KRISTALISASI DAN UJI KEMURNIAN DENGAN KLT MULTI ELUEN DAN DUA DIMENSI

KRISTALISASI DAN UJI KEMURNIAN DENGAN KLT MULTI ELUEN DAN DUA DIMENSI

BAB IPENDAHULUANA. Latar BelakangBerbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat dilaboratorium kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif.Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah: (1) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), (2) Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan), dan (3) Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian). Teknik KLT dua dimensi(2-D) adalahsalah satu metodelebih fleksibeldalam pengembanganTLC.Aplikasi pertama dari2-Dmetode kromatografiuntukkromatografikertasdilaporkanpada tahun 1944olehConsden, Gordon, dan Martin. Sejak saat itu, metode ini telahbanyak digunakanuntuk pemisahansejumlah besarsenyawa yangtidak dapatdipisahkandalam percobaansatu dimensi(1-D) TLC. Dalam2-D TLC, pemisahan adalah pada satupermukaantersebardi sepanjangseluruhareaplat. Kekuatanpemecahan2-DMetodeKLTmemiliki aplikasibesar, terutamadi lingkunganbiokimia, biologi, produk alami, farmasi, dan lingkungananalisis.Analisis fitokimia merupakan bagian dari ilmu farmakognosi yang mempelajari metode atau cara analisis kandungan kimia yang terdapat dalam tumbuhan atau hewan secara keseluruhan atau bagian-bagiannya, termasuk cara isolasi atau pemisahannya.Keanekaragaman tanaman yang dihasilkan didaerah tropis seperti diindonesia ini, tentunya ada beberapa tanaman yang dapat dijadikan sebagai tanaman obat. Baik yang langsung dapat dinikmati ataupun harus mengalami proses pengolahan.Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat adalah: (1) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), (2) Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan), dan (3) Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian).Fitokimia biasanya digunakan untuk merujuk pada senyawa yang ditemukan pada tumbuhan yang tidak dibutuhkan fungsi normal tubuh, tapi memiliki efek yang menguntungkan bagi kesehatan atau memiliki peran aktif bagai pencegahan.Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran dimana cuplikan berkesetimbangan di antara dua fasa, fasa gerak yang membawa cuplikan dan fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif.Bila fasa gerak berupa gas, disebut kromatografi gas, dan sebaliknya kalau fasa gerak berupa zat cair, disebut kromatografi cair.B. Maksud dan Tujuan praktikum1. Maksud praktikumAdapun maksud dari praktikum ini adalah mengetahui dan memahami cara memisahkan atau mengisolasi senyawa-senyawa kimia dalam jumlah banyak dalam suatu tanaman yaitu fraksi daun Lobi-Lobi (Flacourtia inermis Roxb) dengan menggunakan metode kristalisasi dan uji kemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis multi eluen dan dua dimensi.2. Tujuan praktikumAdapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk memisahkan dan mengidentifikasi senyawa-senyawa kimia yang terdapat dalam fraksi daun Lobi-Lobi (Flacourtia inermis Roxb) dengan menggunakan metode kristalisasi dan uji kemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis multi eluen dan dua dimensi.C. Manfaat praktikumAdapun manfaat dari praktikum ini yaitu kita dapat mengetahui bagaimana cara memisahkan atau mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa-senyawa kimia yang terdapat dalam fraksi daun Lobi-Lobi (Flacourtia inermis Roxb) dengan menggunakan metode kristalisasi dan uji kemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis multi eluen dan dua dimensi.

BAB IITINJAUAN PUSTAKAA. Metode IsolasiKristalisasi digunakan untuk mendapatkan bahan dalam bentuk Kristal murni. Oleh karena itu pembentukan Kristal menyebabkan zat terlarut memisah dari lelehan atau larutan dimana yang tidak murni tetap tertinggal dalam larutan,maka kristalisasi juga merupakan proses pemisahan (Harborne,1987).Jika sebuah fraksi dipekatkan dan didinginkan serta pelarutnya dibiarkan menguap lambat, Kristal dapat membentuk senyawa yang murni Kristalisasi dapat dilakukan dengan sedikit penggosokan pada bagian dalam dinding kaca selanjutnya membiarkannya di tempat dingin, bahkan dalam lemari pendingin. Beberapa deposit mungkin merupakan kristalin dan harus di cek dengan bantuan lensa tangan untuk meyakinkan bahwa deposit tersebut bukan bahan yang amorf yang berasal dari larutan saat pendinginan terjadi (Harborne,1987).KLT 2 Dimensi merupakan salah satu metode untuk mengetahui kemurnian suatu senyawa dari hasil isolat, yang di mana bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai karakterisktik kimia yang hampir sama. Karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino, selain itu 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan, sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analilt yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda (Sastrohamidjojo, 1985).KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusisampel ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimiayang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimanadalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda (Ibnu, 2008).Sampel ditotolkan pada lempeng lalu dikembangkan dengan satu sistem fase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90, dan diletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak kedua, sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak dibagian bawah sepanjang lempeng, lalu dikromatografi lagi (Ibnu, 2008).Secara singkat pengerjaan KLT dua dimensi ialah sebagai berikut:Sampel ditotolkan pada lempeng lalu dikembangkan dengan satusistemfase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengansalah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90, dandiletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak kedua,sehinggabercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletakdibagian bawahsepanjang lempeng, lalu dikromatografi lagi (Rohman, 2009).Keberhasilan pemisahan akan tergantung pada kemampuan untukmemodifikasi selektivitas eluen kedua dibandingkan dengan selektivitasdari eluen pertama (Satari, 1999).Pemisahan 2-D yang terbaik TLC adalah ketika semua komponendipisahkan dan didistribusikan pada seluruh permukaan dari pelatkromatografi. Estimasi pemisahan ini dapat dibuat dengan sebuah fungsiobjektif. Umumnya, kesepakatan yang baik antara evaluasi visual darikromatogram dan evaluasi komputer menggunakan fungsi objektif adalahmelihat di sisi lain., fungsi yang diperlukan yang dapat memprediksi nilaiRf dari satu komponen fungsi komposisi dari fase gerak . Ada programuntuk simulasi kromatogram yang sebanding dengan yang diperolehdengan percobaan kromatogram (Satari, 1999).Keuntungannya yaitu pemisahan dua-dimensi pada KLT yang mudah dilakukan sangat berguna untuk sampel yang mengandung banyak komponen yang tidak mudah diselesaikan oleh teknik lain (Striegel, 1996).Multi eluen merupakan penggunaan eluen atau fase gerak yang berbeda yang memungkinkan pemisahan analit dengan berdasarkan tingkat polaritas yang berbeda (Sastrohamidjojo, 1985).Multi eluen adalah untuk mendapatkan resolusi yang baik dari hasil KLT. Memfokuskan zona pemisahan multi eluen, cocok digunakan untuk sampel yang memiliki noda dengan nilai Rf di bawah 0.5. Sampel disentrifuge terlebih dahulu dengan menggunakan methanol p.a, sebab untuk menjamin kemurnian senyawa.Sebab, methanol p.a merupakan pelarut yang khusus digunakan untuk analisis dan bebas dari pengotor.Berbeda dengan methanol teknis yang bisa saja mengandung pengotor seperti plasticizer dari wadah yang digunakan untuk menampung pelarut. agar seluruh area lempeng dapat digunakan sehingga senyawa yang masih menumpuk dalam satu noda, dapat ter-elusi kembali melalui sisi lempeng yang lain (Markham, 1988).Dalam multi eluen, setelah pengembang tunggal menaik,kromatogram diangkat dari chamber dan dikeringkan, biasanya selama 5-10 menit. Kromatogram tersebut kemudian dielusi lagi dalam eluen segar dari pelarut yang sama dalam arah yang sama untuk jarak yang sama.Proses ini, yang dapat diulang berkali-kali, meningkatkan resolusikomponen dengan nilai RF bawah 0,5. Beberapa pengembang dilakukandengan pelarut yang berbeda dalam arah yang sama, masing-masingyang menjalankan jarak yang sama atau berbeda, disebut elusi bertahap. Sebuah fase kurang polar dapat digunakan pertama, diikuti oleh faseyang lebih polar, atau sebaliknya. Pemindahan material nonpolar kebagian atas lapisan, meninggalkan zat terlarut polar terganggu darimana dia berasal. Setelah kering, zat terlarut polar dipisahkan olehpengembang dengan eluen (Fried,1999).

BAB IIIPROSEDUR KERJAA. Alat dan Bahan0. Alat Adapun alat yang digunakan dalam praktikum, yaitu eluen, chamber KLT, gelas ukur, gunting, hairdryer, lampu UV 254 dan UV 366 , lempeng KLT, mistar, pinset, pipa kapiler, pensil 2B, pipet, sendok besi, sentrifuge, tabung sentrifuge dan vial.0. Bahan Adapun bahan yang digunakan yaitu aquadest, aluminium foil, fraksi daun lobi-lobi (Flocourtia inermis Roxb.), etanol, etil asetat, kapas, kloroform, kertas label, kertas timbang, kertas saring, metanol dan tissue.B. Cara Kerja0. KristalisasiDisiapkan alat dan bahan, kemudian Isolat dimasukkan kedalam tabung sentrifuge, lalu tambahkan kloroform : metanol (1:1) dan disentrifuge dengan kecepatan 800 rpm selama 15 menit sehingga membentuk dua lapisan (silikanya mengendap dan senyawa kimianya berada diatas larut dalam kloroform : metanol), lalu senyawa kimianya dipindahkan dalam vial dan diuapkan sampai membentuk kristal, kemudian kristal dilarutkan dengan kloroform : metanol (1:1).

1. Dua Dimensi Disiapkan alat dan bahan, Lempeng dipotong 7x1 cm kemudian isolat dari kristalisasi yang telah dilarutkan dengan metanol ditotol pada lempeng lalu dielusi dengan eluen n-heksan : etil asetat (1:1) dan dikeringkan, kemudian Dilihat penampakan nodanya pada UV 254 nm dan UV 366 nm dan semprot dengan DPPH1. Multi Eluen Disiapkan alat dan bahan, Lempeng dipotong 5 x 5 cm kemudian isolat dari kristalisasi yang telah dilarutkan dengan metanol ditotol pada lempeng lalu dielusi dengan eluen n-heksan : etil asetat (1:1) dan dikeringkankemudian dilihat penampakan nodanya pada UV 254 nm dan UV 366 nm lalu lempeng diputar 90o setelah mencapai batas atas, lalu dielusi lagi, setelah elusi kedua mencapai batas atas, dikeluarkan dari chamber dan dikeringkandilihat penampakan nodanya pada UV 254 nm dan UV 366 nm kemudian disemprot dengan DPPH.

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASANA. Hasil PraktikumLampu UVMulti eluenDua dimensi

UV 254UV 366tidak terlihat nodatidak terlihat nodaTidak terlihat nodatidak terlihat noda

B. PembahasanKLT dua dimensi dan multieluen memiliki prinsip yang sama yaitu adsorbsi dan partisi tetapi yang membedakannyapadaKLT2dimensi didasarkan pada proses elusi yang bertujuan untuk memperpanjang jarak lintasan noda untuk memperoleh senyawa tunggal sedangkan pada multieluen jumlah totolannya yang berbeda yaitu berupa cuplikan yang berkesinambungan dan menghasilkan hasil elusi berupa pita.Kromatografi Lapis Tipis 2 arah biasa disebut juga dengan kromatografi Lapis Tipis 2 dimensi. Merupakan salah satu metode yang dapat memungkinkan pemakaian fase diam yang lebih luas untuk memisahkan campuran yang mengandung banyak komponen. Selain itu, dua sistem pelarut yang sangat berbeda dapat dipakai secara berurutanpada campuran tertentu, jadi memungkinkan pemisahan campuran yang mengandung komponen yang kepolarannya sangat berbeda.Tujuan dilakukannya praktikum ini yaitu untuk mengisolasi komponen kimia dari fraksinasi kasar dari sampel daun x dengan metode KLT multi eluen dan KLT 2 dimensi.Pada percobaan kali ini, dilakukan 2 percobaan yaitu KLT multi eluen dan 2 dimensi. Sebelum dilakukan KLT 2 dimensi dan multi eluen, sampel disentrifuge terlebih dahulu dengan menggunakan metanol sebab untuk menjamin kemurnian senyawa. Sebab, metanol merupakan pelarut yang khusus digunakan untuk analisis dan bebas dari pengotor. Berbeda dengan metanol teknis yang bisa saja mengandung pengotor seperti plasticizer dari wadah yang digunakan untuk menampung pelarut. Lempeng harus diputar 90 derajat pada KLT 2 dimensi, agar seluruh area lempeng dapat digunakan sehingga senyawa yang masih menumpuk dalam satu noda, dapat ter-elusi kembali melalui sisi lempeng yang lain sehingga didapatkan resolusi yang baik dan kapasitas noda yang tinggi.KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda.Keuntungan penggunaan metode KLT 2 dimensi dan multieluen adalah untuk mendapatkan resolusi yang baik dari hasil KLT. Memfokuskan zona pemisahan. KLT 2 dimensi memiliki potensi pemisahan 150-300 komponen senyawa kimia. Sedangkan untuk KLT multi eluen, cocok digunakan untuk sampel yang memiliki noda dengan nilai Rf di bawah 0.5.Adapun identifikasi bercak yang dilakukan pada pegujian Kromatografi lapis tipis multi eluen dan dua dimensi yaitu :a.Pada UV 254 nmPada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan tampak berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada lempeng.Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi.

b.Pada UV 366 nmPada UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda tersebut. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi.Sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak berfluororesensi pada sinar UV 366 nm.Adapun hasil yang didapatkan yaitu pada multi eluen pada UV 254 tidak terlihat noda sedangkan pada UV 366 tidak terdapat juda noda. Sedangkan pada dua dimensi pada UV 254 tidak terlihat noda dan pada UV 366 tidak terlihat noda pada lempeng.Keuntungan penggunaan metode KLT 2 dimensi dan multieluen adalah untuk mendapatkan resolusi yang baik dari hasil KLT. Memfokuskan zona pemisahan. KLT 2 dimensi memiliki potensi pemisahan 150-300 komponen senyawa kimia. Sedangkan untuk KLT multi eluen, cocok digunakan untuk sampel yang memiliki noda dengan nilai Rf di bawah 0.5.Pada percobaan, hasil yang didapat tidak sesuai, disebabkan karena adanya beberapa faktor kesalahan. Adapun faktor kesalahannya yaitu :1. Chamber yang kurang jenuh2. Kesalahan pada saat pembuatan eluen3. Kurang telitinya praktikan pada saat pengerjaan4. Kesalahan pada saat mengamati dibawah lampu UV

BAB VIPENUTUPA. KesimpulanDari hasil praktikum yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa pada percobaan pada multi eluen pada UV 254 dan UV 366 nm tidak terlihat noda. Sedangkan pada dua dimensi pada UV 254 dan UV 366 nm tidak terlihat juga noda pada lempeng. Jadi isolat yang di dapatkan tidak ada yang aktif.B. SaranSebaiknya praktikan lebih aktif ketika praktikum dan sebaiknya alat lebih diperbanyak sehingga lebih mengefesiensikan waktu.

DAFTAR PUSTAKAAnonim, 2015, Penuntun Praktikum fitokimia II, Universitas Muslim Indonesia, MakassarDalimartha, S., 2009, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid 6, Pustaka Bunda, JakartaFried, Bernard &Sherma, Joseph. (1999).Thin Layer Chromatography,4thEdition, Revised and Expanded. New York:Marcel Dekker. Inc8.Harbone, 1987, Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Penerbit ITB: Bandung.Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.Markham,K.R.1988.Cara Mengidentifikasi Flavonoida. Terjemahan Kosasih Padmawinata. ITB : Bandung.Rohman, Abdul. 2009. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: PustakaPelajar.Sastrohamidjojo, Hardjono, Dr., 1985. "Analisis Kromatografi", ITB, JogyakartaSatari, RR. 1999.Penelitian Produk Alam Laut Indonesia, Arahdan Prospek: Jakarta.Steenis, v., 2006, Flora, PT. Pradnya Paramita, JakartaStriegel, Mary F & Hill, Jo. (1996). Thin Layer Chromatogrphy for Binding Media Analysis. Los Angeles: The Getty Conservation Institute.www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TNS&search_value=506513/20-04-2015

LAMPIRANA. Skema kerja1. Pemurnian Disiapkan isolat

Masukkan dalam tabung sentrifuge

Di sentrifuge pada kecepatan 800 rpm

Selama 15 menit

saring larutan

Masukkan dalam vial

2. Kromatografi Lapis Tipis Dua DimensiDisiapkan isolate murni fraksi 1 dan 2

Setiap isolat di totolkan pada lempeng KLT

Dielusi dengan pelarut yang sesuai dan proses elusi yang kedua dilakukan dengan cara memutarlempeng 90o berlawanan arah jarum jam

Dilhat dibawah UV254 dan UV366

Disemprot dengan DPPH3. Multi EluenHasil kerukan KLTP

Dilarutkan dengan Metanol

Disiapkan perbandingan eluen

Ditotolkan pada lempeng

Dielusi dengan eluen yang telah disiapkan

Dilihat pada UV 254 nm dan UV 366 nm

Lampiran 2. Gambar Hasil Praktikum1. Dua dimensi (Klorofom : Metanol (1 : 9))

UV 254UV 366

2. Multi eluen (Klorofom : Metanol (1 : 1))

NUR FADHILAH MSRAHMAWATI RIVAI150 2012 0366