1

Identifikasi Mutasi Heteroplasmi A3243G mtDNA dengan Metode PCR Allele’s Specific Amplification (PASA) pada

Penderita Diabetes Melitus Tipe 2 Suku Bali

Oleh:

dr. I Wayan Surudarma, M.Si.

dr. Desak Made Wihandani, M.Kes.

dr. I Made Pande Dwipayana, Sp.PD.

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS UDAYANA

2015

2

JUDUL : Identifikasi Mutasi Heteroplasmi A3243G mtDNA dengan Metode PCR Allele’s Specific Amplification (PASA) pada Penderita Diabetes Melitus Tipe 2 Suku Bali

RINGKASAN : Diabetes Melitus (DM) tipe 2 merupakan suatu penyakit heterogen yang dapat disebabkan oleh faktor genetik dan faktor lingkungan. Salah satu bentuk DM tipe 2 yang berhubungan dengan faktor genetik adalah DM yang disebabkan oleh disfungsi sekresi insulin, karena adanya penghambatan dalam produksi ATP yang diperlukan dalam proses sekresi insulin oleh sel beta pankreas. Disfungsi tersebut berkaitan dengan adanya mutasi A menjadi G pada posisi nukleotida ke-3243 dari gen tRNALeu DNA mitokondria (mtDNA). Mutasi ini telah dinyatakan sebagai mutasi kausal pada diabetes turunan maternal yang disertai dengan ketulian, Maternally Inheridited Diabetes and Deafness (MIDD). Karakteristik mutasi A3243G mt DNA adalah mutasi heteroplasmi dengan jumlah DNA mutan yang jumlahnya relatif rendah. Beberapa penelitian yang telah dilakukan baik di Indonesia maupun di negara lain melaporkan adanya kesulitan mendeteksi mutasi heteroplasmi mtDNA frekuensi rendah tersebut, oleh karena itu diperlukan metode yang tepat, akurat dan relatif lebih murah. Metode yang dipilih dalam penelitian ini adalah PCR Allele’s Specific Amplification (PASA) yang dilakukan pada dua tabung dengan menggunakan 3 jenis primer, yaitu: primer universal D1 5’-AAC GTT GGG GCC TTT GCG TA-3’ (nt 3423-3404), primer normal DN 5’-GGG TTT GTT AAG ATG GCA GA-3’ (nt 3224-3243), dan primer mutan DMt 5’- GGG TTT GTT AAG ATG GCA TG-3’ (nt 3224-3243). Karakterisasi hasil PASA pada suatu sampel yang mengandung mutasi heteroplasmi A3243G mtDNA akan menghasilkan produk PCR dengan pita berukuran 200 pb pada kedua tabung. Hal ini terjadi karena mutasi yang bersifat heteroplasmi mengandung campuran mtDNA mutan dan mtDNA normal.

3

DAFTAR ISI RINGKASAN LEMBARAN IDENTITAS DAN PENGESAHAN DAFTAR ISI BAB I. PENDAHULUAN ..................................................................................... 1 1.1. Latar Belakang Masalah ....................................................................... 1

1.2. Rumusan Masalah ................................................................................ 2 1.3. Tujuan Penelitian .................................................................................. 2 1.4. Manfaat Penelitian ................................................................................ 2

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................. 3

2.1. Mitokondria .......................................................................................... 3 2.2. Genetika Mitokondria ........................................................................... 6 2.3. Patofisiologi Penyakit Mitokondria ..................................................... 8 2.4. Mutasi DNA Mitokondria Penyebab Diabetes Melitus ...................... 9

BAB III. KERANGKA KONSEP PENELITIAN ………………………………... 11

BAB IV. METODE PENELITIAN 4.1. Rancangan Penelitian ............................................................................ 12 4.2. Waktu dan Tempat Penelitian .............................................................. 12 4.3. Populasi Penelitian………………………………………………….. 12 4.4. Sampel dan Besar Sampel ………........................................................ 12 4.5. Definisi Operasional ………………………………………………… 12 4.6. Kriteria Inklusi dan Ekslusi .................................................................. 13 4.7. Bahan dan penyiapan mtDNA templat .................................................. 13 4.8. PCR Alele’s Specific Amplification (PASA) ……................................ 14

4.9. Analisis hasil PASA ……………………………….............................. 15 4.10. Alur Penelitian ....................................................................................... 16 4.11. Analisis Data ......................................................................................... 16

BAB V. PEMBIAYAAN DAN JADWAL PENELITIAN ..................................... 17 5.1. Pembiayaan ............................................................................................ 17 5.2. Jadwal Penelitian .................................................................................... 17

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................... 18 LAMPIRAN .............................................................................................................. 20

4

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Diabetes Melitus (DM) tipe 2 merupakan suatu penyakit heterogen yang dapat

disebabkan oleh faktor genetik dan faktor lingkungan. Salah satu bentuk DM tipe 2 yang

berhubungan dengan faktor genetik adalah DM yang disebabkan oleh disfungsi sekresi insulin,

karena adanya penghambatan dalam produksi ATP yang diperlukan dalam proses sekresinya

oleh sel beta kelenjar pankreas. Disfungsi tersebut berkaitan dengan adanya mutasi A menjadi

G pada posisi nukleotida ke-3243 dari gen tRNALeu DNA mitokondria (mtDNA) (So et al.,

2000; Maassen et al., 2004). Mutasi tersebut telah dinyatakan sebagai mutasi kausal pada

diabetes turunan maternal yang disertai dengan ketulian, Maternally Inheridited Diabetes and

Deafness (MIDD), (Kirino et al., 2004).

Penelitian terhadap sejumlah besar pasien MIDD di Perancis menyebutkan bahwa

fenotipe diabetes ini agak berbeda dari fenotipe-fenotipe lainnya. Terapi obat metformin untuk

pasien DM tipe 2 fenotipe MIDD dapat penyebabkan lactate acidosis dengan gejala sakit otot

dan lemas serta berkurangnya berat badan. Terapi insulin lebih tepat untuk fenotipe ini

(Guillausseau et al., 2001). Dokter harus waspada terhadap MIDD terutama jika pada rekaman

medis terdapat pasien DM yang disertai cirri-ciri seperti non obesitas, non ketoasidosis, usia

dewasa, sering muncul gangguan pendengaran, atau memiliki riwayat turunan diabetes secara

maternal (Fischel, 2001).

Penelitian mutasi A3243G telah dilakukan di beberapa negara. Di antaranya, di Taiwan

telah ditemukan mutasi A3243G pada 0,15% populasi pasien DM (Liou, 2001). Di Polandia

telah ditemukan mutasi A3243G pada pasien DM (Malecki et al., 2001). Di Jepang mutasi ini

ditemukan pada 2,9% pasien DM (Ohkubo et al., 2001). Peneliti Cina yang telah meneliti 10

pasien MELAS menemukan seluruhnya teridentifikasi memiliki mutasi A3243G (Zhaoxia et

al., 2002). Di Inggris telah diteliti 2 dari 268 pasien DM usia muda memiliki mutasi A3243G

(Owen et al., 2003). Di Korea sebanyak 22,3% pasien yang memiliki penyakit pada

mitokondria ditemukan mutasi A3243G ini (Chae et al., 2004). Di Kroasia telah ditemukan

10% pasien yang didiagnosis secara klinis mengidap DM tipe 2 memiliki mutasi A3243G

5

(Kleiner et al., 2004). Di Spanyol telah ditemukan 18% penderita pada anak-anak memiliki

tiga mutasi heteroplasmi termasuk A3243G (Uusima et al., 2004). Di Indonesia, penelitian

tentang mutasi ini telah mencapai jumlah sampel 1.500 penderita DM yang berasal dari

Jakarta, Yogyakarta, dan Surabaya namun belum ada yang dapat diidentifikasi. Penelitian

yang dilakukan institute Eijkman menemukan penderita DM memiliki varian mutasi di

mtDNA (Marzuki, 2000). Untuk di Bali penelitian tentang mutasi A3243G pada gen tRNALeu

ini sama sekali belum pernah dilakukan.

Karakteristik mutasi A3243G mt DNA adalah mutasi heteroplasmi dengan jumlah DNA

mutan yang jumlahnya relatif rendah. Beberapa penelitian yang dilakukan baik di Indonesia

maupun di negara lain telah melaporkan kesulitan mendeteksi mutasi heteroplasmi mtDNA

frekuensi rendah (5-10%), oleh karena itu diperlukan metode yang tepat, akurat dan relatif lebih

murah (Shanske et al, 2004; Zhaoxia et al., 2002; Narbonne et al., 2001).

1.2. Rumusan Masalah Dari latar belakang diatas dirumuskan masalah sebagai berikut:

- Berapakah prevalensi mutasi heteroplasmi A3243G mtDNA pada penderita

Diabetes Melitus tipe 2 suku Bali?

1.3. Tujuan Penelitian Berdasarkan uraian di atas maka tujuan penelitian ini adalah:

- Untuk mengetahui prevalensi mutasi heteroplasmi A3243G mtDNA pada

penderita Diabetes Melitus tipe 2 suku Bali.

1.4. Manfaat Penelitian Hasil penelitian diharapkan dapat memberikan bermanfaat, yaitu:

1. Memberikan informasi berupa data dasar kejadian mutasi heteroplasmi A3243G

mtDNA pada penderita Diabetes Melitus tipe 2 suku Bali.

2. Mengetahui pola pewarisan penyakit diabetes melitus tipe 2 pada suku Bali,

sehingga faktor-faktor yang memicu penyakit dapat dihidari sejak dini.

6

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 MITOKONDRIA

Mitokondria berasal dari kata Yunani mito yang berarti benang, dan chondrion yang

berarti seperti granul (butiran-butiran), sehingga dapat diartikan sebagai organela dengan

rangkaian butir-butir yang tersusun seperti benang. Mitokondria merupakan organela yang

unik karena memiliki DNA tersendiri dengan sifat-sifat yang spesifik pula (Wortmann, 2004).

A. Struktur Mitokondria

Mitokondria merupakan organel berupa kantung yang diselaputi oleh dua membran,

yaitu membran luar dan membran dalam; sehingga mitokondria memiliki dua kompartemen,

yaitu ruang antar membran (intermembrane space) dan matriks (matrix) mitokondria yang

diselimuti langsung oleh membran dalam (Beal MF, 1998). Lihat gambar 1.

Gambar 1. Struktur mitokondria Keterangan: diagram struktur tiga dimensi mitokondria

7

Membran luar

Membran luar mengandung protein transport yang disebut porin. Porin membentuk

saluran yang berukuran relatif lebih besar di lapisan ganda lipid membran luar; sehingga

membran luar dapat dianggap sebagai saringan yang memungkinkan lolosnya ion maupun

molekul kecil berukuran 5 kDa atau kurang, termasuk protein berukuran kecil.Molekul-

molekul tersebut bebas memasuki ruang antar membran, namun sebagian besar tidak melewati

membran dalam yang bersifat imper-meabel. Ini berarti bahwa dalam hal kandungan molekul

kecil, di ruang antar membran bersifat ekuivalen dengan sitosol sedangkan di ruang matriks

berbeda.8 Protein yang terletak pada membran luar meliputi berbagai enzim yang terlibat

dalam biosintesis lipid mitokondria dan enzim-enzim yang mengubah substrat lipid menjadi

bentuk lain untuk selanjutnya dimetabolisme di matriks mitokondria (Artika, 2003).

Membran dalam dan krista

Membran dalam dan matriks mitokondria terkait erat dengan aktivitas utama

mitokondria yaitu terlibat dalam siklus asam trikarboksilat, oksidasi asam lemak dan

pembentukan energi.Rantai respirasi terdapat dalam membran dalam ini (DiMauro, 2003).

Ruang antar membran

Ruang antar membran adalah ruang yang berada di antara membran luar dan membran

dalam mitokondria. Ruang ini mengandung sekitar 6% dari total protein mitokondria dan

beberapa enzim yang bekerja menggunakan ATP (adenosine triphosphate) yang tengah

melewati ruang tersebut untuk memfosforilasi nukleotida lain (Sangkot M.,2003).

Matriks

Sebagian besar (sekitar 67%) protein mitokondria dijumpai pada bagian matriks.

Enzim-enzim yang dibutuhkan untuk proses oksidasi piruvat, asam lemak dan untuk

menjalankan siklus asam trikarboksilat terdapat pada matriks ini (Artika, 2003).

B. Rantai respirasi

Rantai respirasi dan ringkasan jalur metabolik mitokondria digambarkan pada gambar

Semua kompleks ini berada di membran dalam dan mereka dapat dicapai oleh substrat baik

8

yang berada pada membran maupun pada matriks.Telah diketahui pula berbagai inhibitor

rantai respirasi dan efek kliniknya yang dapat dianggap sebagai pengetahuan awal dari

mitochondrial medicine(Sangkot M., 2003).

Gambar 2.Jalur metabolik dalam mitokondria.

C. Metabolisme mitokondria

Fungsi utama mitokondria adalah memproduksi energi kimia dalam bentuk ATP yang

akan dipergunakan untuk aktivitas seluruh sel-sel tubuh manusia. Secara garis besar, reaksi

pembentukan ATP yang berlangsung di mitokondria dapat dibagi menjadi 3 tahap (Sangkot

M., 2003):

a. Reaksi oksidasi piruvat (atau asam lemak) menjadi CO2. Reaksi ini terkait dengan

reduksi NAD+ dan FAD menjadi NADH dan FADH2. Reaksi-reaksi ini berlangsung

dalam ruang matriks mitokondria (lihat gambar 2).

b. Transfer elektron dari NADH dan FADH2 ke O2. Rentetan reaksi ini berlangsung pada

membran dalam dan terkait dengan pembentukanproton motive force atau gradien

elektrokimia lintas membran dalam mitokondria.

9

c. Pemanfaatan energi yang tersimpan dalam bentuk gradien elektrokimia untuk

memproduksi ATP. Reaksi ini dikatalisis oleh kompleks enzim F0-F1 ATP sintetase

yang berlokasi pada membran dalam.

2.2. GENETIKA MITOKONDRIA

DNA mitokondria manusia merupakan DNA sirkuler tertutup yang berada pada matriks

mitokondria yang mengandung 37 gen, dan berukuran 16569 pasang basa. Dua puluh empat

gen (24) diperlukan untuk translasi mtDNA [2 RNA ribosom (rRNAs) dan 22 RNA transfer

(tRNA)] dan 13 mengkode subunit rantai respirasi, dengan perincian sebagai berikut: 7

subunit untuk kompleks I [ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5 DAN ND6 (ND singkatan

dari NADH dehydrogenase)], 1 subunit untuk kompleks III (sitokrom b), 3 subunit untuk

sitokrom oksidasi (COX1,II,III) serta 2 subunit untuk ATP sintetase. Sebagian rantai respirasi

dikode oleh DNA nukleus.Genom DNA mitokondria manusia dapat dilihat pada gambar 3.

Gambar 3.Menunjukkan genom mitokondria manusia.Dikutip dariDiMauro S, Schon E.A. Mitochondrial Respiratory-Chain Diseases. N Eng J Med. 2003;348:2658-68. http://www.nejm.org

10

Genetika mitokondria berbeda dengan hukum Mendel dalam 3 aspek utama:

diturunkan dari ibu, heteroplasmi dan segregasi mitotic (Di Mauro, 2003).

A. Diturunkan dari ibu

Secara hukum umum, semua DNA mitokondria dalam zigot berasal dari ovum.

Sehingga seorang ibu membawa mutasi mtDNA pada semua anak-anaknya, tetapi hanya anak

perempuannya yang akan memindahkan mutasi tersebut pada keturunannya. Bukti baru

transmisi paternal mtDNA pada otot rangka (tetapi tidak pada jaringan lain) pada pasien

dengan miopati mitokondria memberikan peringatan penting bahwa sifat mtDNA yang

diturunkan dari ibu bukan merupakan hukum yang mutlak, tetapi tidak disangkal bahwa

penyakit-penyakit yang berhubungan dengan mtDNA terutama diturunkan dari pihak ibu

(Artika, 2003).

B. Heteroplasmi dan efek ambang batas (threshold effect)

Terdapat ribuan molekul mtDNA dalam tiap sel, dan secara umum terdapat beberapa

mutasi patogenik mtDNA, tetapi bukan semuanya.Sehingga sel dan jaringan tercampur

mtDNA normal dan mutan, keadaan ini disebut heteroplasmi.Heteroplasmi juga terdapat pada

tingkat organel yaitu mitokondrion dengan mtDNA normal dan mutan yang bercampur.Pada

orang normal semua mtDNA adalah identik (homoplasmi).Tidaklah mengherankan bila

dengan jumlah mtDNA minimal belum terjadi disfungsi oksidatif dan belum tampak tanda

klinis, ini yang disebut efek ambang batas.Tiap-tiap sel organ memiliki ambang batas

tersendiri, tergantung metabolisme jaringan tersebut. Efek tersebut lebih rendah pada jaringan

yang tergantung pada metabolisme oksidatif, seperti: otak, jantung, otot rangka, retina, tubulus

ginjal, dan kelenjar endokrin (Sangkot M.,2003).

C. Segregasi mitotik

Redistribusi acak organela saat pembelahan sel dapat mengubah proporsi mtDNA

mutan yang diterima oleh sel anak perumpuan, jika efek ambang patogenik dalam jaringan

yang tidak terkena terlampaui, maka fenotip dapat juga berubah. Pada gangguan mtDNA

sering berhubungannya dengan umur, jaringan yang terkena, dan variabilitas gambaran klinik

(John DR, 2001)

11

Mutasi DNA mitokondria ternyata relatif tinggi.mtDNA secara alami dihadapkan pada

faktor-faktor yang tidak menguntungkan seperti:

(a) tingginya kadar spesies oksigen reaktif sebagai produk samping metabolisme

oksidatif mitokondria,

(b) terpaparnya mtDNA terhadap oksigen reaktif tersebut karena tidak adanya proteksi

oleh nukleoprotein, yang berlainan dengan DNA inti sel dan

(c) tidak adanya sistem repair DNA yang efektif di dalam organela ini.

Karakteristik mutasi pada DNA mitokondria

a. Terjadi dengan laju tinggi

- Tidak ada mekanisme repair DNA yang efektif pada mitokondria

- DNA mitokondria tidak memiliki proteksi nukleoprotein

- Produksi spesies oksigen reaktif (ROS) yang tinggi di mitokondria

b. Faktor-faktor mitokondria adanya hot spot untuk mutasi mutasi yang sama terjadi

berkali-kali secara independen (seperti mutasi DM/ketulian/MELAS A3243G dan

LHON G11778A).

c. Faktor di inti sel menentukan fidelitas replikasi mtDNA.

d. Ekspresi mutasi mtDNA poligenik dipengaruhi oleh faktor pemodifikasi di inti sel,

lingkungan sekuens mtDNA dan faktor lingkungan.

Dikutip dariSangkot M. Mitochondrial Medicine: Perspektif ke Depan. Dalam: Suryadi H,

dkk. Ed. Mitochondrial Medicine. Lembaga Eijman. Jakarta. 2003. 1-17.

3.3.PATOFISIOLOGI PENYAKIT MITOKONDRIA

Dalam tiap-tiap sel, mitokondria dapat disamakan dengan mesin mobil. Mesin biologi

yang kecil ini mengkombinasikan makanan yang kita makan dengan oksigen untuk

memproduksi energi bagi kelangsungan hidup. Energi yang dibentuk oleh mitokondria

disimpan dalam bentuk zat kimia yang disebut adenosine triphosphate (ATP).12,14 Selain

memproduksi energi seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, mitokondria juga terlibat

dalam berbagai aktivitas yang penting seperti memproduksi hormon steroid dan membangun

blok DNA. Adanya defek pada bagian mitokondrion yang disebut rantai respirasi atau rantai

12

transport elektron akan menyebabkan miopati mitokondria yang melibatkan otot, dan bila

melibatkan otak disebut ensefalomiopati mitokondria. Proses yang terjadi tersebut

menimbulkan gangguan suplai energi, timbunan sekunder produk toksik seperti radikal bebas

dan asidosis laktat, atau kombinasi dari kedua keadaan tersebut (Hesterlee, 2004). Bila

komponen kunci rantai respirasi dalam mitokondria hilang atau terjadi kerusakan maka akan

terjadi proses yang saling berkelanjutan. Peristiwa tersebut dapat terjadi dalam dua tahap

yaitu;

a. Yang pertama terjadi adalah tidak terbentuk elektron. ATP tidak terbentuk secara

efisien dan sel kehilangan energi untuk melakukan fungsi normal.

b. Kedua, semua dari tahap-tahap sesudahnya menjadi terhenti, selanjutnya sering

menimbulkan bahan kimia abnormal yang akan memproduksi bahan toksik. Produk

tersebut adalah radikal bebas dan metabolik yang berlebihan seperti asam laktat yang

dalam jumlah besar akan membahayakan.Radikal bebas adalah molekul reaktif yang

dapat merusak DNA dan membran sel melalui jalur oksidasi. Normalnya, rantai

respirasi mitokondria membuat radikal bebas dalam jumlah yang rendah selama proses

pembuatan ATP. Bila terdapat malfungsi pada rantai respirasi, maka produksi radikal

bebas meningkat. Radikal bebas ini kemudian menyebkan kerusakan lebih lanjut

mtDNA, yang akan mengakibatkan "vicious cycle" timbulnyakerusakan dan produksi

radikal bebas. Tidak jelas berapa besar peranan pembentukan radikal bebas ini dapat

menyebabkan atau memperburuk keadaan sehingga terjadi gejala-gejala penyakit

mitokondria.

3.4. MUTASI DNA MITOKONDRIA PENYEBAB DIABETES MELITUS

Secara klinis, penyakit DM awalnya didominasi oleh resistensi insulin yang disertai

defect fungsi sekresi. Tetapi, pada tahap yang lebih lanjut, hal itu didominasi defect fungsi

sekresi yang disertai dengan resistensi insulin.

Kaitannya dengan mutasi DNA mitokondria yakni karena proses produksi hormon

insulin sangat erat kaitannya dengan mekanisme proses oxidative phosphorylation (OXPHOS)

di dalam sel beta pankreas. Proses pengeluaran insulin dalam tubuhnya mengalami gangguan

sebagai akibat dari peningkatan kadar glukosa darah. Mitokondria menghasilkan adenosin

trifosfat (ATP). ATP yang dihasilkan dari proses OXPHOS ini mengalami peningkatan.

Peningkatan kadar ATP tersebut otomatis menyebabkan peningkatan beberapa senyawa kimia

yang

proses

menye

terleta

pender

menye

diiden

tinggi

dan de

jumlah

Gamb

terkandung

s pengeluara

Berbagai m

ebutnya seba

ak pada gen

rita DM m

ertai itu an

ntifikasi seba

proporsi se

efek fungsi

hnya bila pen

ar 4. Mutasi

dalam ATP

n hormon in

mutasi yang

agai mutasi

penyandi ri

menderita pen

ntara lain tu

agai akibat d

l mutan pad

sekresi mak

nderita DM

i pada Genom

P. Peningka

nsulin.

g menyebabk

A3243G ya

ibo nucleid a

nyakit lainn

uli sensoris

dari mutasi D

da sel beta p

kin berat. P

itu menderit

m Mitokond

atan tersebut

kan DM tel

ang merupak

acid (RNA)

nya sebagai

, epilepsi,

DNA pada m

pankreas ma

Prevalensi m

ta penyakit p

dria Manusia

t antara lain

lah dapat di

kan mutasi

.Pada perke

akibat men

dan stroke

mitokondria.

aka fungsi O

mutasi terseb

penyerta tadi

a yang diketa

n yang mem

iidentifikasi.

kausal pada

mbangannya

nderita DM

like episo

Hal ini terj

OXPHOS ak

but biasanya

i.

ahui menyeb

micu tercetu

Kalangan

a DM. Muta

a, terkadang

M. Penyakit

ode.Hal itu

adi karena m

kan makin re

a akan menin

babkan peny

13

usnya

klinis

asi ini

g para

yang

telah

makin

endah

ngkat

yakit.

14

BAB III

KERANGKA KONSEP PENELITIAN

Gambar 5. Skema Kerangka Konsep Penelitian

Normal mt DNA Mutasi A3243G

mtDNA

Mutasi homoplasmi

DM Tipe 2

Mutasi heteroplasmi

15

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1.Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian analitik kualitatif dengan metode cross sectional.

4.2. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium Biokimia FK UNUD selama 10 bulan

sejak penelitian ini dinyatakan diterima. Pengambilan sampel dilakukan di Poliklinik

Penyakit Dalam RSUP Sanglah.

4.3. Populasi Penelitian

Populasi penelitian

Populasi penelitian adalah seluruh penderita Diabetes Melitus tipe 2 suku Bali.

Sampel Penelitian

Sampel dalam penelitian ini adalah penderita Diabetes Melitus tipe 2 suku Bali yang

datang ke Poliklinik Penyakit Dalam RSUP Sanglah.

4.4. Metode Pengambilan Sampel dan Besar Sampel

Pengambilan sampel dilakukan dengan cara consecutive sampling.

Besar Sampel dihitung dengan menggunakan rumus besar sampel untuk penelitian Cross

Sectional sebagai berikut:

Keterangan:

n : jumlah sampel minimal

α : derajat kepercayaan

p : proporsi sampel dengan mutasi

q : p-1

d : limit dari error atau presisi absolut

16

Jika digunakan nilai α = 0,05, maka Z α adalah 1,96. Nilai p adalah sebesar 5% (0,05)

berdasarkan data Shanske dkk, 2002. Nilai d ditentukan 5% (0,05). Dengan rumus diatas

maka jumlah sampel minimal yang diperlukan adalah 76 orang.

4.5. Definisi Operasional

Diagnosis diabetes Melitus tipe 2 pada penelitian ini ditentukan dengan kriteria sebagai

berikut:

- Kadar Gula darah puasa >= 126 mg%

- Kadar Gula darah 2 jam PP >= 200 mg%

- Kadar HB A1C > 6,5 %

4.6. Kriteria Inklusi dan Eksklusi

Kriteria Inklusi

- Subyek penderita diabetes melitus yang terdiagnosis di RSUP Sanglah

- Subyek sampel bersedia terlibat dalam penelitian dengan menandatangani

persetujuan atau inform consent tertulis.

Kriteria Ekskulusi

- Subyek sampel menolak terlibat dalam penelitian.

4.7.Bahan dan penyiapan DNA templat

DNA templat disiapkan menggunakan metode ekstraksi DNA dengan Purelink Genomic

DNA Mini Kit (Invitrogen). Pemilihan sel darah sebagai sampel dikarenakan sel ini

mempunyai jumlah organel mitokondria yang cukup banyak [Thorpe, 1984]. Alasan lainnya

adalah karena sampel darah relatif mudah untuk diambil dan telah digunakan sebagai sampel

pada penelitian yang dilakukan oleh Ohkubo et al. [2001], Lee et al. [1997], dan Malecki et al.

[2001] untuk menganalisis mutasi A3243G mtDNA yang berhubungan dengan diabetes

mellitus di Jepang, Korea, dan Polandia.

17

4.8. PCR Alele’s Specific Amplification (PASA)

Metode PASA pada penelitian ini menggunakan tiga primer, yaitu; primer universal

D1 5’-AAC GTT GGG GCC TTT GCG TA-3’ (nt 3423-3404), primer normal DN 5’-GGG

TTT GTT AAG ATG GCA GA-3’ (nt 3224-3243), dan primer mutan DM 5’- GGG TTT GTT

AAG ATG GCA TG-3’ (nt 3224-3243). PASA dilakukan dengan teknik PCR pada dua

tabung. Tabung pertama menggunakan primer universal D1 dan primer normal DN sedangkan

tabung kedua menggunakan primer universal D1 1 μL dan primer mutan DMt (masing-masing

1 μL, 20 pmol/μL). Campuran reaksi mengandung enzim Taq DNA polimerase 0,5 μL, buffer

taq 5 μL, dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) 1 μL, MgCl2 7,5 μL, ddH2O steril 24 μL, dan

templat mtDNA. Proses PCR dilakukan dalam mesin PCR Automatic Thermal Cycler

EppendorfTM sebanyak 30 siklus. Tahap awal proses PCR adalah tahap denaturasi awal yang

akan dilakukan pada suhu 94°C selama 5 menit, kemudian masuk ke program siklus PCR

dengan masing-masing siklus terdiri tiga tahap yaitu tahap denaturasi pada suhu 94°C selama

30 detik, tahap penempelan primer (annealing) pada suhu 57°C selama 30 detik, dan tahap

perpanjangan primer (extension) pada suhu 72°C selama 50 detik. Akhir dari semua siklus

dilakukan tambahan proses extension pada suhu 72°C selama 10 menit.

nt3224 nt3243 nt3423

Gambar 5. Primer yang digunakan pada PASA. D1, primer reverse universal; DN, primer

forward alela normal; DM, primer forward mismatch DNA mutan.

D1 DN

DM 200 bp

mtDNA

18

4.9. Analisis hasil PASA

Gambar 6. Analisis Hasil PASA

Metode PASA dianggap sebagai salah satu metode yang sangat sederhana yang

bekerja berdasarkan prinsip mismatch basa ujung 3’ primer yang menempel pada posisi mutasi

yaitu A3243G. Secara teoretis, apabila ujung 3’ primer tidak komplementer dengan basa G di

posisi 3243, maka tidak akan terjadi perpanjangan, begitu pula sebaliknya.

Karakterisasi fragmen yang terbentuk pada PASA dengan menggunakan 2 tabung ini,

akan menghasilkan perbedaan antara alel normal, mutasi homoplasmi, dan mutasi

heteroplasmi seperti digambarkan pada Gambar 6. Apabila sampel mengandung mutasi

heteroplasmi A G pada titik 3243, maka baik tabung 1 yang mengandung primer D1/Dn

maupun tabung 2 yang mengandung primer D1/Dmt akan menghasilkan produk PCR dengan

pita berukuran 200 pb, ini dikarenakan mutasi yang bersifat heteroplasmi memiliki campuran

templat mtDNA mutan dan templat normal. Sampel yang mengandung Alel normal hanya

menghasilkan produk PCR pada tabung 1, sedangkan pada mutasi homoplasmi hanya positif

pada tabung 2.

Tabung

1 2

(+) (+)

Heteroplasmi

Tabung

1 2

(-) (+)

Homoplasmi

Tabung

1 2

(+) (-)

Normal

Tabung 1 • Template

DNA • Reagen PCR • Primer D1 • Primer DN

Tabung 2 • Template

DNA • Reagen PCR • Primer D1 • Primer DMt

19

4.10. Alur Penelitian

4.11. Analisis Data

Prevalensi kejadian mutasi A3243G mtDNA dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Jumlah Mutasi

Prevalensi = ______________ x 100%

Jumlah Sampel

Pengambilan Sampel

Isolasi DNA

PASA

Elektroforesis hasil PASA

Visualisasi dan Dokumentasi hasil Elektroforesis

ANALISIS

20

BAB V

PEMBIAYAAN DAN JADWAL PENELITIAN

5.1. PEMBIAYAAN

JENIS KEPERLUAN Prosentase RINCIAN YANG DI USULKAN (Rp.)

Honorarium 30% 12.000.000

Peralatan dan Bahan 40% 16.000.000

Perjalanan 15% 6.000.000

Laporan 5% 2.000.000

Seminar 10% 4.000.000

Total anggaran 40.000.000

5.2. JADWAL PENELITIAN

No. Kegiatan Bulan

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 Proposal

2 Persiapan

3 Pengumpulan Sampel

4 Pengerjaan Sampel

5 Analisis Data

6 Penyusunan Laporan Penelitian

7 Seminar

8 Perbaikan, penyerahan laporan

9 Pembuatan Naskah Publikasi

21

DAFTAR PUSTAKA 1. Artika I.M, Struktur, Fungsi, dan Biogenesis. Mitokondri. Dalam: Suryadi H, dkk. Ed.

Mitochondrial Medicine. Lembaga Eijkman. Jakarta. 2003. 19-51.

2. DiMauro S, Schon E.A. Mitochondrial Respiratory-Chain Diseases. N Eng J Med. 2003 ;

348 : 2658-68. http://www.nejm.org .

3. Dorland W.A.N. Kamus Kedokteran Dorland Edisi 29. EGC. Jakarta; 2002 : 442,1363.

4. Froguel, P., Hager, J. 1995. Human diabetes and obesity: tracking down the genes.

Tibtech. 13: 52-55.

5. Hart, L.M., Lemkes, H.H., Heine, R.J., et al. 1994. Prevalence of maternally inherited

diabetes and deafness in diabetic population in the Netherlands. Diabetologia. 37: 1169-

70.

6. Hesterlee S. Mitochondrial Disease in Perspective Symptoms, Diagnosis and Hope for The

Future. http://www.mitoresearch.org/Quest_6_5.htm

7. Hesterlee S. Mitochondrial Myopathy: An Energy Crisis in The Cells.

http://www.mitoresearch.org/Quest_6_4a.htm

8. John DR, Disease Caused by Genetic Defect of Mitochondria, in : Fauci A.S, Brunwald E,

Isselbacher K.J. et all, ed. Harrison's Principle of Internal Medicine 15th. McGraw-Hill.

New York. 2001; 1: 2451-2457.

9. Kadowaki, T., Kadowaki, H., Mori, Y., Tobe, K., Sakuta, R., Suzuki, Y., Tanabe, Y.,

Sakura, H., Awata, T., Goto, Y., Hayakawa, T., Matsuoka, K., Kawamori, R., Kamada, T.,

Horai, S., Nonaka, I., Hagura, R., Akanuma, Y., Yazaki, Y. 1994. A subtype of diabetes

mellitus associated with a mutation of mitochondrial DNA. NEJM. 330: 962-968.

10. Lee, H.C., Song, Y.D., Li, H., Park, J.O., Suh, H.C., Lee, E., Lim, S., Kim, K., Huh, K.

1997. Mitochondrial gene transfer ribonuclaic acid (tRNA)Leu(UUR) 3243 and tRNALys 8344

mutations and diabetes mellitus in Korea. The Journal of Clinical Endocrinology &

Metabolism. 82 (2): 372-374.

11. M. Sangkot. Kelaian Mitokondria, Diagnosis dan Pengobatan. Dalam: Suryadi H, dkk. Ed.

Mitochondrial Medicine. Lembaga Eijman. Jakarta. 2003. 71-89.

22

12. Maksum, I.P. 2002. Tiga mutasi spesifik yang lestari daerah D-loop DNA mitokondria

manusia indonesia pada tujuh generasi segaris keturunan ibu. Tesis. Bidang Studi

Magister Kimia Program Pascasarjana ITB.

13. Malecki, M., Klupa, T., Wanic, K., Frey, J., Cyganek, K., Sieradzki, J. 2001. Search for

mitochondrial A3243G tRNALeu mutation in Polish patients with type 2 diabetes mellitus.

Med Sci Monit. 7(2): 246-250.

14. Ng, M.C., Lee, S.C., Ko, G.T.C., Li, J.K.Y., So, W.Y., Hashim, Y., Barnett, A.H.,

Mackay, I.R., Critchley, J.A.J.H., Cockram, C.S., Chan, J.C.N. 2001. Familial early-onset

type 2 diabetes in China patients. Diabetes Care. 24: 663-671.

15. Noer, A.S., Martasih, F., Mulyani, S., Muktiningsih, dan Wirahadikusumah, M.1994.

Analisis variasi urutan nukleotida D-loop mtDNA manusia dari beberapa daerah di

Indonesia, Proc. 1st joint seminar on chemistry UKM-ITB, Malaysia.

16. Ohkubo, K., Yamano, A., Nagashima, M., Mori, Y., Anzai, K., Akehi, Y., Nomiyama, R.,

Asano, T., Urae, A., Ono, J. 2001. Mitochondrial gene mutations in the tRNALeu(UUR)

region and diabetes: prevalence and clinical phenotypes in Japan. Clinical Chemistry. 47:

1641-1648.

17. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual,

vol. 1,2,3,. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.

18. Sangkot M. Mitochondrial Medicine: Perspektif ke Depan. Dalam: Suryadi H, dkk. Ed.

Mitochondrial Medicine. Lembaga Eijman. Jakarta. 2003. 1-17.

19. Thorpe, N.D. 1984. Cell biology. John Wiley & Sons Inc. New York Urata, M.,

Wakiyama, M., Iwase, M., Yoneda, M., Kinoshita, S., Hamasaki, N., Kang, D. 1998. New

sensitive method for the detection of the A3243G mutation of human mitochondrial

deoxyribonucleic acid in diabetes mellitus patients by ligation mediated polymerse chain

reaction. Clinical Chemistry. 44 : 2088-2093.

20. Wortmann RL. Metabolic diseases of muscle, in: Koopman WJ, ed. Arthritis and Allied

Conditons, 4th ed , volume two. Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2001: 2416-

2434.

21. Zhang yong, Li Jianfeng, Wang fengyan. 2001. The study of A3243G and G13513A

mitochondrial DNA pointmutation in patients with cerebral infartion, Chin Med J., 114

(10): 129-135.