LAMPIRAN

42

Lampiran 1. Prosedur Kerja Ekstraksi Minyak Buah Makasar (Brucea

javanica (L.) Merr.), Pengambilan Sampel Darah, Penetapan

Profil Urea Darah (DAM) dan Penentuan Profil Asam Urat

Darah (Follin-Wu)

A. Ekstraksi Minyak Buah Makasar (Brucea javanica (L.) Merr.)

Produksi minyak esensial diperoleh secara ekstraksi sesuai dengan

prosedur penelitian Subeki dkk. (2006) :

1. Sebanyak 80 kg tepung buah makasar direndam selama 1 minggu dan

setiap hari selama 10 menit dilakukan pengadukan. Campuran divorteks

selama 1 menit dan didiamkan selama 30 menit.

2. Filtrat disaring dengan menggunakan kain saring dan kemudian diuapkan

dengan evaporator menjadi 1 L.

3. Filtrat pekat tersebut kemudian diekstrak dengan etil asetat (EtOAc)

hingga diperoleh fraksi air dan EtOAc.

4. Fraksi CHCl³ diuapkan hingga kering dan kemudian dimasukkan ke dalam

silika gel kolom kromatografi dan dielusi dengan clorofom sehingga

diperoleh 3 fraksi.

5. Minyak esensial diperoleh dari fraksi 2 (1:2) lalu dievaporasi untuk

memperoleh minyak esensial murni.

B. Pengambilan Sampel Darah

1. Objek penelitian (itik Cihateup fase grower) disiapkan sebanyak 48 ekor.

2. Sebelum sampel darah diambil, bagian vena pectoralis dibersihkan terlebih

dahulu dengan alkohol 70%.

3. Sampel darah diambil pada bagian vena pectoralis sebanyak 9 mL dengan

menggunakan syringe.

43

4. Sampel darah tersebut selanjutnya ditampung dengan menggunakan

tabung ber-EDTA yang mengandung anti koagulan.

C. Penetapan Profil Urea Darah (DAM)

1. Disediakan 31 tabung reaksi, yaitu 1 tabung reaksi yang diberi tanda

standar dan 30 tabung diberi tanda uji.

2. Dipipetkan kepada tabung reaksi standar sebanyak 5 mL larutan TCA 5%

dan larutan standar sebanyak 0,25 mL.

3. Dipipetkan kedalam 30 tabung reaksi uji larutan TCA 5% sebanyak 5 mL,

serum atau darah sebanyak 0,25 mL dan larutan standar 0,25 mL.

4. Masing-masing tabung dicampur dengan baik, selanjutnya endapan dipisah

dengan cara disentrifugasi selama 5 menit. Supernatan digunakan untuk

penetapan profil urea darah.

5. Langkah berikutnya yaitu disediakan 32 buah tabung reaksi, 1 tabung

diberi tanda blanko, 1 tabung diberi tanda standar, dan 30 tabung diberi

tanda uji.

6. Dipipetkan kedalam tabung reaksi blanko larutan katalisator dan larutan

DAM masing-masing sebanyak 5 mL.

7. Dipipetkan kedalam tabung reaksi standar supernatan standar (hasil

sentrifugasi tabung reaksi standar pada langkah b dan d ) sebanyak 0,25

mL, larutan katalisator dan larutan DAM masing-masing sebanyak 5 mL.

8. Dipipetkan kedalam 30 tabung reaksi uji supernatan serum (hasil

sentrifugasi tabung reaksi uji pada langkah c dan d sebelumnya) sebanyak

0,25 mL, larutan katalisator dan larutan DAM masing-masing sebanyak 5

mL.

9. Selanjutnya larutan dalam tabung dicampur dengan baik.

44

10. Lalu seluruh tabung diletakkan dalam penangas air mendidih selama 6

menit.

11. Kemudian tabung diangkat dari penangas dan didiamkan selama 10 menit

pada suhu kamar.

12. Serapan sampel dibaca pada panjang gelombang 525 nm. Warna yang

terbentuk cepat memucat, sehingga pembacaan harus cepat dilakukan.

D. Penentuan Profil Asam Urat Darah (Folin-Wu)

1. Sampel yang diperlukan yaitu filtrat darah bebas protein dibuat terlebih

dahulu dengan menggunakan cara Follin-Wu.

1) Dipipetkan 7 mL akuades kedalam labu Erlenmeyer 125 mL yang

kering.

2) Ditambahkan 1 mL bahan yang akan diperiksa, lalu labu digoyang

dengan perlahan.

3) Ditambahkan 1 mL larutan Na-tungstat 10%, dicampurkan dengan

cara menggoyang labu.

4) Ditambahkan 1 mL H2SO4 2/3 N secara tetes demi tetes sambil `terus

menggoyang labu.

5) Labu didiamkan selama 10 menit.

6) Lalu disaring melalui kertas saring yang kering dan filtrat yang keluar

ditampung.

2. Reagen yang diperlukan untuk menetapkan profil asam urat darah seperti

larutan urea sianida, pereaksi asam urat, larutan standar asam urat, dibuat

terlebih dahulu.

3. Pembuatan larutan (Reagen) sianida :

45

1) Dilarutkan 75 g natrium sianida dalam 700 mL air dalam gelas kimia

2000 mL.

2) Lalu ditambahkan 300 g urea dan diaduk.

3) Selanjutnya ditambahkan 5 g kalsium oksida dan aduk selama 10

menit.

4) Larutan didiamkan selama 24 jam setelah itu disaring.

5) Ditambahkan 2 g bubuk lithium oksalat.

6) Larutan dikocok selama 15 menit kemudian disaring.

4. Membuat pereaksi asam urat.

1) Dimasukkan 100 g natrium tungstat (bebas molibdat) ke dalam labu

florence 500 mL.

2) Pada labu lain dicampur 32-33 mL asam fosfat 85% dengan 150 mL

akuades.

3) Larutan asam fosfat ini dituangkan ke dalam labu berisi tungstat dan

diaduk.

4) Ditambahkan beberapa butir gelas didih dan dididihkan dengan hati-

hati diatas api kecil (burnermikro) selama 1 jam.

5) Diletakkan labu berisi 200 mL air dingin sebagai kondensor untuk

mencegah cairan hilang akibat menguap.

6) Pada akhir pendidihan dihilangkan warna yang terjadi dengan sedikit

air brom.

7) Lalu dididihkan kembali untuk menghilangkan brom yang berlebihan.

8) Selanjutnya didinginkan dan diencerkan sampai 500 mL.

5. Larutan standar asam urat 0,02 mg/5 mL dibuat dengan cara

mengencerkan larutan stok asam urat (1 mg/5 mL):

46

Membuat stok asam urat (1 mg/5 mL):

1) Dinatrium hidrogen fosfat sebanyak 9 g dan 1 g natrium dihidrogen

fosfat dilarutkan kedalam 300 mL akuades panas.

2) Bila ada cairan tidak jernih arutan tersebut disaring, lalu diencerkan

sampai 500 mL dengan akuades panas.

3) Larutan ini dituangkan kedalam labu ukur 1000 mL yang berisi 200

mg asam urat yang telah dilarutkan dengan beberapa mL akuades.

4) Larutan dikocok sampai larut sempurna dan didinginkan.

5) Lalu ditambahkan 1,4 mL asam asetat glasial dan diencerkan sampai

1000 mL.

6) Selanjutnya kloroform ditambahkan untuk mencegah tumbuhnya

jamur dan bakteri.

a. Larutan stok asam urat yang telah dibuat (langkah a sampai f)

dimasukkan sebanyak 10 mL kedalam dimasukkan labu ukur 500

mL.

b. Kemudian ditambahkan 400 mL akuades.

c. Terakhir, ditambahkan 5 mL asam klorida pekat dan diencerkan

sampai 500 mL.

6. Disediakan 62 buah tabung reaksi 25 mL dan diberi tanda, 1 tabung

ditandai blanko, 1 tabung ditandai standar dan 30 tabung ditandai uji

7. Dipipetkan kedalam tabung reaksi blanko akuades sebanyak 5 mL dan

larutan urea sianida sebanyak 10 mL.

8. Dipipetkan kedalam tabung reaksi standar larutan standar asam urat

sebanyak 5 mL dan larutan urea sianida sebanyak 10 mL.

47

9. Dipipetkan kedalam 30 tabung reaksi uji filtrat darah bebas protein

sebanyak 5 mL, standar asam urat sebanyak 5 mL dan larutan urea sianisa

sebanyak 10 mL.

10 Isi masing-masing tabung dicampur dengan cara diputar pada 60oC.

11 Pereaksi asam urat dipipetkan kedalam seluruh tabung sebanyak 4 mL

kedalam masing-masing tabung.

12 Tabung didiamkan selama 20 menit pada suhu kamar.

13 Selanjutnya, diencerkan dengan akuades hingga 25 mL dengan cara

membolak-balikkan tabung.

14 Setelah 20 menit serapan dibaca pada panjang gelombang 540 nm.

48

Lampiran 2. Output Analisis Varians Polinomial Orthogonal Pengaruh Pemberian Minyak Buah Makasar

terhadap Kadar Asam Urat Darah Itik Cihateup

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups (Combined)

Linear Term

Contrast

Deviation

8,606

7,865

0,741

3

1

2

2,869

7,865

0,371

37,358

102,423

4,826

0,000

0,000

0,019

Within Groups 1,536 20 0,77

Total 10,142 23

49

Lampiran 3. Output Analisis Contrast Orthogonal Perbedaan Kadar Asam Urat Darah dengan Level Pemberian

Minyak Buah Makasar yang Berbeda

Contrast

Value of

Contrast Std. Error t df Sig. (2-tailed)

Asam Urat

Darah

Assume equal

variances

1

2

3

3,6923

0,8158

0,6122

0,39190

0,27712

0,15999

9,422

2,944

3,826

20

20

20

0,000

0,008

0,001

Does not assume

equal variances

1

2

3

3,6923

0,8158

0,6122

0,50373

0,24894

0,11767

7,330

3,277

5,203

6,170

7,928

9,048

0,000

0,011

0,001

50

Lampiran 4. Output Analisis Varians Polinomial Orthogonal Pengaruh Pemberian Minyak Buah Makasar

terhadap Kadar Urea Darah Itik Cihateup

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups (Combined)

Linear Term

Contrast

Deviation

3516,923

3216,232

300,691

3

1

2

1171,308

3216,232

150,346

25,827

70,856

3,312

0,000

0,000

0,057

Within Groups 907,821 20 45,391

Total 4424,744 23

51

Lampiran 5. Output Analisis Contrast Orthogonal Perbedaan Kadar Urea Darah dengan Level Pemberian

Minyak Buah Makasar yang Berbeda

Contrast

Value of

Contrast Std. Error t df Sig. (2-tailed)

Urea Darah Assume equal

variances

1

2

3

-74,9822

-26,2682

-2,2908

9,52796

6,73729

3,88977

-7,870

-3,899

-0,589

20

20

20

0,000

0,001

0,562

Does not assume

equal variances

1

2

3

-74,9822

-26,2682

-2,2908

6,11830

10,54116

1,45375

-12,255

-2,492

-1,576

8,640

5,194

6,996

0,000

0,053

0,159

52

Lampiran 6. Proses Pengambilan Sampel Darah

Lampiran 7. Sampel yang telah Dicampur Reagen

Lampiran 8. Analisis Sampel Menggunakan Spektrofotometer