laporan jadi.docx
TRANSCRIPT
PEWARNAAN GRAM
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan
gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram
(1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (filzahazny,
2008).
Pewarnaan gram termasuk pewarnaan diferensial yang digunakan untuk
membedakan bakteri gram negative dan bakteri gram positif.
Perbedaan gram (+) dan gram (-)
Sifat Gram (+) Gram (-)
• Komposisi Kandungan lipid rendah Kandungan lipid tinggi
• Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitif Lebih tahan
• Penghambatan warna Lebih dihambat Kurang dihambat
• Ketahanan terhadap fisik Lebih tahan Kurang tahan
• Kebutuhan Nutrien Kompleks Relatif
Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pewarna basa,yaitu kristal violet.Lalu
digunakan larutan iodin pada tahap ini,seluruh bakteri akan berwarna biru.Lalu sel
akan diberi alkohol.sel gram positif akan mempertahankan kompleks kristal
violet-iodin sehingga tetap berwarna biru;sedangkan sel gram negatif akan
kehilangan warna birunya karena alkohol.pada langkah terakhir digunakan
counterstain (misalnya,pewarna merah safranin ) sehingga sel gram negatif yang
tadinya kehilangan warna akan memiliki warna yang kontras;sel gram positif
sekatang akan berwarna ungu.
Pewarnaan gram merupakan prosedur yang sangat membantu dalam mikrobiologi
diagnostik.Sebagian besar spesimen yang diserahkan ketika dicurigai terjadi
infeksi oleh bakteri,harus diapus pada slide kaca ,diberi pewarnaan gram dan
diperiksa dibawah mikroskop.Pada pemeriksaan mikroskop reaksi gram dan
morfologi bakteri harus diperhatikan.Gambaran bakteri pada apusan yang
diwarnai gram tidak memungkinkan identifikasi spesies.
Adapun metode pewarnaan gram yaitu:
1. Fiksasi apusan dengan pewrnaan gram
2. Lapisi dengan larutan ungu kristal
3. Bilas dengan air,jangan membeku.
4. Lapisi dengan larutan yodium Gram
5. Bilas dengan air,jangan membeku.
6. Kaburkan warna selama 10-30 detik dengan agitasi perlahan dalam aseton
(30 mL dan alkohol 70 mL)
7. Bilas dengan air,jangan membeku.
8. Lapisi dengan larutan safranin selama 10-30 detik(larutan 2,5 % dalam
alkohol 95 %)
9. Bilas dengan air dan biarkan mengering.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk
mengintensifkan warna utama.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang
digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga
alcohol.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
PEWARNAAN TAHAN ASAM
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok
Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini
disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama
(carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan
asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam
karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol
fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay, 1994).
Uji bakteri tahan asam (BTA) pada praktikum kali ini menggunakan prosedur
pewarnaan Ziehl Neelson yaitu dengan memberi larutan pewarna carbol fuchsin,
alkohol asam, dan methylen blue. Hasil yang diperoleh saat praktikum yaitu
positif 1 dan positif 2 yang dilaporkan secara kuantitatif menurut IUAT, yaitu:
Negatif: apabila tidak ditemukan BTA.
Positif: apabila terdapat 1 – 9 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 1: apabila terdapat 10 – 90 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 2: apabila terdapat 1 – 9 BTA / 1 lapang pandang.
Positif 3: apabila terdapat > 10 BTA / 1 lapang pandang.
Tujuan pemberian carbol fuchsin 0,3% adalah untuk mewarnai seluruh sel bakteri.
Tujuan pemberian alkohol asam 3% adalah meluruhkan warna dari carbol fuchsin,
tetapi pada golongan BTA tidak terpengaruh pemberian alkohol asam 0,3%
karena memiliki lapisan lipid yang sangat tebal sehingga alkohol sukar menembus
dinding sel bakteri tersebut dan warna merah akibat pemberian carbol fuchsin
tidak hilang. Tujuan pemberian methylen blue adalah memberi warna background
(Pelczar dan Chan, 1986).
Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan asam karbolfuchsin
(fuchsin basa yang terlarut dalam campuran fenol-alkohol-air)bahkan jika dicuci
dengan asam hidroklorat dalam alkohol dalam alkohol.sediaan apapun apus sel
pada pada slide dimasukkan dalam karbolfuchsin dan dipanaskan dengan uap
panas.Dalam hal ini pelunturan wrna akan terjadi akibat alkohol-asam,dan pada
tahap akhir digunakan pewarna pembalik (counterstain)yang kontras.Bakteri
tahan asam akan berwarna merah yang lain akan berwarna sama dengan pewarna
pembalik.
Metode pewarnaan tahan asam Ziehl-Neelsen yaitu:
1. Fiksasi apusan dengan pemanasan
2. Lapisi dengan larutan karbolfuchsin,panaskan hati-hati selama 5 menit
diatas diatas api langsung (atau selama 20 menit dengan water bath)
3. Bilas dengan air
4. Kaburkan warna dengan asam-alkohol sampai warna merah mudah pucat
menetap
5. Bilas dengan air
6. Warnai lagi selama 10-30 detik dengan larutan metilen biru Loeffler
7. Bilas dengan air dan biarkan mengering.
PEWARNAAN SPORA
Spora adalah bahan refraktil intraselular yang paling mudah diamati pada suspensi
sel yang tidak diwarnai,atau tampak seperti area yang tak berwarna pada sel-sel
yang diwarnai dengan pewarna konvensional.Dinding spora relatif tidak
permeabel,namun zat warna dapat menembusnya dengan cara memanaskan
preparat.Impermeabilitas ini juga mencegah pelunturan warna spora akibat
pemakaian alkohol dalam jangka waktu yang cukup untuk melunturkan warna sel-
sel vegetatif.
Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa,
diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora
yang paling banyak digunakan. Hasil pewarnaan : badan bakteri berwarna
biru, spora berwarna merah.
Caranya :
1. Buat suspensi biakan bakteri berumur 72 jam dalam larutan NaCl
Fisiologik di dalam tabung, tambahkan ke dalam suspensi tadi larutan
karbol-fukhsin dalam jumlah yang sama banyak dan panaskan di atas api
kecil selama 5 menit
2. buatlah sediaan oles dari campuran tersebut
3. setelah kering dan difiksasi tuangi larutan H2SO4 1 % selama 2 detik
4. beri alkohol 96% selama 2 detik kemudian cuci dengan air bersih
5. beri larutan biru-metilen dan biarkan selama 3 menit
6. cuci lagi dengan air lalu keringkan dengan kertas saring
Untuk mempermudah pengamatan, terutama pada spora bakteri dilakukan metode
pewarnaan spora agar peneliti ataupun pengamat mampu melihat spora,
membedakan dengan vel vegetatif ataupun mengamati bentuknya. Menurut
Waluyo (2004) endospora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada
umumnya. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan endospora
dengan larutan Hijau Malakit. Metode Shaeffor, foton endospora diwarnai
pertama dengan larutan Hijau Malakit. Pada pengecatan ini, sifatnya kuat karena
dapat berpenetrasi ke dalam endospora dengan perlakukan larutan Hijau Malakit.
Teknik ini akan menghasilkan warna hjau pada endospora dan merah pada sel
vegetatif.
Prosedur pewarnaan spora bakteri adalah sebagai berikut:
1. Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan di atas nyala api spritus.
2. Teteskan setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut
3. Secara aseptic ambillah inokulum bakteri yang akan diperiksa lalu letakkan
di atastetesan aquades itu kemudian ratakan perlahan-lahan
4. Ambillah kaca benda lain yang bersih lalu letakkan di ats kaca benda
sediaan tersebut sehingga membentuk sudut 450
5. Geserkan kaca benda yang tegak ini, sehingga sediaan menjadi tipis dan
merata, biarkan sampai mengering
6. Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut di atas nyala api
lampu spritus dengan cepat
7. Teteskan larutan hijau malakit di atas sediaan itu lalu panaskan sediaan
tersebut diatas nyala api spritus selama 3 menit, jagalah jangan sampai sediaan
mendidih atau mengering, jika mengering, tambahkan tetesan larutan hijau
malakit. Selama pemanasan jepitlah sediaan dengan pinset.
8. Letakkan larutan hijau malakit di atas kawat penyangga yang diletakkan di
atas mangkuk pewarna, lalu biarkan sampai dingin
9. Cucilah kelebihan larutan hijau malakit dengan air kran dalam botol
penyemprot
10. Teteskan larutan safranin di atas sediaan tersebut, lalu biarkan selama satu
menit
11. Cucilah kelebihan larutan safranin pada sediaan itu
12. Keringkan seiiaan dengan kertas penghisap dan amatilah di bawah
mikroskop.
Jika pewarnaan ini berhasl dengan baik, maka sel vegetatif bakteri akan
berwarna merah, jika sel membentuk spora maka spora akan Nampak
berwarna hijau
PEWARNAAN NEGATIF
Prosedur ini melibatkan pewarnaan latar belakang dengan pewrna
asam,menyebabkan sel yang diuji jelas tak berwarna.Pewarna hitam nigrosin
kerap digunakan.Metode ini dipakai pada sel atau struktur yang sulit diwarnai
secara langsung.
Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau
negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus
atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan
bakteri.oleh karena itu,sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang
berwarna.
Pada pengecatan ini digunakan cat asam nirosin (tinta cina). Pengecatan ini
dilakukan untuk mewarnai latar belakang preparat sedangkan bakteri sendiri tidak
terwarnai serta untuk mengamati ukuran, bentuk, dan tata letak sel. Setelah
pengamatan dibawah mikroskop diperoleh preparat mikroba berwarna hitam
sedangkan bakteri sendiri tidak berwarna (berwarna putih) dan berbentuk basil
(batang).
Cara pewarnaan negatif
- Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskop
Adapun metode pewarnaannya yaitu:
1.Membersihkan gelas objek dengan alcohol 70 % agar bebas lemak.
2. Mengambil 1 ose yang digunakan umntuk mengambil biakan, meletakkan
biakan pada objek gelas kemudian mencampur dengan 1-2 tetes nigrosin.
3. Dengan menggunakan objek gelas lain menyentuhkan sisi objek gelas
C,tersebut pada sampel tersebut sehingga membentuk sudut 300 selanjutnya
menarik objek gelas tersebut dengan arah yang berlawanan hingga membentuk
film tipis.
4. Membiarkan hingga mengering lalu mengamati diubawah mikroskop dengan
pembesaran 100x dan menggunakan minyak imersi.
PEWARNAAN KAPSUL
Prosedur seperti pewarna kapsul (metode welch) melibatkan penggunaan larutan
kristal violet panas yang dilanjutkan dengan pembilasan menggunakan larutan
tembaga sulfat.proses pembilasan ini dimaksudkan untuk menghilangkan warna
yang berlebihan karena pembilasan konvensional dengan air bisa melarutkan
kapsul.Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang,dan memberikan
tampakan hasil berupa latar belakang berwarna biru pucat.
Pada beberapa jenis bakteri adanya kapsul sebagai petunjuk virulensi. Semua
kapsul bakteri tampaknya dapat larut dalam air. Komposisi kimiawi kapsul ada
yang berupa glukosa ( misalnya dektrosa pada leokonostok mesendteroides),
polimer gula amino (misalnya asam hialuronat pada Staphylococcus piogenik),
polipeptida (misalnya polimer asam D-glutamat pada Bacillus antraksis) atau
kompleks polisakarida protein ( misalnya B disentri).
Simpai biasanya diperlihatkan dengan cara pewarnaan negatif atau modifikasi dari
cara itu. Salah satu pewarnaan simpai (kapsul) ini ( metode Welch) meliputi
pemberian larutan kristal ungu panas disusul kemudian dengan pencucian dengan
larutan tembaga sulfat. Tembaga sulfat ini digunakan untuk menghilangkan zat
warna berlebihan karena pencucian biasa dengan air akan melarutkan simpai.
Garam tembaga memberi pula warna pada latar belakang, sehingga sel dan latar
belakang akan tampak biru tua dan simpai berwarna biru yang lebih muda.
Cara Kerja :
• Persiapkan 2 buah objek glass yang bersih dan bebas lemak
• Letakkan 1 ose tinta cina pada bagian pinggir objek glass
• Diambil 1 ose suspensi bakteri, campurkan dengan tinta cina sampai homogen
• Dengan ujung objek glass yang lain, buat hapusan, dibiarkan kering dan fiksasi
• Ditambahkan carbol fuchsin 1/10 selama 1 menit
• Sisa cat dibuang dan dikeringkan..
• Diperiksa dibawah mikroskop.
Interpretasi hasil : Kapsul: transparan dan Badan bakteri : warna merah.
PEWARNAAN SEDERHANA
Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan
larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah
difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.Pewarnaan sederhana, merupakan
pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya
digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri
telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat
basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif).
Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan
bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan
lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo, 1990).
Pengecatan sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras
antara sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel
mikroba itu sendiri, dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna
khususnya warna Kristal violet. Dan Menggunakan suatu zat warna seperti
methylen blue,air fuchsin,gentian violet,kristal ungu, biru methylen lofer.
Pada pengecatan sederhana digunakan bakteri Bacillus cereus dan Salmonella
typii. Setelah pengecatan diperoleh bakteri tersebut berwarna ungu, yang berarti
bakteri tersebut menyerap zat warna cat tersebut sehingga Nampak pada
mikroskop. Zat warna yang umunya digunakan yakni yang bersifat alkalin
(kromatofornya bermuatan +).
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang
kemudiandifiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi
jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari
bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan
melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell
dan Reece, 2005)).
Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan
pelarut.Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat
morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak
digunakan adalag biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-
karbol (5 detik).
Caranya :
1. buat sediaan oles dan simpan di atas 2 batang kawat horisontal atau
menggunakan bak pewarnaan.
2. beri zat warna sehingga seluruh sediaan tertutup penuh
3. biarkan selama waktuyang diperlukan, seperti di atas.
4. sediaan dicuci dengan air sampai bersih, lalu keringkan di antara dua kertas
saring. Lalu dapat dilihat di bawah mikroskop dengan lensa objektif 100x
menggunakan minyak imersi.
Daftar Pustaka:
Jawetz, Melnick, Adelberg, 2008, Mikrobiologi Kedokteran, edisi 23, Penerbit
Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Prescott, Harley, Klein’s, 2008, Microbiology 7th edition, Published by McGraw-Hill, Boston.
Bailey and Scott’s, 2007, Diagnostic Microbiology 12th edition, Mosby Elsevier, Houston
http://microorganisme.blogspot.com
www.fkugm2008.com
http://01-bakteri.html