LAPORAN PRAKTIKUM

TEKNOLOGI PRODUKSI BENIH

“KULTUR JARINGAN”

Disusun Oleh :

Nama : Nimas Ayu Kinasih

NIM : 115040201111157

Kelompok : L2 (Rabu, 09.15)

Asisten : Nindya Resha Pramesti

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2013

I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Pembuatan Bibit Secara Kultur Jaringan

Hingga saat ini, tanaman kentang menjadi salah satu tanaman hortikultura yang sangat

diminati oleh konsumen sebagai pengganti beras dan jagung. Perbanyakan tanaman kentang

secara konvensional dapat saja dilakukan, namun perbanyakan konvensional kurang bisa

diandalkan untuk memproduksi bibit dengan jumlah yang banyak dalam waktu yang singkat.

Untuk mengatasi masalah tersebut didapat suatu alternatif propagasi atau perbanyakan

menggunakan teknik kultur in vitro dengan cara kultur jaringan atau mikropopagasi, yaitu

dengan meristem tunas atau meristem tangkai bunga sebagai eksplan atau melalui organogenesis

in vitro dari eksplan ujung akar atau potongan dari bagian daun in vitro. Dengan kultur jaringan

yang telah ditentukan akan menciptakan suatu individu baru dengan jumlah yang cukup banyak

dan proses perkembangbiakan sel tanaman dapat berkembang dengan baik karena memiliki

media yang sesuai. Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.

Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan

sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang

dihasilkan. Bibit yang diharapkan dari kultur jaringan adalah bibit tersebut mempunyai beberapa

keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak

dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu

menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit

lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan

konvensional.

Tahap-tahap dalam kultur jaringan pembuatan media, inisiasi, sterilisai, multiplikasi,

pengakaran, dan aklimatisasi. Tahapan ini juga merupakan syarat yang harus diperhatikan dalam

proses atau tahapan kultur jaringan.

1.2. Tujuan Pembuatan Bibit Secara Kultur Jaringan

Adapun tujuan dari kegiatan kultur jaringan ini adalah untuk memperbanyak tanaman

secara in vitro agar diperoleh benih-benih yang berkualitas, mempunyai sifat yang identik

dengan induknya, serta sehat.

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Pengenalan Alat dan Pembuatan Larutan Induk

The basic equipment in most tissue culture facilities includes the following: An autoclave

is basically a large-sized but sophisticated pressure cooker, and is used for the sterilisation of the

medium, glassware and instruments. Autoclaves of different sizes are available commercially.

High-pressure heat is needed to sterilise media, water, and glassware. Certain spores from fungi

and bacteria are killed only at 121°C and 1.05kg/sq.cm (15 pounds per sq. inch) pressure. Self-

generating steam autoclaves are more dependable and faster to operate. The laminar flow

chambers provide clean filtered air that allows cultures to be handled under contamination-free

environment. Several types of laminar flow chambers are sold on the market and are available in

different sizes. The laminar-flow cabinets are located in the culture transfer area. Some large-

sized laboratories have sterile rooms in addition to laminar flow cabinets (Prakash, 1996).

2.2. Pembuatan Media in vitro

The main components of most plant tissue culture media are mineral salts and sugar as

carbon source and water. Other components may include organic supplements, growth

regulators, a gelling agent, (Gamborg et al., 1968; Gamborg and Phillips, 1995). Although, the

amounts of the various ingredients in the medium vary for different stages of culture and plant

species, the basic MS (Murashige and Skoog, 1962) and LS (Linsmaier and Skoog, 1965) are the

most widely used media.

Media compositions have been formulated for the specific plants and tissues (Nitsch and

Nitsch, 1969; Conger, 1981). Some tissues respond much better on solid media while others on

liquid media. In general, the choice of medium is dictated by the purpose and the plant species or

variety to be cultured. Plant extracts such as coconut milk, banana extract, and tomato juice can

be very effective in providing undefined mixture of organic nutrients and growth factors.

2.3. Isolasi dan Inokulasi Explant

Isolation is the process of making certain parts of the body sires to be embedded into your

PDA media. That part is going to grow into a pure culture. Insulation must be done very

carefully and cautious because it determines the resulting purity culture. Tissue culture planting

material derived from plant or plant tissue, either in the form of meristems, shoots and roads.

Tissue culture planting material is called the explant. Usually the tissue explant derived from

plants that are still actively dividing, and the goal of plant breeding is taken mikropropagasi plant

organ that is not derived from the generative organs. Explant to be planted (inoculated) in tissue

culture media must be in a state of sterile free of microorganisms. Separation plant and the

sterilization process is called isolation (Jackson, 2003).

2.4. Aklimatisasi

Acclimatization is the process of adjustment of the conditions of micro plantlets in bottles

(heterotrophic) to external environmental conditions (autotrophs). Plantlets were maintained under sterile

conditions in the environment (temperature and humidity) optimal, highly vulnerable to the external

environment (field). Plantlets were grown in culture in the laboratory has a different characteristic leaf

plantlets were grown in the field. Leaves of plantlets in general have a more open stomata, number of

stomata per unit area more, and often do not have a waxy coating on their surface. Thus, the plantlets are

very susceptible to low humidity. Given these properties, before planting in the field, requiring plantlets

acclimatization. Acclimatization can be conducted in a greenhouse or nursery, either in a greenhouse or

nursery. In acclimatization, growing environment (particularly moisture) gradually adapted to field

conditions. The move was made carefully and gradually, by providing containment. Hoods are used to

protect seedlings from the outside air and pest attacks because tissue culture seedlings are very susceptible

to pests and diseases outside air. Once the seedlings are able to adapt to the new environment gradually

released and the maintenance hatch seeds carried in the same manner with the generative seed

maintenance (Smith dan Spomer, 1995).

Isi gelas dengan aquades kurang lebih 50 ml

Tambahkan unsur-unsur yang sudah di stok :

Makro : 30 ml

Mikro A : 3 ml

Mikro B : 0,5 ml

Fe EDTA : 3 ml

Vitamin : 0,3 ml

CaCl2 : 3 ml

Tambahkan aquades hingga volume mencapai 300 ml

Stirer (aduk) dan ukur pH 5,8 (pH indikator)

Masukkan sukrosa (gula) dan agar-agar. Sukrosa : 9 gram dan agar-agar: 2,1 gram

Stirer (aduk) beberapa menit sampai larutan berwarna bening

Mikrowave selama 7 menit

Masukkan ke dalam botol kultur @15 ml. tutup dengan plastik dan rapatkan dengan karet gelang.

Bilas gelas dengan menggunakan aquades

III. MATERI BAHASAN

3.1. Pembuatan Media Perbanyakan (Inokulasi/Penanaman)

3.1.1. Metode (Tahap Pelaksanaan/Cara Kerja)

Tutup dengan plastik wrap dan di lubangi

3.1.2. Hasil Dan Pembahasan

Berdasarkan hasil praktikum untuk pembuatan perbanyakan media kultur,

kelompok kami tidak sampai melakukan pengamatan terhadap kontaminasi media karena

kegiatan praktikum yang dilakukan hanya sampai tahap sterilisasi dengan autoclaf.

Sedangkan kelompok kami menggunakan media kultur dari kelompok sebelumnya.

Tetapi media kultur dari kelompok sebelumnya dikatakan berhasil dan tidak

terkontaminasi. Hal ini terlihat saat penanaman berlangsung, media tidak terkontaminasi

bakteri maupun jamur sehingga dapat digunakan untuk penanaman eksplant. Hal ini

karena pembuatan media dilakukan sesuai langkah kerja dan alat-alat yang digunakan

dalam keadaan steril. Media yang banyak digunakan sampai saat ini adalah MS. Untuk

mengembangbiakan pada organogenesis yang diinginkan, kedalam media ditambahkan

zat pengatur tumbuh.

Menurut Kyte, 1996 pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas

dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121o C, tekanan yang biasa

digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi

tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media

antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang

terlalu lama menyebabkan: penguraian gula, degradasi vitamin dan asam-asam amino,

inaktifasi sitokinin zeatin riboside, dan perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi

agar. Menurut (Smith & Spomer, 1995) persyaratan botol yang digunakan dalam kultur

in vitro adalah dapat melewatkan cahaya, mampu mengisolasi medium dari kehilangan

air, mencegah kontaminasi, memungkinkan pertukaran udara dan menyediakan area

tumbuh yang mencukupi. Penutup botol kultur yang digunakan umumnya sangat rapat

terutama untuk mencegah kontaminasi dari luar. Menurut Jackson (2003) penggunaan

penutup yang terlalu rapat dapat menghalangi pertukaran udara luar dan dalam botol,

meningkatkan kelembaban, dan meningkatkan kandungan etilen yang dapat

mempengaruhi pertumbuhan planlet.

Keluarkan dan segera masukkan ke ruang simpan

Sterilisasi autoclave 15 psi, 121°C selama 25 menit

3.2. Penanaman/Isolasi Dan Inokulasi Eksplan

3.2.1. Metode (Tahap Pelaksanaan/Cara Kerja)

a. Sterilisasi Eksplan

b. Penanaman di LAFC

3.2.2. Hasil Dan Pembahasan

NO DOKUMENTASI KETERANGAN

1

TANGGAL 6 MEI 2013

Mata tunas terlihat segar karena awal

penanaman.

2

TANGGAL 7 MEI 2013

Mata tunas tetap terlihat segar, tetapi

sebagian dari bagian ujungnya

mengalami browning akibat terkena

panas pinset saat inokulasi dan terlalu

lamanya perendaman dalam bayclean.

3

TANGGAL 8 MEI 2013

Mata tunas tetap terlihat segar dan

semakin memanjang, sehingga bagian

yang mencoklat berubah menjadi di

bagian tengah mata tunas. Muncul

cabang mata tunas baru.

4 - Libur nasional.

5

TANGGAL 10 MEI 2013

Mata tunas tetap terlihat segar dan

terus memanjang. Tetapi bagian

tengah mata tunas tetap mencoklat.

Cabang mata tunas tetap segar.

6

TANGGAL 11 MEI 2013

Mata tunas terlihat tetap segar dan

terus memanjang. Bagian tengah mata

tunas yang mencoklat semakin

menghilang. Cabang mata tunas

semakin segar.

- % eksplan yang hidup = 1/1 × 100% = 100%

- % inisiasi tunas = 1/1 × 100% = 100% dan tunas muncul 2 hari setelah inokulasi

- % inisiasi akar = 1/1 × 100% = 100% dan akar muncul 2 hari setelah inokulasi (tetapi

tidak terlihat dengan jelas munculnya akar)

- % kontaminasi = 0/1 × 100% = 0%

Setelah semua perlakuan dilaksanakan dengan runtut dan eksplan pun ditanam

pada media tanam, langkah selanjutnya adalah disimpan di ruang inkubasi untuk

dilakukan pengamatan. Berdasarkan hasil pengamatan yang dilakukan selama seminggu

setelah inokulasi didapati bahwa eksplan kentang tumbuh dengan subur. Hal ini dapat

diketahui tetap segarnya mata tunas dan semakin mengalami pemanjangan. Serta terdapat

cabang mata tunas yang baru tumbuh. Namun terlihat terjadinya browning (kecoklatan)

pada bagian eksplan akibat eksplan yang terkena panas dari pinset saat inokulasi dan

terlalu lamanya perendaman di dalam bayclean. Tetapi semakin lama bagian tersebut

hilang dan eksplant akan tumbuh menjadi planlet. Ini terjadi karena ada beberapa faktor

yang dapat mempengaruhi keberhasilan kultur jaringan.

Menurut Yusnita, 2005 bahwa faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan dari

kultur jaringan antara lain adalah suhu, kelembaban relatif, cahaya, dan kondiisi eksplan.

Sedangkan untuk faktor-faktor yang mempengaruhi kontaminasi eksplan yang

diungkapkan oleh Pierik, 1999 adalah sebagai berikut :

Kualitas induk eksplan

Kualitas Media Penanaman

Pengalaman teknisi

Kualitas strelisasi eksplan, media, LAFC, Teknisi.

Konsentrasi Nutrisi pada media Penanaman

Kadar kontaminan di lingkungan

Salah satu yang sangat mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis eksplan

dalam kultur invitro adalah genotip tanaman asal eksplan diisolasi. Hasil-hasil penelitian

menunjukan bahwa respon masing-masing eksplan tanaman sangat bergantung dari

spesies, bahkan varietas, atau tanaman asal eksplan tersebut. Pengaruh genotip ini

umumnya berhubungan erat dengan faktor-faktor lain yang mempengaruhi pertumbuhan

eksplan, seperti kebutuhan nutrisi, zat pengatur tumbuh, dan lingkungan kultur. Oleh

karena itu, komposisi media, zat pengatur tumbuh, dan lingkungan pertumbuhan yang

dibutuhkan oleh masing-masing varietas tanaman bervariasi meskipun teknik kultur

jaringan yang di gunakan sama. Perbedaan komposisi media, seperti jenis dan komposisi

garam-garam anorganik, zat pengatur tumbuh sangat mempengaruhi respon eksplan saat

dikulturkan. Perbedaan komposisi media biasanya sangat mempengaruhi arah

pertumbuhan dan regenerasi eksplan.

Seperti apa yang dikemukakan oleh Andria bin Muhayat bahwa “eksplan yang

terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih sampai biru (disebabkan

jamur) atau busuk (disebabkan bakteri) (Zulkarnain, 2009). Browning was a serous

problem for culture of Delaware protoplasts. Previous reports indicate that protoplasts of

dihaploid clones and commercial cultivars of potato have shown a similar phenomenon.

The reason for polarised browning is unknown, but this could be due to local changes in

pH on one side of the protoplasts, or alterations of components, particularly Fe2+

ions in

the culture medium. However, this phenomenon needs to be studied in more details

(Tavazza,1986).

3.3. Pembuatan Stok Media MS

Menghitung kebutuhan induk

Menyiapkan larutan induk yang telah di hitung dengan rumus pengenceran

Mencampur bahan dasar ke dalam beker glass ditambah sukrosa

Dan aquades steril

Mengukur Ph

Menambah agar kedalam media

Siapkan botol kultur

Tuang larutan ke dalam botol

Sterilkan dengan autoclave

Siampan dalam ruang simpan

Media Murashige dan Skoog (MS) sering digunakan karena cukup memenuhi unsur hara

makro, mikro, dan vitamin untuk pertumbuhan tanaman. Nutrien yang tersedia di media berguna

untuk metabolisme, dan vitamin pada media dibutuhkan oleh organisme dalam jumlah sedikit

untuk regulasi. Pada media MS, tidak terdapat zat pengatur tumbuh (ZPT) oleh karena itu ZPT

ditambahkan pada media (eksogen). ZPT atau hormon tumbuhan berpengaruh pada pertumbuhan

dan perkembangan tanaman. Interaksi dan keseimbangan antara ZPT yang diberikan dalam

media (eksogen) dan yang diproduksi oleh sel secara endogen menentukan arah perkembangan

suatu kultur (Zulkarnain, 2009).

3.4. Aklimatisasi

Aklimatisasi adalah kegiatan pemindahan plantlet (tanaman kecil) dari media in vitro ke

media in vivo (lingkungan sebenarnya). Proses pemindahan ini memerlukan keadaan yang

mendukung agar plantlet tidak mengalami stress lingkungan. Di antara kegiatan yang dilakukan

adalah memberikan kelembaban tinggi hingga 80% dan struktur media remah serta kandungan

nutrisinya yang memadai selama masa transisi plantlet. Akan tetapi pada kegiatan praktikum

kultur jaringan ini, proses kultur jaringan kentang tidak sampai pada tahap aklimatisasi

dikarenakan tidak ada alat yang mendukung (hanya sampai inkubasi saja). Planlet sangat rentan

terhadap kelembaban rendah. Mengingat sifat-sifat tersebut, sebelum ditanam di lapang, planlet

memerlukan aklimatisasi. Aklimatisasi dapat dilakukan di rumah kaca atau pesemaian, baik di

rumah kaca atau pesemaian. Dalam aklimatisasi, lingkungan tumbuh (terutama kelembaban)

berangsur-angsur disesuaikan dengan kondisi lapang.

Rainiyati, dkk (2011) menjelaskan bahwa pada aklimatisasi awal dalam kultur jaringan

kentang dilakukan pemindahan planlet dari lingkungan in vitro ke lingkungan semi steril dalam

medium greenleaf yang steril dengan penambahan unsur-unsur hara dari larutan stok MS½. Pada

tahap ini planlet diadaptasikan dari lingkungan heterotrof kelingkungan autorotrof dan induksi

untuk membentuk tunas sebagai bahan setek yang siap ditanam. Sebelum ditanam, setek mikro

(planlet) tersebut dibersihkan terlebih dahulu dari sisa-sisa medium kultur (agar) yang melekat

pada akar dengan cara mencucinya di bawah air mengalir. Kemudian planlet ditanam pada

medium greenleaf yang ditempatkan pada bak-bak aklimatisasi yang ditutup kain kasa dan

dipelihara selama 2 minggu.

Tahap awal aklimatisasi adalah menyediakan media tanam dari campuran tanah topsoil

dan kompos dengan perbandingan 1 : 1 yang telah disterilkan dengan sistem penguapan panas

dalam kukusan. Medium tanam selanjutnya dimasukkan dalam bak-bak penanaman berukuran 40

x 32 x 8 cm. Pemeliharaan selama aklimatisasi meliputi penyiraman, pembuangan tanaman yang

mati serta penyulaman. Penyiraman dilakukan setiap hari dengan menggunakan handprayer.

Untuk menjaga pertumbuhan yang baik tanaman disemprot dengan larutan pupuk NPK(3g L-1)

dan bayfolan (2ml L-1).

IV. KESIMPULAN

Berdasarkan kegiatan praktikum produksi benih dengan kultur jaringan yang telah dilakukan

maka didapatkan kesimpulan sebagai berikut :

Kesterilan media sangat mempengaruhi keberhasilan dari kultur jaringan.

Selain itu ada beberapa faktor yang mempengaruhi kontaminasi eksplan, antara lain:

Kualitas induk eksplan

Kualitas media penanaman

Pengalaman teknisi

Kualitas strelisasi eksplan, media, dan LAFC

Konsentrasi nutrisi pada media penanaman

Kadar kontaminan di lingkungan

Hasil kultur jaringan eksplan kentang yang diamati selama seminggu setelah inokulasi didapati

bahwa eksplan dalam keadaan segar dan tumbuh menjadi planlet.

DAFTAR PUSTAKA

Conger, B.V. 1981. Cloning Agricultural Plants via In Vitro Techniques. CRC Press, Boca Raton, FL

Gamborg, O.L. and Phillips, G.C. 1995. Media preparation and handling. In: Plant Cell, Tissue and

Organ Culture - Fundamental Methods. Gamborg, O.L. and G.C. Phillips (Eds.). Springer-

Verlag: Berlin. Pp.21-34.

Gamborg, O.L., Miller, R.A. and Ojima, K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of

soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: 151-158.

Kyte, Lydiane, & John Kleyn. 1996. Plants from Test Tubes. Timber Press: USA.

Jackson, MB. 2003. Aeration stress in plant tissue culture. Bulg J Plant Pysiol 28, 96-109.

Linsmaier, E.M. and Skoog, F. 1965. Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures.

Physiol. Plant. 18: 100-127.

Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco

tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

Nitsch, J.P. and Nitsch, C. 1969. Haploid plants from pollen grains. Science, 163: 85-87.

Pierik, R.L.M. 1999. In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff: Dordrecht.

Prakash, J. 1996. Biovillage Biotechnologies. Rep. Asian Biotechnology and Biodiversity Farmer

Centred Agriculture Resource Management (FARM) Programme, UNDP/FAO/UNIDO. In

Vitro International: Bangalore, India.

Rainiyati, dkk. 2011. Proses Penyediaan Bahan Setek Kentang Asal Kultur Jaringan untuk Produksi

Bibit Kentang Mini pada Kelompok Tani Kentang di Kecamatan Kayu Aro Kabupaten Kerinci

ProvinsiJambi. Jurnal Pengabdian pada Masyarakat N0. 52 Tahun 2011.

Smith M & L Spomer. 1995. Vessels, gels, liquid media, and support system. In: J Aitken-Christie, T

Kozai & ML Smith (eds.) Automation and Environmental Control in Plants Tissue Culture.

Netherlands, Kluwer Academic Publishers. p. 371-404.

Tavazza, R. and Ancora, G. Plant regeneration from mesophyll protoplasts in commercial potato

cultivars (Primura, Kenebec, Spunta, Desiree). Plant Cell Rep., 5: 243-46, (1986).

Yusnita.2005.Kultur Organ Tanaman Eksplan. Balai Pengakajian Ilmiah. Universitas Sudirman:

Yogyakarta.

Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Bumi Aksara: Jakarta.

KRITIK DAN SARAN UNTUK PRAKTIKUM

Sebenarnya untuk praktikum teknologi produksi benih sudah cukup baik. Tapi perlu adanya

perbaikan untuk koordinasi antara asisten dan praktikan agar praktikum dapat berjalan dengan lancar

dan menyenangkan.

Kritik :

Penjelasan tentang materi kultur jaringan sendiri kurang detail, sehingga beberapa materi

belum tersampaikan kepada praktikan. Namun dengan adanya fieldtrip lapang tentang kultur

jaringan anggrek dapat menyempurnakan materi kultur jaringan dari asisten.

Saran :

Karena sebagian besar hasil kultur jaringan praktikan menjadi kontam, sehingga perlu

diantisipasi sebelum praktikum kultur jaringan, yaitu dengan cara diberikan cara yang tepat agar

kontaminasi dapat diminimalisir. Semoga praktikum Teknologi Produksi Benih, khususnya kultur

jaringan bisa lebih baik lagi untuk ke depannya.

Semangat