4, 0,02 g MgSO4.7H2O dan ditambahkan xilan kasar 0.5 g per 100 ml menggunakan metode pour plate dan spread plate. Isolat diinkubasi pada suhu 55C selama 48 jam untuk menyeleksi mikroorganisme termofilik. Setiap isolat yang tumbuh dilakukan isolasi kembali pada media Nakamura untuk memastikan isolat yang diperoleh merupakan kultur tunggal. 4. Identifikasi dan Karakterisasi Mikroorganisme Termofilik Xilanolitik Identifikasi awal dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada media Nakamura yang mengandung beechwood xylan 0.5 % dan mengamati zona bening yang terbentuk. Isolat terpilih yang mampu menghasilkan zona bening diidentifikasi secara morfologi, mikroskopis, dan biokimia. Pengamatan morfologi meliputi bentuk, tepian dan warna pada koloni. Pengamatan mikroskopis yang dilakukan meliputi pewarnaan Gram untuk mengetahui jenis Gram dan dan pewarnaan endospora untuk mengetahui keberadaan endospora pada isolat. Uji biokimia sederhana meliputi uji katalase, uji sitrat, uji MR (Methyl Red), uji VP (Voges-Proskauer), uji indol, dan uji ornithine. Identifikasi molekuler dilakukan dengan menggunakan metode PCR dan sekuensi gen 16S rRNA. Proses amplifikasi secara PCR menggunakan primer universal 8F (forward; 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') dan 1492R (reverse; 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3'). Proses ini dilakukan selama 30 siklus, yakni denaturasi 94C selama 30 detik, penempelan 50C selama 30 detik, dan elongasi 72C selama 3 menit. Produk PCR yang diperoleh selanjutnya disekuensing menggunakan DNA sequencer. Data hasil sekuensing selanjutnya dikomparasi dengan data sekuen yang ada di GenBank menggunakan program BLAST. Sebanyak 17 rRNA sekuen dari spesies relatif dari genus Bacillus diambil dan dianalisis tingkat kekerabatannya menggunakan program CLUSTALW. Selanjutnya dilakukan rekonstruksi pohon filogenetik metode neighbor-joining plot menggunakan program MEGA5. 5. Produksi Enzim Xilanase Termofilik solat terpilih diinokulasikan pada media Luria Bertani untuk mengetahui waktu pertumbuhan optimal. Sebanyak 10 ml kultur cair dimasukkan ke dalam 140 ml media Nakamura dan diinkubasi pada suhu 55C selama 18 jam. Ekstrak kasar enzim diperolehdengan memisahkan supernatan dan pelet kultur pada kecepatan sentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 4C. 6. Pengujian Aktivitas Xilanase Pengujian aktivitas enzim xilanase dilakukan dengan mengukur kadar gula reduksi dpada substrat beechwood xylan menggunakan metode Dinitrosaliclyc acid (DNS). Sebanyak 1 ml substrat ditambahkan supernatan 1 ml dan diinkubasikan pada suhu 55C. Setelah 1 jam, ditambahkan 3 ml larutan DNS dan didiamkan 10 menit. Kemudian dididihkan selama 5 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. 1 unit aktivitas enzim xilanase didefiniskan sebagai jumlah enzim xilanase yang dibutuhkan untuk melepaskan 1 mol gula reduksi (xilosa) per menit pada kondisi reaksi optimum. 7. Penentuan pH dan Suhu Optimum Enzim Xilanase Penentuan pH optimum enzim xilanase dilakukan dengan menginkubasi 1 mL supernatan (ekstrak kasar enzim) dan 1 mL substrat xilan (beechwood xylan 1%) pada rentang pH 5,0-8,0. Buffer yang digunakan adalah buffer asetat pH 4 dan 5, bufer fosfat pH 6 dan 7, dan bufer Tris-HCl pH 8 dan 9. Untuk menentukan pH optimal, enzim dan substrat diinkubasi selama 1 jam pada suhu 55C dan diukur aktivitasnya sesuai dengan pengujian aktivitas enzim. Penentuan suhu optimum enzim xilanase dilakukan dengan menggunakan prosedur yang sama selama 1 jam dengan variasi suhu 45C, 50C, 55C, 60C dan 65C (Habibie, 2008).

8. Jelaskan kelebihan dan kekurangan teknik sampling metode cuci dan metode bilas!1. Metode cuciKelebihan : menjangkau seluruh bagian sampelKelemahan: banyaknya limbah cair akibat banyaknya pengenceran.2. Metode bilasMetode Residu diperoleh dengan cara mengumpulkan pelarut pembilas yang telah kontak dengan permukaan alat dimana produk diproses. Hasil bilas kemudian dianalisis untuk kandungan residu dan kandungan mikrobaPerhatian Tetapkan volume pelarut pembilas Pelarut pembilas harus kontak dengan permukaan alat selama waktu yang cukup agar residu dapat larut sempurna Pelarut pembilas tidak boleh menyebabkan penguraian/degradasi residu Analisis banding dilakukan terhadap pelarut pembilas kontrol yang belum digunakanKelebihan Pengambilan contoh dimungkinkan terhadap permukaan yang luas Keseluruhan lokasi di permukaan dapat dicapai tanpa kesulitan, sehingga memungkinkan evaluasi dengan tingkat recovery rate tinggi Variasi hasil analisis akan kecil dibandingkan dengan cara apusKekurangan Tidak cocok untuk peralatan kompleks bermuatan instrumentasi atau komponen listrik/elektronika seperti : mesin tablet, FBD, granulator, mesin pengisi serbuk, tablet, kapsul. Cocok untuk tangki, blender, filter housing, sistem sirkulasi air (Lina, 2009).

9. Apakah metode pengemasan dan kondisi penyimpanan mempengaruhi tipe mikroorganisme bahan pangan yang akan dianalisis? Jelaskan alasan anda!Ya, metode pengemasan dan kondisi penyimpanan sangat mempengaruhi jenis mikroorganisme yang tumbuh. Suhu saat penyimpanan sangat berpengaruh, mikrooganisme dapat bertahan di dalam suatu batas-batas suhu tertentu. Batas-batas itu ialah suhu minimum dan suhu maksimum, sedang suhu yang paling baik bagi kegiatan hidup itu disebut suhu optimum. PH juga mempengaruhi perkembangan mikrobia yang tumbuh, mikroba dapat tumbuh baik pada daerah pH tertentu, misalnya untuk bakteri pada pH 6,5 7,5; khamir pada pH 4,0 4,5 sedangkan jamur dan aktinomisetes pada daerah pH yang luas. Setiap mikrobia mempunyai pH minimum, optimum dan maksimum untuk pertumbuhannya. Metode pengemasan seperti dengan cara di vacuum akan mengakibatkan bakteri aerob tidak akan tumbuh dan hanya bakteri anaerob yang dapat bertahan (Suriawiria,2005).

Komponen Penilaian LKP:Jenis PenilaianNilai MaksimalNilai yang diperoleh

Pre lab 20

Diagram Alir10

Data Hasil Pengamatan dan Pembahasan70

TOTAL100

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan: Malang

Jaya, Firman. 2008. Uji BakteriI Eschericia Coli Pada Depo Air Mnum Isi Ulang. Bali

Waluyo L. 2008. Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi. Universitas Muhammadiyah Malang Press. Malang.

DAFTAR PUSTAKA TAMBAHAN

Firmansyah, Adi. 2012. Validasi Pembersihan. UNS: Solo.Habibie, dkk. 2008. Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 2 No 4 p.231-238. UB: Malang.Lina, 2009. Validasi Proses Aseptis. UNHAS: Makassar.Roberts and Greenwood, L. 2003. Practical Food Microbiology. Blackwell Publishing: LondonSugiyono. 2003. Metode Penelitian Bisnis. Pusat Bahasa Depdiknas: Bandung.Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti: Jakarta.Wibowo, marlia singgih. 2007. Prinsip Dan Pelaksanaan Pengambilan Sampel (Sampling). ITB: Bandung.