hondy hartanto (6103008026)

IDENTIFIKASI POTENSI ANTIOKSIDAN MINUMAN COKELAT

DARI KAKAO LINDAK (THEOBROMA CACAO L.)

DENGAN BERBAGAI CARA PREPARASI:

METODE RADIKAL BEBAS 1,1 DIPHENYL-2-PICRYLHYDRAZIL

(DPPH)

SKRIPSI

OLEH :

HONDY HARTANTO

6103008026

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNIVERSITAS KATOLIK WIDYA MANDALA SURABAYA

SURABAYA

2012

IDENTIFIKASI POTENSI ANTIOKSIDAN MINUMAN COKELAT

DARI KAKAO LINDAK (THEOBROMA CACAO L.)

DENGAN BERBAGAI CARA PREPARASI:

METODE RADIKAL BEBAS 1,1 DIPHENYL-2-PICRYLHYDRAZIL

(DPPH)

SKRIPSI

Diajukan Kepada

Fakultas Teknologi Pertanian,

Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya

untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan

Memperoleh Gelar Sarjana Teknologi Pertanian

Program Studi Teknologi Pangan

OLEH :

HONDY HARTANTO

6103008026

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNIVERSITAS KATOLIK WIDYA MANDALA SURABAYA

SURABAYA

2012

i

Hondy Hartanto (6103008026). Identifikasi Potensi Antioksidan

Minuman Cokelat dari Kakao Lindak (Theobroma cacao L.) dengan

Berbagai Cara Preparasi: Metode Radikal Bebas 1,1 Diphenyl-2-

Picrylhydrazil (DPPH). Di bawah bimbingan: 1. Prof. Dr. Ir. Y. Marsono, MS.

2. Maria Matoetina Suprijono, SP., M.Si.

ABSTRAK

Kakao terbukti merupakan sumber antioksidan. Salah satu

produk pemanfaatan kakao adalah minuman berbasis cokelat. Beragam

cara preparasi berkembang di masyarakat dalam penyajian minuman

cokelat. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui potensi antioksidan yang

dapat dipertahankan selama proses pembuatan minuman cokelat dari

bubuk kakao dengan berbagai cara preparasi serta menentukan cara

preparasi yang paling dapat mempertahankan aktivitas antioksidan.

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Kelompok dengan

faktor Cara Preparasi Minuman Cokelat (P) terdiri dari empat perlakuan,

yang diulang sebanyak dua kali. Parameter penelitian yaitu aktivitas

antioksidan minuman cokelat dalam menangkap radikal bebas DPPH

dengan data pendukung yaitu kadar lemak pada bubuk kakao serta total

fenol dan total flavonoid pada bubuk kakao dan minuman cokelat.

Pengaruh faktor penelitian dianalisa dengan ANAVA pada = 5% dan apabila hasil uji ANAVA menunjukan adanya pengaruh nyata, maka

dilanjutkan dengan DMRT pada = 5% untuk mengetahui taraf perlakuan yang memberikan perbedaan nyata.

Perbedaan cara preparasi mempengaruhi kadar total fenol, tapi

tidak berpengaruh nyata pada kadar total flavonoid minuman cokelat.

Pembuatan minuman cokelat dengan pengadukan (P1) memiliki kadar

total fenol paling rendah (16 2 mg GAE/g), sedangkan minuman cokelat

yang diseduh dengan air mendidih (P2) memiliki kadar total fenol paling

tinggi (29 1 mg GAE/g). Perlakuan perebusan hingga mendidih (P3)

dan pemanasan dengan microwave (P4) memiliki kadar total fenol yang

tidak berbeda nyata, namun lebih tinggi dibandingkan P1, masing-masing

adalah 24 3 mg GAE/g dan 21 1 mg GAE/g.

Hasil penelitian menunjukkan aktivitas scavenging minuman

cokelat tidak nyata dipengaruhi oleh berbagai cara preparasi. Scavenging

activity minuman cokelat dengan berbagai cara preparasi tidak berbeda

nyata dibandingkan vitamin E (sebagai kontrol). Kadar total fenol dan

total flavonoid tidak berhubungan nyata dengan aktivitas scavenging

minuman cokelat.

Kata kunci: antioksidan, kakao lindak, metode DPPH

ii

Hondy Hartanto (6103008026). Identification of Antioxidant

Potential in Cacao Lindak (Theobroma cacao L.) Chocolate

Beverages by Different Preparation Methods: Free Radicals 1,1-

Diphenyl-2-Picrylhydrazil (DPPH) Method. Advisory Committee: 1. Prof. Dr. Ir. Y. Marsono, MS.

2. Maria Matoetina Suprijono, SP., M.Si.

ABSTRACT

Cacao has proven to be source of antioxidants. One of cacao

utilization-products is chocolate beverages. Various preparation methods

has been used in the process of making chocolate beverages.

Experimental research towards effect of various preparation methods on

chocolate beverages antioxidant potential has been done. This research

aimed to determine antioxidant potential that could be preserved after the

making of chocolate beverages from cocoa powder by different

preparation methods, and also choose which preparation method could

preserve the most antioxidant activity.

This research used a Randomized Block Design with Various

Preparation Method as factor (P), which consisted of four treatments and

was repeated two times. Research parameter was chocolate beverages

scavenging activity with supportive data, which are cocoa powder fat

content, and also total phenol and flavonoid content of cocoa powder and

chocolate beverages. The factors effects were analyzed with ANOVA on = 5%, then followed with DMRT on = 5% to determine which treatment shows significant effect.

All preparation methods affected total phenol content, but they

did not affect total flavonoid of chocolate beverages. Chocolate beverage

made by dissolving cocoa powder in water (P1) has the lowest total

phenol content (16 2 mg GAE/g), while on the other hand, beverage

made by dissolving cocoa powder in a boiled water has the highest total

phenol content (29 1 mg GAE/g). Beverages made by heated until

boiled (P3) and heated in microwave (P4) have common total phenol

content, but higher than P1, which are 24 3 mg GAE/g and 21 1 mg

GAE/g.

Research result showed that scavenging activity of chocolate

beverages did not affected significantly by various preparation methods.

Chocolate beverages scavenging activity did not differ significantly

towards vitamin E (control). Total phenol and flavanoid content did not

correlate significantly on chocolate beverages scavenging activity.

Keywords: antioxidant, cacao lindak, DPPH method

iii

KATA PENGANTAR

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas berkat,

rahmat serta penyertaan-Nya penulis dapat menyelesaikan Makalah

Skripsi dengan judul: Identifikasi Potensi Antioksidan Minuman

Cokelat dari Kakao Lindak (Theobroma cacao L.) dengan Berbagai

Cara Preparasi: Metode Radikal Bebas 1,1 Diphenyl-2-Picrylhydrazil

(DPPH). Penyusunan Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk

menyelesaikan program Strata 1 (S1) di Program Studi Teknologi

Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Katolik Widya

Mandala Surabaya.

Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih

kepada:

1. Prof. Dr. Ir. Y. Marsono, MS. dan Maria Matoetina S., SP., M.Si.

selaku dosen pembimbing yang telah membantu memberikan

pengarahan, bimbingan, dan semangat dalam menyelesaikan

penulisan tugas ini.

2. Dr. Paini Sri Widyawati, S.Si., M.Si. selaku dosen penguji yang telah

memberikan pengarahan dan masukan dalam bagi penulisan tugas

ini.

3. Para staf Ketua Laboratorium dan Laboran Fakultas Teknologi

Pertanian.

4. Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia PTP XII Jember yang

telah memberikan dukungan berupa penyediaan bubuk kakao

sehingga penelitian dapat dilaksanakan dengan lancar.

Penulis menyadari laporan ini masih jauh dari sempurna maka

penulis mengharapkan adanya kritik dan saran dari pembaca. Akhir kata

iv

penulis mengharapkan semoga laporan ini dapat memberikan manfaat

bagi pembaca.

Surabaya, September 2012

Penulis

v

DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK ...................................................................................... i

ABSTRACT .................................................................................. ii

KATA PENGANTAR ................................................................. iii

DAFTAR ISI ................................................................................. v

DAFTAR GAMBAR .................................................................. vii

DAFTAR TABEL ...................................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................ ix

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang .......................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ..................................................... 4 1.3 Tujuan Penelitian....................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kakao (Theobroma cacao). ........................................ 5

2.1.1 Senyawa Antioksidan Kakao. ........................... 6

2.1.2 Proses Pengolahan Biji Kakao.......................... 8

2.2 Antioksidan .............................................................. 11

2.2.1 Klasifikasi Senyawa Antioksidan ................... 12

2.2.2 Mekanisme Antioksidan ................................. 14

2.3 Metode Pengujian Aktivitas Antioksidan ................ 15

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Bahan Penelitian ....................................................... 19

3.2 Alat Penelitian .......................................................... 19

3.3 Waktu dan Tempat Penelitian................................... 20

3.4 Rancangan Penelitian ................................................ 20

3.5 Pelaksanaan Penelitian ............................................. 21

3.5.1 Pembuatan Minuman Cokelat ........................ 21

3.5.2 Metode Analisa .............................................. 25

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pengaruh Pemanasan terhadap Kadar Total Fenol Minuman Cokelat .................................................... 26

vi

4.2 Pengaruh Pemanasan terhadap Kadar Total Flavonoid Minuman Cokelat ................................... 29

4.3 Aktivitas Scavenging Metode Penghamabatan DPPH dari Minuman Cokelat .................................. 31

4.4 Hubungan Senyawa Fenolik dengan Aktivitas Antioksidan ............................................................. 33

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ...................................... 34

DAFTAR PUSTAKA .................................................................. 35

vii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Struktur Bangun (-)-Epikatekin, (+)-Epikatekin,

(-)-Katekin dan (+)-Katekin. ....................................... 9

Gambar 2.2 Diagram Alir Proses Pengolahan Biji Kakao

menjadi Beberapa Macam Produk Intermediet ......... 10

Gambar 2.3 Mekanisme Reaksi Senyawa Antioksidan ................ 14

Gambar 2.4 Struktur Molekul DPPH sebelum dan setelah

Menerima Donor Atom H ......................................... 17

Gambar 3.1 Diagram Alir Proses Pembuatan Minuman

Cokelat ...................................................................... 22

Gambar 4.1 Kadar Total Fenol Minuman Cokelat ....................... 27

Gambar 4.2 Kadar Total Flavonoid Minuman Cokelat ................ 30

Gambar 4.3 Grafik Waktu Vs % Penghambatan DPPH pada

Konsentrasi 200 ppm ................................................ 33

viii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Komposisi Kimia Bubuk Kakao Lindak Bebas Lemak ..... 6

Tabel 2.2 Jenis-Jenis Klon Kakao Lindak ......................................... 7

Tabel 2.3 Klasifikasi Jenis Antioksidan berdasarkan Struktur

Kimia.................................................................................13

Tabel 3.1 Desain Rancangan Penelitian ........................................... 20

Tabel 3.2 Formulasi Minuman Cokelat ........................................... 21

Tabel 4.1 Hubungan Senyawa Fenolik dengan Aktivitas

Antioksidan Minuman Cokelat ....................................... 34

ix

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1 Analisa Kadar Lemak Bubuk Coklat dengan

Metode Soxhlet ......................................................... 43

Lampiran 2 Analisa Kadar Total Fenol dengan Metode

Kolorimetri Folin-Ciocalteu ...................................... 45

Lampiran 3 Analisa Kadar Total Flavonoid berdasarkan

Aluminium Klorida Kolorimetri ............................... 47

Lampiran 4 Analisa Aktivitas Antioksidan dengan

Spektrofotometri Metode Peredaman Warna

DPPH ........................................................................ 50

Lampiran 5 Data Kadar Lemak Bubuk Cokelat............................ 52

Lampiran 6 Data Kadar Total Fenol dan Total Flavonoid

Minuman Cokelat ...................................................... 53

6.1. Kadar Total Fenol ..................................................... 53 6.2. Kadar Total Flavonoid (dihitung sebagai (+)-

(katekin) .................................................................. 54

6.3. Kadar Total Flavonoid (dihitung sebagai (-)-(epikatekin) ............................................................. 55

Lampiran 7 Data Aktivitas Antioksidan Minuman Cokelat

(Metode Penangkalan Radikal Bebas DPPH) ........... 56

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Beragam sumber radikal bebas dapat ditemui dalam kehidupan

sehari-hari, seperti asap kendaraan bermotor, asap pabrik, radiasi,

makanan, dan juga dari hasil proses oksidasi dalam tubuh. Radikal bebas

merupakan ion/atom/gugus atom/molekul yang memiliki satu atau lebih

elektron tak berpasangan (Bowen, 2003). Radikal bebas yang berlebih

dapat memacu timbulnya berbagai macam penyakit degeneratif, seperti

kanker dan penyakit jantung (kardiovaskular). Penyakit kardiovaskular

diketahui merupakan salah satu penyakit paling mematikan di Indonesia

(Setiabudi, 2009). Timbulnya penyakit degeneratif oleh radikal bebas

dapat dihambat ataupun dicegah oleh senyawa antioksidan.

Berdasarkan perannya, antioksidan dibedakan dalam sistem

pangan dan biologis. Antioksidan dalam sistem pangan berperan untuk

menghambat atau mencegah proses oksidasi lemak/minyak sehingga

mempunyai fungsi sebagai pengawet. Sedangkan dalam sistem biologis,

antioksidan berperan menangkal radikal bebas dalam tubuh sehingga

diharapkan dapat mencegah timbulnya berbagai macam penyakit

degeneratif. Antioksidan dalam tubuh seringkali tidak mampu mengatasi

kerusakan oksidatif yang berlebih sehingga diperlukan antioksidan dari

luar. Antioksidan dari luar dapat diperoleh dengan mengkonsumsi

makanan maupun minuman yang kaya akan antioksidan.

Salah satu sumber antioksidan yang bersifat menyehatkan adalah

produk berbasis cokelat yang diolah dari biji kakao. Kakao seperti yang

dilaporkan oleh Crozier dkk. (2011) diketahui memiliki kandungan

2

polifenol yang tinggi, terutama golongan flavanol. Kadar dan aktivitas

antioksidan yang tinggi pada kakao membuatnya berpotensi untuk

dikembangkan menjadi produk yang menyehatkan. Selain kaya akan

antioksidan, alasan kakao perlu dilirik untuk dikembangkan karena

Indonesia merupakan salah satu negara terbesar penghasil kakao sehingga

potensinya lebih menjanjikan.

Indonesia merupakan negara penghasil kakao terbesar ketiga di

dunia dengan pangsa pasar sebesar 13,6% (Rohman, 2009). Volume

ekspor produk kakao olahan masih relatif kecil dibandingkan dengan

volume ekspor biji kakao. Data BPS yang diolah Kementerian

Perindustrian menunjukkan volume ekspor kakao olahan Indonesia pada

tahun 2009 hanya mencapai 115.170 ton dengan perincian produk

intermediet (cocoa liquor, cocoa cake, cocoa butter, cocoa powder)

sebanyak 83.642 ton dan produk akhir sebanyak 31.528 ton. (Media

Industri, 2010). Data tersebut menunjukkan bahwa sebagian besar

komoditi yang diekspor masih dalam bentuk raw material. Indonesia

sebagai negara penghasil kakao memiliki peluang besar untuk

mengembangkan lebih lanjut komoditi kakao dalam negeri menjadi

produk jadi sehingga tidak hanya berhenti menjadi bahan mentah yang

diekspor ke luar negeri.

Kajian terhadap bubuk kakao yang diperoleh dari Pusat

Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia di Jember, Jawa Timur akan

dilakukan dalam penelitian ini. Bubuk kakao kemudian akan diolah

menjadi bentuk minuman. Diduga akan terjadi penurunan kadar dan

aktivitas antioksidan kakao selama proses pengolahan dikarenakan

berbagai faktor, seperti suhu dan lama pemanasan. Oleh karena itu, akan

diteliti pengaruh berbagai cara preparasi terhadap tingkat aktivitas

3

antioksidan minuman cokelat. Proses preparasi akan dilakukan dengan

empat cara sesuai dengan kebiasaan yang berkembang di masyarakat pada

umumnya, yaitu: melarutkan bubuk cokelat dengan air mendidih (100oC),

menambahkan bubuk cokelat dengan air bersuhu ruang kemudian

dipanaskan hingga mendidih (100oC), menambahkan bubuk cokelat

dengan air bersuhu ruang kemudian dipanaskan dalam microwave hingga

mendidih dan melarutkan bubuk cokelat dalam air bersuhu ruang (sebagai

kontrol).

Manfaat produk berantioksidan ditentukan oleh tingkat aktivitas

antioksidannya. Pengukuran aktivitas antioksidan perlu dilakukan untuk

mengetahui seberapa besar potensi antioksidan dari produk intermediet

sebelum dan setelah diolah menjadi minuman fungsional. Beragam

metode pengukuran telah dikembangkan untuk mengukur karakteristik

total antioksidan, tetapi tidak ada yang benar-benar ideal (Erel, 2004

dalam Hassanbaglou dkk. 2012). Metode pengukuran aktivitas

antioksidan tersebut akan mendeteksi karakteristik yang berbeda dari

antioksidan dalam sampel Hal ini menjelaskan mengapa metode

pengukuran aktivitas yang berbeda akan mengacu pada pengamatan

mekanisme kerja antioksidan yang berbeda pula (Hasannbaglou dkk.

2012). Pengukuran aktivitas antioksidan dalam menangkal radikal bebas

dapat dilakukan dengan bermacam metode seperti DPPH, ORAC, dan

ABTS (TEAC). Dalam penelitian ini digunakan pengukuran aktivitas

antioksidan dengan metode analisa DPPH.

Kelebihan dari metode pengujian DPPH adalah telah banyak

digunakan di dunia dan mudah diterapkan karena senyawa radikal yang

digunakan bersifat relatif stabil dibanding metode lainnya. Prinsip dari uji

4

ini adalah adanya donasi atom hidrogen dari substansi yang diujikan

kepada radikal DPPH yang ditunjukkan oleh perubahan warna. Menurut

Karadag dkk. (2009), penentuan aktivitas antioksidan berdasarkan

perubahan absorbansi DPPH harus diperhatikan karena absorbansi radikal

DPPH setelah bereaksi dengan antioksidan dapat berkurang oleh cahaya,

oksigen dan tipe pelarut.

1.2. Rumusan Masalah

Seberapa banyak kadar dan aktivitas antioksidan yang dapat

dipertahankan selama proses pengolahan bubuk kakao hingga menjadi

minuman cokelat dengan berbagai cara preparasi?

Bagaimana pengaruh cara preparasi terhadap tingkat aktivitas

antioksidan minuman cokelat?

1.3. Tujuan Penelitian

Mengetahui kadar dan aktivitas antioksidan yang dapat dipertahankan

selama proses pengolahan bubuk kakao hingga menjadi minuman

cokelat dengan berbagai cara preparasi.

Menentukan cara preparasi manakah yang paling dapat

mempertahankan aktivitas antioksidan minuman cokelat.

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kakao (Theobroma cacao)

Produk olahan coklat telah menjadi salah satu jenis makanan yang

digemari oleh masyarakat modern. Coklat dihasilkan dari biji tanaman

kakao yang telah mengalami serangkaian proses pengolahan. Tanaman

kakao (Theobroma cacao) penghasil biji kakao terdiri dari empat jenis

varietas utama, yaitu Criollo, Nacional, Forastero dan Trinitario

(COUNET dkk. 2004 dalam Redovnikovic dkk. 2009). Criollo jarang

dibudidayakan secara luas sebab jenis rentan ini terhadap penyakit dan

hama. Nacional merupakan jenis kakao yang dibudidayakan di Ekuador.

Forastero dibudidayakan di daerah Amazon dan jenis ini paling banyak

dibudidayakan dan digunakan untuk menghasilkan berbagai permen coklat.

Sedangkan Trinitario merupakan persilangan antara Forastero dan Criollo.

Kakao sebagai komoditas perdagangan biasanya dibedakan

menjadi dua kelompok besar (Departemen Perindustrian, 2007), yaitu:

a. Kakao mulia (fine cocoa)

Secara umum, kakao mulia diproduksi dari varietas criollo. Di

Indonesia, kakao mulia dihasilkan oleh beberapa perkebunan tua di

Jawa, seperti di Kabupaten Jember yang dikelola oleh PTPN

(Perusahaan Perkebunan Negara).

b. Kakao curah (bulk ordinary cocoa)

Kakao curah diproduksi dari varietas forastero dan dihasilkan oleh

sebagian besar produsen kakao di Indonesia. Kualitas kakao curah

biasanya rendah, meskipun produksinya lebih tinggi.

Indonesia merupakan produsen kakao terbesar ketiga di dunia

setelah negara Pantai Gading dan Ghana. Jenis tanaman kakao yang

6

diusahakan sebagian besar adalah jenis kakao curah (lindak) dengan sentra

produksi utama di daerah Sulawesi Selatan, Sulawesi Tenggara, dan

Sulawesi Tengah (Departemen Perindustrian, 2007). Sedangkan jenis kakao

mulia dibudidayakan oleh perkebunan besar negara di Jawa Timur dan

Tengah. Kakao mulia umumnya memiliki keunggulan dalam aroma dan cita

rasa, sedangkan kelebihan kakao lindak adalah memiliki produktivitas yang

tinggi dan relatif mudah dibudidayakan (ICN, 2010). Komposisi kimia

bubuk kakao lindak bebas lemak dari Pusat Penelitian Kopi dan Kakao di

Jember disajikan pada Tabel 2.1. Klon kakao lindak yang dibudidayakan di

Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia, Jember disajikan pada Tabel

2.2. Bubuk kakao lindak yang diperoleh dari Pusat Penelitian Kopi dan

Kakao Indonesia, Jember merupakan campuran dari semua jenis klon kakao

lindak yang dibudidayakan.

Tabel 2.1 Komposisi Kimia Bubuk Kakao Lindak Bebas Lemak

Komponen Komposisi (g/100g )

Lemak 2,585

Abu 7,505

Air 10,415

Protein 28,075

Karbohidrat 51,420

Sumber: Yuliatmoko (2007), Hasanah (2007), Amri (2007) dan

Kusumantias (2007) dalam Yuliatmoko (2007)

2.1.1. Senyawa Antioksidan Kakao

Kakao diketahui memiliki kadar antioksidan cukup tinggi.

Kelompok senyawa polifenol yang paling banyak terdapat pada kakao

adalah flavonoid golongan flavanol (Yuliatmoko, 2007). Jenis antioksidan

yang terkandung dalam biji kokoa antara lain adalah katekin, epikatekin,

prosianidin yang merupakan jenis polifenol.

7

Tabel 2.2. Jenis-Jenis Klon Kakao Lindak

Klon Deskripsi Keunggulan/Kelemahan

GC 7

Biji berwarna ungu

Produktivitas mencapai 2,0 ton/ha

Kadar lemak 55%

Rentan penyakit busuk buah, VSD dan hama PBK

ICS 60

Biji bewarna ungu


Kadar lemak 54%

Moderat tahan penyakit busuk buah

Rentan penyakit VSD dan hama PBK

TSH

858

Biji berwarna ungu


Kadar lemak 56%



ICS 13

Biji berwarna ungu


Kadar lemak 52%



NIC 7

Biji berwarna ungu


Kadar lemak 53%

Moderat tahan penyakit busuk buah dan VSD

Rentan hama PBK

PA 300

Biji berwarna ungu


Kadar lemak 54%

Moderat tahan penyakit busuk buah dan VSD

RCC

70

Biji berwarna ungu


Kadar lemak 57%



ICCRI

03

Biji berwarna ungu


Kadar lemak 55%

Tahan penyakit busuk buah

Moderat tahan penyakit VSD

ICCRI

04

Biji berwarna ungu


Kadar lemak 55%

Tahan penyakit busuk buah

Moderat tahan penyakit VSD

Benih

Hibrida

F1


Perbanyakan relatif mudah

Toleran terhadap serangan hama dan penyakit

Sumber: Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia (2011)

8

Menurut Misnawi dkk. (2002) dalam Yuliatmoko (2007),

kandungan polifenol pada bubuk kakao tanpa fermentasi adalah sebesar

120-180 g/kg, 37% di antaranya dalam bentuk monomer flavan-3-ol, 58%

dalam bentuk oligomer dan 5% sisanya berupa antosianin dan polifenol

lainnya. Senyawa monomer flavanol terutama (-)-epikatekin pada kakao

memiliki efek menguntungkan bagi kesehatan kardiovaskular (Hurst dkk.

2011). Donovan dkk. (2006) dalam Hurst dkk. (2011) melaporkan urutan

bioavailabilitas monomer flavan-3-ol dari yang tertinggi sampai terendah

adalah (-)-epikatekin, (+)-katekin dan (-)-katekin.

Biji kakao mengandung 12,8-43,2 mg/g (-)-epikatekin bergantung

pada varietasnya. Akan tetapi, penelitian yang dilakukan oleh Hurst et al.

(2011) menunjukkan bahwa pemanasan pada proses fermentasi,

pengeringan dan pemanggangan dapat menyebabkan berkurangnya

kandungan (-)-epikatekin, (+)-katekin serta mendorong terbentuknya

stereoisomer baru (-)-katekin (Hurst dkk. 2011). Struktur bangun (-)-

epikatekin, (+)-epikatekin, (-)-katekin dan (+)-katekin ditunjukkan pada

Gambar 2.1. Proses pemanasan yang dilakukan dalam penelitian ini

memungkinkan terjadinya perubahan struktur stereoisomer flavanol yang

dapat berakibat pada perubahan aktivitas antioksidan.

2.1.2. Proses Pengolahan Biji Kakao

Proses pengolahan biji kakao di Pusat Penelitian Kopi dan Kakao

Indonesia yang berpusat di Jember diawali dengan sortasi untuk

memisahkan biji kakao dari kotoran-kotoran yang mungkin terikut. Biji

kakao yang diolah adalah biji yang telah difermentasi selama lima hari.

Selanjutnya, dilakukan tahap penyangraian untuk membentuk aroma dan

citarasa khas coklat dari biji kakao dengan perlakuan panas. Penyangraian

9

dilakukan pada suhu 105-120oC selama 20-35 menit. Setelah disangrai, biji

kakao dihilangkan kulitnya secara mekanis hingga diperoleh daging biji

(nib).

Gambar 2.1 Struktur Bangun A (+)-Katekin, B (-)-Katekin, C (-)-Epikatekin

dan D (+)-Epikatekin

Sumber: Hurst dkk. (2011)

Nib kemudian dihancurkan hingga mencapai ukuran 20m.

Penggilingan nib menggunakan panas menyebabkan lemak kakao meleleh

dan membentuk pasta yang selanjutnya disebut dengan kakao liquor. Pasta

ini dapat langsung dimurnikan dan dijual sebagai coklat tanpa pemanis

(unsweetened baking chocolate). Pasta kakao kemudian dikempa untuk

mengeluarkan lemak kakao. Sisa hasil tempaan adalah bungkil padat

dengan kandungan lemak berkisar antara 10-22% bergantung pada

permintaan konsumen.

A

B

C

D

10

Bungkil merupakan bahan baku utama dalam pembuatan bubuk

coklat setelah melalui proses penghalusan pada suhu antara 34-40oC dan

pengayakan dengan mesin pengayak 120 mesh. Gambar 2.2 adalah diagram

alir proses pengolahan biji kakao menjadi beberapa macam produk antara

(intermediet) di Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia.

Gambar 2.2 Diagram Alir Proses Pengolahan Biji Kakao menjadi Beberapa

Macam Produk Intermediet

Sumber : Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia (2008)

Bubuk coklat

Biji Kakao

Sortasi

Penyangraian

Pemisahan kulit

Daging biji (nib)

Pemastaan

Pasta coklat

Pengempaan

Bungkil coklat Lemak kakao

Pengayakan

Penghalusan bungkil

11

2.2. Antioksidan

Antioksidan adalah substansi yang mampu menetralkan radikal

bebas dengan cara mengorbankan dirinya agar teroksidasi. Radikal bebas

merupakan atom atau gugus atom yang memiliki satu atau lebih elektron tak

berpasangan (Bowen, 2003). Hal ini menyebabkan radikal bebas bersifat

sangat reaktif dan dapat bereaksi dengan protein, lipida, karbohidrat dan

DNA (Vijithahh dan Nizar, 2009). Radikal bebas akan mengambil elektron

dari molekul stabil terdekat sehingga mengakibatkan munculnya reaksi

berantai pembentukan radikal bebas (Shenoy dan Shirwaikar, 2002 dalam

Vijithahh dan Nizar, 2009). Radikal bebas dapat bersumber dari polutan,

makanan dan minuman, radiasi, pestisida serta hasil proses oksidasi dalam

tubuh. Kelebihan radikal bebas dalam tubuh dapat memicu timbulnya

berbagai macam gangguan kesehatan degeneratif, seperti kanker dan

penyakit jantung (kardiovaskular).

Antioksidan mempunyai peran yang berbeda dalam sistem pangan

dan biologis. Antioksidan berperan untuk menghambat proses oksidasi

lemak/minyak sehingga mempunyai fungsi sebagai pengawet. Sedangkan

dalam sistem biologis, antioksidan berperan menangkal radikal bebas dalam

tubuh sehingga dapat melawan kerusakan oksidatif.

Ada dua cara dalam mendapatkan antioksidan, yaitu dari luar tubuh

(eksogen) dan dalam tubuh (endogen). Antioksidan eksogen didapat dengan

mengkonsumsi makanan dan minuman yang mengandung vitamin C dan E,

-karoten maupun antioksidan sintetik seperti BHA, BHT dan TBHQ.

Sedangkan contoh antioksidan endogen adalah enzim superoksida

dismutase (SOD), glutation peroksidase (GSH.Px) dan katalase.

Antioksidan endogen seringkali tidak mampu mengatasi stres oksidatif yang

12

berlebih sehingga diperlukan antioksidan eksogen untuk mengatasinya

(Halliwel dkk. 1995). Stress oksidatif merupakan keadaan saat mekanisme

antioksidan tidak cukup untuk mencegah spesi oksigen reaktif.

2.2.1. Klasifikasi Senyawa Antioksidan

Senyawa antioksidan digolongkan menjadi berbagai macam

kategori berdasarkan jenisnya. Bentuk klasifikasi dari jenis-jenis

antioksidan disajikan pada Tabel 2.3.

Berdasarkan sumbernya, antioksidan dibedakan dalam dua

kelompok, yaitu:

1) Antioksidan alami

Antioksidan alami merupakan antioksidan yang diperoleh dari

hasil ekstraksi bahan alami atau terbentuk dari reaksi-reaksi kimia selama

proses pengolahan (Trilaksani, 2003 dalam Santoso, 2005). Antioksidan

alami dapat diperoleh dari beragam sumber bahan pangan, seperti sayur-

sayuran, buah-buahan, rempah-rempah, dan lain-lain. Contoh dari

antioksidan alami adalah vitamin C, vitamin E, dan -karoten.

Menurut Sahidi dan Naczk (1950) dalam Santoso (2005), senyawa

antioksidan alami dalam tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik dan

polifenolik, seperti golongan flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin,

tokoferol, dan asam-asam organik polifungsional. Golongan flavonoid yang

memiliki fungsi sebagai antioksidan meliputi flavon, flavanol, isoflavon,

katekin dan kalkon, sedangkan turunan asam sinamat meliputi asam kafeat,

asam ferulat, asam klorogenat, dan lain-lain (Santoso, 2005).

13

2) Antioksidan sintetik

Menurut Trilaksani (2003) dalam Santoso (2005), antioksidan

sintetik merupakan antioksidan yang diperoleh sebagai hasil dari sintesa

reaksi kimia. Contoh dari antioksidan sintetik adalah BHA, BHT dan TBHQ.

Tabel 2.3 Klasifikasi Jenis Antioksidan Berdasarkan Struktur Kimia

Enzimatis

(endogen)

Antioksidan Peranan Ciri-ciri

Superoksida

dismutase

(SOD)

Mitochondrial

Cytoplasmic

Extracellular

Mengubah O2-

menjadi H2O2

Mengandung

mangan (MnSOD)

Mengandung

tembaga dan seng

(CuZnSOD)

Mengandung

tembaga (CuSOD)

Katalase Mengubah H2O2

menjadi H20

Hemoprotein

berbentuk

tetramerik

Glutathione

peroksidase

(GSH.Px)

Menghilangkan

H2O2 dan lipid

peroksida

Selenoprotein

(mengandung Se2+

)

Terutama berada di

sitosol dan

mitokondria

Menggunakan

GSH

Non-

enzimatis

(eksogen)

-tokoferol

Memutus

peroksidase lipida

Scavenger pada lipid

peroksidase, O2-

dan OH

Vitamin yang larut

dalam lemak

-karoten Mengikat logam-

logam transisi

Vitamin yang larut

dalam lemak

Asam askorbat

Scavenger langsung

terhadap O2-,

OH

dan H2O2

Berkontribusi

terhadap regenerasi

vitamin E

Vitamin yang larut

dalam air

Sumber: Winarsi (2007)

14

2.2.2. Mekanisme Antioksidan

Menurut Eskin dan Przybylski (2001) dalam Sari (2005),

mekanisme kerja senyawa antioksidan adalah mengkelat ion logam,

menghilangkan oksigen radikal, memecah reaksi rantai inisiasi, menyerap

energi oksigen singlet, mencegah pembentukan radikal, menghilangkan dan

atau mengurangi jumlah oksigen yang ada. Mekanisme reaksi senyawa

antioksidan pada Gambar 2.3.

AH + ROO. A. + ROOH

AH + RO. A. + ROH

A. + ROO

. AOOH

A. + RO

. AOH

A. + A

. AA

A. +O2 AOO

.

A. +RH AH +R.

Keterangan :

AH = antioksidan ROO. = radikal peroksil

RH = lemak atau minyak tak jenuh R. = radikal asam lemak tak jenuh

Gambar 2.3 Mekanisme Reaksi Senyawa Antioksidan

Sumber: Gordon (1990) dalam Sari (2005)

Berdasarkan fungsinya, antioksidan dibedakan menjadi tiga, yaitu:

a. Antioksidan primer

Antioksidan primer berperan dalam menghentikan reaksi rantai

radikal bebas dengan berfungsi sebagai pendonor atom H atau elektron pada

radikal bebas dan berdampak pada pembentukan produk yang lebih stabil.

Antioksidan primer (AH) dapat memutuskan tahap inisiasi dengan bereaksi

dengan sebuah radikal bebas atau menghambat reaksi propagasi dengan

cara bereaksi dengan radikal peroksil atau alkoksida (Madhavi dan

Salmakhe, 1995 dalam Sari, 2005). Contoh antioksidan yang memiliki

mekanisme ini adalah tokoferol, flavonoid dan asam askorbat (Sies dalam

15

Halim, 2011). Sedangkan BHA, BHT dan TBHQ merupakan contoh

antioksidan primer yang dibuat secara sintetik.

b. Antioksidan sekunder

Antioksidan sekunder berperan dalam mengikat atau mengkelat ion

logam, sebagai penangkal oksigen, mengubah hidroperoksida menjadi

molekul non-radikal, menyerap radiasi UV, dan menginaktifkan oksigen

singlet (Pokorny dkk. 2001 dalam Sari, 2005)

c. Antioksidan tersier

Menurut Pribadi (2009), antioksidan tersier adalah antioksidan

yang berfungsi memperbaiki kerusakan sel dan jaringan yang disebabkan

oleh radikal bebas. Contoh dari antioksidan tersier adalah enzim DNA-

repair dan metionin sulfoksida reduktase yang berperan dalam perbaikan

biomolekul yang disebabkan oleh radikal bebas (Winarsi, 2005 dalam

Pribadi, 2009).

2.3. Metode Pengujian Aktivitas Antioksidan

Pengukuran aktivitas antioksidan dalam menangkal radikal bebas

dapat dilakukan dengan bermacam metode, seperti DPPH, ORAC, dan

ABTS (TEAC).

a) ORAC (oxygen radical absorbance capacity)

Metode ORAC menggunakan senyawa radikal peroksil yang

dihasilkan melalui larutan cair dari 2,2-azobis-2-metil-propanimidamida.

Antioksidan akan bereaksi dengan radikal peroksil dan menghambat

degradasi pendaran zat warna (Teow dkk. 2007). Kelebihan metode

pengujian ORAC adalah kemampuannya dalam menguji antioksidan

hipofilik dan lipofilik sehingga akan menghasilkan pengukuran lebih baik

terhadap total aktivitas antioksidan (Prior dkk. 2003 dalam Teow dkk. 2007).

16

Kelemahan dari metode ini adalah membutuhkan peralatan yang mahal

(Awika dkk. 2003 dalam Thaipong dkk. 2005) dan metode ORAC hanya

sensitif terhadap penghambatan radikal peroksil (Cronin, 2004).

b) ABTS (TEAC)

Metode ini menggunakan prinsip inhibisi, yaitu sampel

ditambahkan pada sistem penghasil radikal bebas dan pengaruh inhibisi

terhadap efek radikal bebas diukur untuk menentukan total kapasitas

antioksidan dari sampel (Wang dkk. 2004). Metode TEAC menggunakan

senyawa 2,2-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) sebagai

sumber penghasil radikal bebas. Kelebihan metode ini dibandingkan metode

DPPH adalah dapat digunakan di sistem larutan berbasis air maupun

organik, mempunyai absorbansi spesifik pada panjang gelombang dari

region visible, dan membutuhkan waktu reaksi yang lebih sedikit (Lee dkk.

2003). Selain itu, kelebihan metode ABTS dibandingkan dengan metode

DPPH adalah tidak adanya intervensi warna saat mengukur sampel

berantosianin (Arnao, 2000 dalam Teow dkk. 2007). Menurut MacDonald-

Wicks dkk. (2006) dalam Karadag dkk. (2009), kelemahan dari metode ini

adalah radikal ABTS yang digunakan pada metode TEAC tidak ditemukan

dan tidak serupa dalam sistem biologis.

c) DPPH

Uji peredaman warna radikal bebas DPPH merupakan uji untuk

menentukan aktivitas antioksidan dalam sampel yang akan diujikan dengan

melihat kemampuannya dalam menangkal radikal bebas DPPH. Sumber

radikal bebas dari metode ini adalah senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil.

Prinsip dari uji ini adalah adanya donasi atom hidrogen dari substansi yang

diujikan kepada radikal DPPH menjadi senyawa non radikal

17

difenilpikrilhidrazin yang akan ditunjukkan oleh perubahan warna

(Molyneux, 2004). Gambar 2.4 menunjukkan struktur molekul DPPH

sebelum dan setelah menerima donor atom H.

Gambar 2.4 Struktur Molekul DPPH Sebelum dan Setelah Menerima Donor

Atom H

Sumber: Molyneux (2004)

Perubahan warna yang akan terjadi adalah perubahan dari larutan

yang berwarna ungu menjadi berwarna kuning (Pauly, 2001 dalam Rahayu

dkk. 2009). Intensitas perubahan warna ini kemudian diukur pada spektrum

absorpsi antara 515-520 nm pada larutan organik (metanol atau etanol)

(Molyneux, 2004). Pemilihan penggunaan metanol yang bersifat lebih polar

dibandingkan etanol sebagai pelarut diharapkan lebih dapat

mempertahankan kestabilan DPPH.

Kelebihan dari metode DPPH adalah secara teknis simpel, dapat

dikerjakan dengan cepat dan hanya membutuhkan spektrofotometer UV-Vis

(Karadag dkk. 2009). Sedangkan kelemahan dari metode ini adalah radikal

DPPH hanya dapat dilarutkan dalam media organik (terutama media

alkoholik), tidak pada media aqueous sehingga membatasi kemampuannya

dalam penentuan peran antioksidan hidrofilik. Penentuan aktivitas

antioksidan berdasarkan perubahan absorbansi DPPH harus diperhatikan

karena absorbansi radikal DPPH setelah bereaksi dengan antioksidan dapat

berkurang oleh cahaya, oksigen dan tipe pelarut. Telah diketahui bahwa

18

terjadi pengurangan kapasitas antioksidan ketika kadar air pelarut melebihi

batas tertentu dikarenakan terkoagulasinya DPPH (Magalhaes dkk. 2008).

19

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai

berikut:

1. Bahan utama untuk pembuatan minuman cokelat adalah Air Minum

dalam Kemasan (AMDK) dan bubuk kakao rendah lemak tanpa proses

alkalisasi yang didapatkan dari Pusat Penelitian Kopi dan Kakao

Indonesia, Jember, Jawa Timur. Bahan pendukung yang digunakan

adalah gula pasir Gulaku dan garam Dolphin.

2. Bahan yang digunakan untuk analisa adalah akuades, akuabides, n-

heksana (Merck 104367), asam galat (Merck 842649), reagen Folin-

Ciocalteu (Merck UN 3264), Na2CO3 anhidrat (Merck 106393), NaNO2

(Merck 106549), AlCl3 (Merck 801081), NaOH (Mallincrodkt T108),

radikal DPPH (Sigma Aldrich D 9132), metanol p.a (Merck 106009),

etanol p.a (Merck 100983), kertas saring kasar, kertas saring Whatman

40, aluminium foil, standar berupa asam galat (Merck 159630), (+)-

katekin (Sigma Aldrich C 1251), (-)-epikatekin (Sigma Aldrich E

4018), dan -tokoferol (Sigma Aldrich T 3251).

3.2. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam pembuatan minuman cokelat adalah

panci, pengaduk kaca, kompor, bunsen, kaki tiga, korek api, gelas ukur,

kertas aluminium foil, gelas piala, toples, microwave National dan

termometer. Sedangkan alat yang digunakan untuk melakukan analisa

adalah sentrifus Hettich, spektrofotometer UV-Vis Shimadzu, neraca

analitis Top Loading METTLER TOLEDO, neraca analitis Sartorius,

20

kuvet, Soxhlet apparatus, labu takar, botol semprot, beaker glass, corong,

oven, water bath Buchi, eksikator, vacutiner, pengaduk kaca, dan mikro

pipet.

3.3. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Fakultas Teknologi Pertanian

Unika Widya Mandala Surabaya, yaitu: Laboratorium Kimia-Biokimia

Pangan dan Gizi, Laboratorium Analisa Pangan dan Laboratorium

Penelitian. Penelitian utama dilaksanakan pada bulan Mei-September 2012.

3.4. Rancangan Penelitian

Penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental dengan

faktor tunggal, yaitu Cara Preparasi Minuman Cokelat (P) yang dibagi

menjadi empat perlakuan, yaitu (P1) melarutkan bubuk cokelat dalam air

bersuhu ruang, (P2) melarutkan bubuk cokelat dengan air mendidih

(100oC), (P3) menambahkan bubuk cokelat dengan air bersuhu ruang

kemudian dipanaskan hingga mendidih (100oC), (P4) menambahkan bubuk

cokelat dengan air bersuhu ruang kemudian dipanaskan dalam microwave

dengan mode HIGH (1000 W) selama 1 menit atau hingga timbul

gelembung. Masing-masing perlakuan dilakukan ulangan sebanyak empat

kali. Percobaan kemudian diacak dengan Rancangan Acak Kelompok

(RAK) faktor tunggal, yaitu cara preparasi minuman cokelat. Desain

rancangan penelitian cara preparasi minuman cokelat pada Tabel 3.1.

Tabel 3.1. Desain Rancangan Penelitian

Ulangan Cara Preparasi Minuman Cokelat

P1 P2 P3 P4

1 P1 1 P2 1 P3 1 P4 1

2 P1 2 P2 2 P3 2 P4 2

Keterangan:

P1 1 adalah cara preparasi dengan melarutkan bubuk cokelat dalam air

bersuhu ruang dan merupakan ulangan ke-1 dari empat ulangan.

21

Pengaruh faktor dianalisa menggunakan analisa varians (ANAVA)

pada = 5%. Apabila hasil uji ANAVA menunjukan adanya pengaruh

nyata, maka dilanjutkan dengan Uji Beda Nyata Duncan pada = 5% untuk

mengetahui taraf perlakuan yang memberikan perbedaan nyata.

Parameter penelitian yaitu aktivitas antioksidan minuman cokelat

dalam menangkap radikal bebas DPPH. Penelitian ini menggunakan data

pendukung yaitu kadar lemak/minyak pada bubuk kakao, serta kadar

antioksidan (Total Fenol dan Total Flavonoid) pada bubuk kakao dan

minuman cokelat.

3.5. Pelaksanaan Penelitian

3.5.1 Pembuatan Minuman Cokelat

Bahan-bahan yang digunakan dalam proses pembuatan minuman

cokelat adalah gula pasir, bubuk cokelat dan air. Formulasi minuman

cokelat pada Tabel 3.2. Sedangkan diagram alir proses pembuatan minuman

cokelat pada Gambar 3.1.

Tabel 3.2 Formulasi Minuman Cokelat

Bahan Persentase (%) Perlakuan (g)

P1 P2 P3 P4

Bubuk Kakao 4,32 12 12 12 12

Gula Pasir 8,99 25 25 25 25

Garam 0,36 1 1 1 1

Air 86,33 240 240 240 240

Total 100 278 278 278 278

Sumber: Crozier dkk. (2011)

22

Gambar 3.1 Diagram Alir Proses Pembuatan Minuman Cokelat

Sumber: a)

Lee dkk. (2003); b)

Hersheys (2010)

Tahapan proses pembuatan minuman cokelat terdiri atas beberapa

tahap sebagai berikut:

a) Preparasi Bubuk Kakao

Preparasi bubuk kakao meliputi penimbangan dan pengemasan

ulang bubuk kakao ke dalam kemasan yang lebih kecil untuk menjaga

keseragaman sampel saat dilakukan analisa. Bubuk kakao yang diperoleh

dari Pusat Penelitian Kopi dan Kakao adalah sebesar 2,5 kg. Bubuk kakao

kemudian dipindahkan ke dalam toples dan dihomogenisasi dengan cara

diaduk dengan sendok kayu selama 2 menit. Bubuk kakao sebanyak 2 kg

P1

Minuman cokelat

P2 a) P3

b) P4

b)

Preparasi Bubuk Kakao

Preparasi Minuman Cokelat

Analisa:

- Total Fenol - Total Flavanoid

- Uji DPPH

Bubuk Kakao Rendah Lemak

Penimbangan Bahan

Bubuk Kakao dalam

kemasan sebesar 50 g

Analisa:

- Total Fenol - Total Flavanoid - Kadar Lemak

- Uji DPPH

Gula Pasir

Garam

Air

23

yang telah homogen dilakukan pengemasan ulang dengan cara menimbang

bubuk kakao sebesar 50 g langsung ke dalam plastik PE dan kemudian

dikemas rapat dan dilapisi dengan aluminium foil. Bubuk kakao yang telah

dikemas berjumlah 40 bungkus dengan berat tiap kemasan sebesar 50 g.

Kemasan yang digunakan ialah plastik PE yang kemudian dilapisi dengan

aluminium foil. Bubuk kakao yang telah dikemas ulang disimpan dalam

toples kedap udara yang dilapisi aluminium foil dan diberi silica gel di

dalamnya.

b) Penimbangan Bahan

Bahan bahan yang digunakan dalam pembuatan minuman cokelat

antara lain bubuk kakao yang telah dikemas tiap 50 g, gula pasir, air mineral

dan garam. Penimbangan bahan-bahan untuk membuat minuman cokelat

tersebut ditimbang sesuai dengan formulasi yang ada. Penimbangan bubuk

kakao yang digunakan untuk analisa total fenol tiap ulangan adalah sebesar

2 gram, analisa total flavonoid 2 gram, dan analisa kadar lemak sebesar 2

gram.

Gula pasir ditimbang sebesar 25 gram tiap perlakuan. Penimbangan

gula dilakukan langsung ke dalam gelas piala 500 mL yang akan digunakan

membuat minuman cokelat. Penimbangan bubuk kakao dilakukan dengan

cara menimbang 12 gram bubuk kakao dari kemasan 50 gram untuk setiap

perlakuan dengan kertas timbang yang telah diketahui beratnya. Bubuk

kakao kemudian dituang ke dalam gelas piala 500 mL yang berisi gula

pasir. Kertas timbang yang digunakan untuk menimbang bubuk kakao

ditimbang kembali untuk mengetahui berat bubuk kakao yang tertinggal

pada kertas timbang.

Penimbangan garam dilakukan dengan cara menimbang 1 gram garam

untuk tiap perlakuan menggunakan kertas timbang dan kemudian dituang

24

pada gelas piala berisi gula pasir dan bubuk kakao. Kertas timbang yang

digunakan untuk menimbang garam ditimbang kembali untuk mengetahui

berat garam yang tertinggal pada kertas timbang. Air sebesar 240 mL diukur

menggunakan gelas ukur 500 mL.

c) Preparasi Minuman Cokelat

Preparasi minuman cokelat meliputi pencampuran bahan yang telah

ditimbang sesuai dengan perlakuan yang ada. Cara preparasi minuman

cokelat sesuai dengan tiap perlakuan antara lain:

Perlakuan 1 (P1) : Air bersuhu ruang (28,5C) yang telah diukur sebesar

240 mL menggunakan gelas ukur 500 mL dicampurkan ke dalam gelas

piala ukuran 600 mL yang berisi bubuk kakao, garam dan gula, kemudian

dilakukan pengadukan menggunakan pengaduk kaca hingga homogen.

Perlakuan 2 (P2) : Air 500 mL dimasukkan ke dalam gelas piala dan

kemudian dididihkan langsung menggunakan bunsen hingga mendidih. Air

yang telah mendidih kemudian diukur sebesar 240 mL menggunakan gelas

ukur 600 mL dan dicampurkan dalam gelas piala 500 mL berisi bubuk

kakao, garam dan gula, kemudian dilakukan pengadukan menggunakan

pengaduk kaca hingga homogen.

Perlakuan 3 (P3) : Air bersuhu ruang diukur sebesar 240 mL

menggunakan gelas ukur 500 mL dan dicampurkan ke dalam gelas piala

600 mL yang telah berisi bubuk kakao, garam dan gula, kemudian diaduk

menggunakan pengaduk kaca hingga homogen. Campuran tersebut

kemudian dididihkan langsung di atas pemanas bunsen yang telah diberi

alas kasa hingga mendidih.

Perlakuan 4 (P4) : Air bersuhu ruang dicampurkan dalam gelas piala 600

mL yang telah berisi bubuk kakao, garam dan gula, kemudian diaduk

menggunakan pengaduk kaca hingga homogen. Campuran tersebut

25

kemudian dimasukkan ke dalam microwave kemudian dilakukan

pemanasan dengan pengaturan mode HIGH (1000 W) selama 1 menit

hingga muncul gelembung pada minuman cokelat.

3.5.2 Metode Analisa

a) Preparasi Sampel

Sampel minuman cokelat yang telah dibuat didinginkan dan

disentrifugasi pada 10.000 rpm pada suhu 5oC selama 15 menit.

Supernatan yang dihasilkan digunakan sebagai sampel.

b) Analisa Kadar Lemak Bubuk Cokelat dengan Metode Soxhlet

ditunjukkan pada Lampiran 1.

c) Analisa Kadar Antioksidan

a. Analisa Kadar Total Fenol dengan metode kolorimetri Folin-

Ciocalteau Fenol (Lee dkk. 2003) ditunjukkan pada Lampiran 2.

b. Analisa Kadar Total Flavonoid berdasarkan aluminium klorida

kolorimetri (Zhishen dkk. 1999 dalam Lee dkk. 2003) terdapat pada

Lampiran 3.

d) Analisa Aktivitas Antioksidan dengan Metode Penangkapan Radikal

Bebas DPPH (Holliday, 2006 dalam Mediyaningsih, 2009) terdapat

pada Lampiran 4.

26

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Antioksidan dibutuhkan oleh tubuh untuk menangkal radikal bebas

sehingga diharapkan dapat mencegah timbulnya berbagai macam penyakit

degeneratif. Antioksidan dalam tubuh seringkali tidak mampu mengatasi

kerusakan oksidatif yang berlebih sehingga diperlukan antioksidan dari luar.

Antioksidan dari luar dapat diperoleh dengan mengkonsumsi makanan

maupun minuman yang kaya akan antioksidan.

Salah satu sumber antioksidan yang bersifat menyehatkan adalah

produk berbasis cokelat yang diolah dari biji kakao. Kakao, seperti yang

dilaporkan oleh Crozier dkk. (2011), diketahui memiliki kandungan

polifenol yang tinggi, terutama golongan flavanol. Salah satu produk

berbasis cokelat yang cukup digemari oleh masyarakat adalah minuman

cokelat.

Dalam penyajiannya, minuman cokelat diproses dengan berbagai

cara preparasi yang berbeda. Oleh karena itu, berikut ini dibahas pengaruh

berbagai proses preparasi terhadap kadar dan aktivitas antioksidan minuman

cokelat. Analisa kadar antioksidan meliputi analisa kadar total fenol dan

total flavonoid. Aktivitas antioksidan pada minuman cokelat dianalisa

menggunakan sistem pengujian metode radikal bebas DPPH berdasarkan

metode yang diterapkan oleh Holliday (2006) dalam Mediyaningsih (2009).

4.1 Pengaruh Pemanasan terhadap Kadar Total Fenol Minuman Cokelat

Kadar total fenol minuman cokelat setelah mengalami berbagai

proses preparasi dapat dilihat pada Gambar 4.1. Berdasarkan Gambar 4.1,

kadar total fenol minuman cokelat dari empat perlakuan berkisar antara

402-716 mg GAE/gram bubuk cokelat.

27

16

29

24 21

0

5

10

15

20

25

30

35

P1 P2 P3 P4

Kon

sen

tras

i (m

g G

AE

/g)

Perlakuan

Gambar 4.1 Kadar Total Fenol Minuman Cokelat

Penentuan kadar total fenol minuman cokelat dilakukan dengan

metode Folin-Ciocalteu. Penggunaan asam galat yang merupakan

komponen fenol sebagai standar akan memprediksi kadar komponen fenol

dalam minuman cokelat. Berdasarkan hasil uji ANAVA ( = 0,05)

diketahui bahwa berbagai cara preparasi yang dilakukan nyata

mempengaruhi kadar total fenol dalam minuman cokelat. Minuman cokelat

tanpa proses pemanasan (P1) memiliki kadar total fenol paling rendah.

Sedangkan minuman cokelat yang diseduh dengan air mendidih (P2)

memiliki kadar total fenol paling tinggi. Kadar total fenol minuman cokelat

P2 meningkat 78%, P3 meningkat 50% dan P4 meningkat 32%

dibandingkan P1. Hasil serupa pernah dilaporkan oleh Dewi dan Dominika

(2008) yang menemukan bahwa pemanasan pada serbuk sarang semut yang

diseduh pada suhu 100oC, menghasilkan kadar total fenol yang lebih besar

dibandingkan dengan suhu 60 dan 80oC.

Menurut Yuliatmoko dkk. (2007), bubuk kakao lindak bebas lemak

mengandung protein dalam kadar yang cukup besar, yaitu 28,075%. Haslam

dkk. (1999) dalam Ali (2002) mengemukakan bahwa interaksi antara

protein dengan komponen fenolik dapat terjadi akibat ikatan hidrogen

28

antara gugus hidroksil fenolik dengan gugus NH- dan CO- pada protein.

Bartolome dkk. (2000) dalam Ali (2002) menyatakan bahwa interaksi

hidrofobik antara bagian non polar dari molekul fenolik dengan bagian non

polar dari protein mampu menghasilkan interaksi lemah antara komponen

fenolik dengan protein. Peningkatan kadar total fenol minuman cokelat

setelah mengalami perlakuan panas pada P2, P3 dan P4 diduga akibat

terjadinya denaturasi protein sehingga komponen fenolik yang semula

terikat dengan protein menjadi lepas. Selain itu, peningkatan kadar total

fenol diduga juga terjadi akibat degradasi senyawa fenol kompleks menjadi

fenol sederhana (Pujimulyani dkk. 2010). Larrauri dkk. (1997) dalam

Akowuah dkk. (2009) melaporkan adanya dekomposisi signifikan terhadap

antioksidan fenolik pada suhu di atas 60oC.

Perlakuan perebusan hingga mendidih (P3) menghasilkan

minuman cokelat dengan kadar total fenol yang lebih rendah dibandingkan

dengan minuman cokelat yang diseduh (P2). Hal ini diduga akibat fenol

yang telah terekstrak mengalami kerusakan karena dipanaskan dengan

waktu kontak yang lebih lama ( 10 menit). Hasil serupa dilaporkan oleh

Turkmen dkk. (2004) yang mengemukakan bahwa perebusan menyebabkan

penurunan kadar total fenol pada kacang polong, bawang bombay dan

gambas.

Perlakuan pemanasan dengan microwave (P4) menghasilkan kadar

total fenol yang tidak berbeda nyata dengan P3 diduga akibat proses

pemanasan tersebut kurang mampu mendenaturasi protein dalam minuman

cokelat dikarenakan waktu kontak pemanasan yang relatif singkat (satu

menit) serta suhu pemanasan minuman cokelat yang lebih rendah ( 88-

89oC) bila dibandingkan dengan suhu pemanasan P2 dan P3 ( 98-99

oC).

Gelombang energi yang dipancarkan oleh microwave akan diteruskan ke

29

dalam sistem melalui air yang bersifat polar menuju komponen-komponen

polar lain, seperti senyawa-senyawa fenolik dan katekin (Kaufmann dkk.

2001 dalam Pak-Dek dkk. 2011). Diduga lemak dalam minuman cokelat

(26,67 %) yang bersifat non-polar menghambat transfer panas sampel

sehingga menyebabkan proses ekstraksi senyawa fenolik kurang berjalan

baik. Berdasarkan Heldman dan Singh (2001) konduktivitas panas dari

bubuk kakao sebesar 0,188 W/mC sedangkan konduktivitas panas air pada

suhu 25C adalah sebesar 0,606 W/mC. Koefisien konduktivitas panas

lemak yang lebih rendah dibandingkan dengan air yang terkandung dalam

bubuk cokelat akan menghambat transfer panas gelombang microwave ke

dalam sampel..

4.2 Pengaruh Pemanasan terhadap Kadar Total Flavonoid Minuman Cokelat

Penentuan kadar total flavonoid dilakukan dengan menggunakan

metode aluminium klorida kolorimetri. Dalam penelitian ini, kadar total

flavonoid minuman cokelat dianalisa menggunakan (+)-katekin dan (-)-

epikatekin sebagai standar. Total flavonoid minuman cokelat dinyatakan

sebagai mg katekin ekivalen/gram (mg CE/g) dalam penentuan kadar (+)-

katekin. Sedangkan dalam penentuan kadar (-)-epikatekin, total flavonoid

dinyatakan sebagai mg epikatekin ekivalen/gram (mg ECE/g).

Kadar total fenol sampel minuman cokelat yang lebih rendah

dibandingkan kadar total flavonoid diduga disebabkan adanya senyawa

fenolik dalam lemak cokelat yang tidak terekstrak sehingga hasil analisa

tidak menggambarkan total fenol sampel minuman cokelat secara utuh.

Hasil ini didukung oleh hasil penelitian Othman dkk. (2007) yang

menunjukkan bahwa kadar total fenol biji kakao yang diekstrak dengan

pelarut etanol lebih tinggi dibandingkan biji kakao yang diekstrak dengan

30

pelarut air. Selain itu, waktu ekstraksi yang dilakukan oleh Othman dkk.

(2007) yang lebih lama (dua jam) dibandingkan dengan waktu ekstraksi

yang dilakukan dalam penelitian ini (15 menit) diduga juga mempengaruhi

banyaknya senyawa fenolik yang terekstrak.

Terjadi peningkatan kadar total flavonoid minuman cokelat, baik

total (+)-katekin maupun (-)-epikatekin setelah dilakukan proses preparasi.

Berdasarkan Gambar 4.2, kadar (-)-epikatekin dari empat perlakuan berkisar

antara 360-473 mg ECE/gram bubuk cokelat, sedangkan kadar (+)-katekin

berkisar antara 188-274 mg CE/gram bubuk cokelat.

36

44 47

38

19

27 27 23

0

10

20

30

40

50

P1 P2 P3 P4

Kon

sen

trasi

Perlakuan

Total (-)-Epikatekin

Total (+)-Katekin

Gambar 4.2 Kadar Total Flavonoid Minuman Cokelat

Kadar total (-)-epikatekin minuman cokelat lebih tinggi

dibandingkan kadar total (+)-katekin. Hal ini sesuai dengan teori yang

dikemukakan oleh Kwik-Uribe dan Bektash (2008) yang mengatakan

bahwa monomer flavanol dalam cokelat didominasi oleh (-)-epikatekin dan

juga (+)-katekin dalam jumlah yang jauh lebih kecil. Cooper dkk. (2007)

dalam Jalil dan Ismail (2008) mengemukakan bahwa keberadaan epikatekin

dominan pada semua cokelat dengan rasio 1:0,1 dibandingkan katekin.

Rasio katekin yang lebih besar dari 0,1 disebabkan oleh epimerasi dari (-)-

31

epikatekin menjadi (+)-katekin setelah kakao mengalami proses

pemanggangan (Caligiani dkk. 2007 dalam Hurst dkk. 2011).

Berdasarkan uji ANAVA ( = 0,05), diketahui bahwa perbedaan

proses preparasi tidak memberikan pengaruh nyata pada kadar total

flavonoid minuman cokelat, baik total (+)-katekin maupun (-)-epikatekin.

Gotti et al. (2006) dan Kofink dkk. (2007) dalam Hurst dkk. (2011)

melaporkan bahwa proses pemanggangan atau Dutch processing

menghasilkan pembentukan stereoisomer baru, (-)-katekin yang tidak

ditemukan pada biji kakao segar. Kadar total flavonoid yang tidak berbeda

nyata antar perlakuan diduga disebabkan akibat terjadinya epimerisasi dari

(-)-epikatekin menjadi (-)-katekin. Hurst dkk. (2011) mengemukakan bahwa

epimerisasi dari (-)-epikatekin menjadi (-)-katekin terjadi akibat pemanasan

pada proses pemanggangan dan akibat Dutch processing.

4.3 Aktivitas Scavenging Metode Penghambatan DPPH dari Minuman Cokelat

Karakteristik antioksidan berpengaruh terhadap mekanisme kerja

antioksidan dalam tubuh manusia. Karakteristik antioksidan yang diukur

dalam penelitian ini adalah scavenging activity. Scavenging activity

menunjukkan kemampuan antioksidan dalam minuman cokelat untuk

menurunkan konsentrasi radikal bebas murni DPPH (1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazil). Prinsip dari uji ini adalah adanya donasi atom hidrogen dari

substansi yang diujikan kepada radikal DPPH menjadi senyawa non radikal

difenilpikrilhidrazin yang akan ditunjukkan oleh perubahan warna

(Molyneux, 2004). Perubahan warna yang akan terjadi adalah perubahan

dari larutan yang berwarna ungu menjadi berwarna kuning (Pauly, 2001

dalam Rahayu dkk. 2009). Dengan demikian aktivitas penangkalan radikal

bebas dapat dihitung dari peluruhan radikal DPPH. Intensitas perubahan

32

warna ini kemudian diukur pada spektrum absorpsi antara 515-520 nm pada

larutan organik (metanol atau etanol) (Molyneux, 2004). Waktu inkubasi

selama 20 menit diperlukan untuk memastikan radikal DPPH bekerja.

Berdasarkan Gambar 4.3, dapat dilihat bahwa aktivitas scavenging

vitamin E dan minuman cokelat dari empat perlakuan berada pada kisaran

80-90%. Hasil uji ANAVA menunjukkan tidak ada perbedaan nyata pada

aktivitas scavenging minuman cokelat, baik yang berasal dari minuman

cokelat tanpa pemanasan, maupun yang mengalami perlakuan dipanaskan

hingga mendidih, dicampur dengan air mendidih dan dipanaskan dengan

microwave. Hasil ini berlawanan dengan hipotesa awal, yaitu perbedaan

cara preparasi dalam pembuatan minuman cokelat akan menghasilkan

minuman cokelat dengan aktivitas scavenging yang berbeda nyata. Hasil

penelitian ini menyerupai hasil penelitian yang dilakukan oleh Dewi dan

Dominika (2008) pada serbuk sarang semut yang menyimpulkan bahwa

waktu dan suhu penyeduhan tidak mempengaruhi aktivitas antioksidan.

Penelitian yang dilakukan oleh Zhang dan Hamauzu (2004) dalam Turkmen

dkk. (2004) menyimpulkan bahwa metode pemasakan konvensional dengan

microwave tidak menunjukkan perbedaan signifikan terhadap aktivitas

antioksidan.

Aktivitas penangkalan radikal bebas DPPH minuman cokelat dari

keempat cara preparasi dibandingkan dengan -tokoferol (vitamin E)

sebagai standar. Vitamin E merupakan antioksidan alami yang banyak

digunakan sebagai penghambat reaksi oksidasi lipida dalam bahan makanan

(Suryanto dkk. 2011). Konsentrasi yang digunakan adalah 200 ppm

berdasarkan jumlah maksimum dalam makanan yang diperbolehkan dalam

peraturan Uni Eropa (Pokorny dkk. 2001 dalam Alfarabi, 2010).

Berdasarkan hasil penelitian, minuman cokelat yang diperoleh dari berbagai

33

cara preparasi memiliki aktivitas penangkalan radikal bebas DPPH yang

tidak berbeda nyata dibandingkan dengan vitamin E ( 0,05).

78,000

80,000

82,000

84,000

86,000

88,000

90,000

92,000

0 5 10 15 20 25

% P

engh

amba

tan

DPPH

Menit ke-

Grafik Waktu Vs % Penghambatan DPPH pada

Konsentrasi 200 ppm

-tokoferol

P1

P2

P3

P4

Gambar 4.3 Grafik Waktu Vs % Penghambatan DPPH pada Konsentrasi

200 ppm

4.4 Hubungan Senyawa Fenolik dengan Aktivitas Antioksidan

Tabel 4.1 menunjukkan hubungan antara senyawa fenolik dengan

aktivitas antioksidan minuman cokelat. Total fenol, (-)-epikatekin dan (+)-

katekin tidak berkorelasi secara signifikan terhadap aktivitas scavenging

minuman cokelat. Hasil ini berbeda dengan hasil penelitian Pujimulyani

dkk. (2010) yang menunjukkan bahwa senyawa fenolik dan flavonoid

berhubungan nyata terhadap aktivitas scavenging. Senyawa fenolik yang

tidak berhubungan nyata dengan aktivitas scavenging diduga disebabkan

adanya komponen fenolik yang belum terekstrak dari lemak minuman

cokelat.

34

Tabel 4.1 Hubungan Senyawa Fenolik dengan Aktivitas Antioksidan

Minuman Cokelat

Senyawa Fenolik Aktivitas Antioksidan (DPPH)

Total fenol -0,269

(-)-epikatekin -0,738

(+)-katekin -0,654

Keterangan: *menunjukkan korelasi signifikan pada = 0,05

35

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Proses penyeduhan, perebusan sampai mendidih dan pemanasan

dengan microwave pada pembuatan minuman cokelat meningkatkan kadar

total fenol secara nyata, tapi tidak berpengaruh nyata terhadap kadar total

flavonoid bila dibandingkan dengan pembuatan minuman cokelat tanpa

perlakuan pemanasan. Perlakuan perebusan sampai mendidih dan

pemanasan dengan microwave menghasilkan minuman cokelat dengan

kadar total fenol yang tidak berbeda nyata, sedangkan perlakuan

penyeduhan menghasilkan kadar total fenol paling tinggi.

Perbedaan cara preparasi tidak berpengaruh nyata terhadap

aktivitas scavenging minuman cokelat. Scavenging activity minuman

cokelat dengan berbagai cara preparasi tidak berbeda nyata dibandingkan

dengan vitamin E.

5.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap kadar (-)-katekin

dan prosianidin dalam minuman cokelat sehingga dapat diketahui

hubungannya dengan aktivitas scavenging.

36

DAFTAR PUSTAKA

Akowuah, G. A., Mariam, A. dan Chin, J. H. 2009. The Effect of

Extraction Temperature on Total Phenols and Antioxidant Activity

of Gynura procumbens Leaf, Pharmacognosy Magazines Vol. 5

(17): 81-85.

Alfarabi, M. 2010. Kajian Antidiabetogenik Ekstrak Daun Sirih Merah

(Piper crocatum) IN VITRO. Tesis S-2.

http://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/123456789/41142/2010

mal.pdf (18 September 2012)

Ali, H. 2002. Protein-Phenolic Interactions in Food. Tesis S-2.

http://digitool.library.mcgill.ca/view/action/singleViewer.do?dvs=13

48620653722~352&locale=en_US&show_metadata=false&VIEWE

R_URL=/view/action/singleViewer.do?&DELIVERY_RULE_ID=6

&adjacency=N&application=DIGITOOL-

3&frameId=1&usePid1=true&usePid2=true (26 September 2012).

Astawan, M. 2011. Pangan Fungsional untuk Kesehatan yang Optimal.

http://www.pdgi-online.com/v2/index.php?option=com_

content&task=view&id=607&Itemid=1 (18 Februari 2012)

Badan Standarisasi Nasional (BSN). 2011. Konsumsi Coklat Rendah

Hambat Industri Kakao. http://www.bsn.go.id/news_detail.php?

news_id=3276 (15 Januari 2012)

Bansode, R. R., Xu, Z. M. dan Losso, J. N. 2002. Thermal Degradation of

()-Catechin: Implications in Tea Brewing and Functional Foods.

Abstrak. http://ift.confex.com/ift/2002/techprogram/paper_12611

.htm (20 September 2012)

Bowen, R. 2003. Free Radicals and Reactive Oxygen.

http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/misc_topics/radicals

.html (18 Februari 2012)

Chen, Z., Zhu, Q. Y., Tsang, D., Huang, Y. 2011. Degradation of Green

Tea Catechins in Tea Drinks. Abstrak, Journal of Agricultural Food

Chemistry Vol. 49 (1):477-482.

37

Cronin, J. R. 2004. Comparing Antioxidant Values with The ORAC

Method. Alternative and Complementary Therapies Vol. 10 (3):

167-170.

Crozier, S. J., Preston, A. G., Hurst, J. W., Payne, M. J., Mann, J., Hainly,

L. dan Miller, D. L.. 2011. Cacao Seeds are A Super Fruit: A Comparative Analysis of Various Fruit Powders and Products.

Chemistry Central Journal Vol. 5: 5.

Dai, J. dan Mumper, R. J. 2010. Plant Phenolics: Extraction, Analysis and

Their Antioxidant and Anticancer Properties, Molecules Vol. 15:

7313-7352.

Dangles, O., Dufour, C. 2005. Flavonoids-Proteins Interactions.

Flavonoids Chemistry, Biochemistry and Applications. New York:

CRC Press. http://www.crcnetbase.com/doi/abs/10.1201/ 9781420039443.ch9 (25 September 2012)

Departemen Perindustrian. 2007. Gambaran Sekilas Industri Kakao.

Artikel. https://www.kemenperin.go.id/PaketInformasi/Kakao/kakao

.pdf (31 Januari 2012)

Dewi, Y. S. K. dan Dominika. 2008. Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Fenol

Umbi Sarang Semut (Hydnophytum Sp.) pada Berbagai Suhu

Penyeduhan, Jurnal Agritech Vol. 28 (2): 91-96.

Fardaniah, R. 2011. Menyongsong Era Coklat Indonesia. Artikel.

http://www.phinisinews.com/read/2011/6/27/3592-menyongsong_

era_cokelat_indonesia (15 Januari 2012)

Halim, F. 2011. Peran Senyawa Antioksidan dalam Permen Cokelat

terhadap Pengaturan Tekanan Darah Manusia. Penulisan dan

Seminar Ilmiah S-1. Surabaya: Fakultas Teknologi Pertanian,

Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya.

Halliwell, B., Aeschbach, R., Lolinger, J., Auroma, O. I. 1995.

Toxicology, Journal of Food Chemistry Vol. 33: 601

38 Hassanbaglou, B., Hamid, A. A., Roheeyati, A. M., Saleh, N. M.,

Abdulamir, A. S., Khatib, A., Sabu, M. C. 2012. Antioxidant

Activity of Different Extracts From Leaves of Pereskia bleo

(Cactaceae), Journal of Medicinal Plants Research Vol. 6 (15):

2932-2937

Heldman, D. R., Singh, P. R.. 1984. Introduction to Food Engineering.

London: Academic Press, Inc.

Hersheys. 2010. Recipes by Product. Artikel. http://www.hersheys.com/recipes/recipe-search.aspx?cid=7&url

Beverages.aspx&ICID=KH1427& ICID=KH1427 (2 Juni 2012)

Hurst, W. J., Krake, S. H., Bergmeier, S. C., Payne, M. J., Miller, K. B.,

Stuart, D. A. 2011. Impact of Fermentation, Drying, Roasting and

Dutch Processing on Flavan-3-ol Stereochemistry in Cacao Beans

and Cocoa Ingredients, Chemistry Central Journal Vol. 5:53

Indonesian Commercial Newsletter (ICN). 2010. Perkembangan

Agribisnis Kakao di Indonesia. Artikel.

http://www.datacon.co.id/Agri-2010Kakao.html (12 Maret 2012)

Irina, I., Mohamed, G. 2010. Biological Activities and Effects of Food

Processing on Flavanoids as Phenolic Antioxidants. France: Nancy

University-ENSAIA.

http://www.intechopen.com/download/pdf/pdfs_id/26397 (15 Maret

2012)

Jalil, A. M. M., Ismail, A. 2008. Polyphenols in Cocoa and Cocoa

Product: Is There a Link between Antioxidant Properties and

Health?, Molecules Vol. 13: 2190-2219.

Karadag, A. Ozcelik, B., Saner, S. 2009. Review of Methods to

Determine Antioxidant Capacities, Food Analytical Methods Vol.

2:41-60.

Kwik-Uribe, C., Bektash, R. M. 2008. Cocoa Flavanols: Measurement,

Bioavailability and Bioactivity, Asia Pacific Journal Clinical

Nutrition Vol. 17 (S1): 280-283.

39

Lee, K. W., Kim, W. J., Lee H. J., Lee, C. Y. 2003. Cocoa Has More

Phenolic Phytochemicals and a Higher Antioxidat Capacity than

Teas and Red Wine, Journal of Agricultural Food Chemistry Vol.

51: 7292-7295.

Li, N., Taylor, L. S., Mauer, L. J. 2011. Degradation Kinetics of Catechin

in Green Tea Powder : Effects of Temperature and Relative

Humidity. Abstrak, Journal of Agricultural Food Chemistry Vol. 59

(11): 6082-6090.

Medyaningsih, E. 2009. Potensi Ampas Nanas Sebagai Sumber

Antioksidan: Karakterisasi Antioksidan Ampas Nanas dari Nanas

yang telah Mendapat Perlakuan Blanching. Skripsi S-1. Surabaya:

Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Katolik Widya Mandala

Surabaya.

Molyneux, P. 2004. The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicryl-

hydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Journal of

Science and Technology Vol. 26 (2): 211-219.

Ortega, N., Romero, M., Macia, A., Reguant, J., Angles, N., Morello, J.,

Motilva, M. 2008. Obtention and Characterization of Phenolic

Extracts from Different Cocoa Sources, Journal of Agricultural.

Food Chemistry Vol. 56: 9621-9627.

Othman, A., Ismail, A., Ghani, N. A., Adenan, I. 2007. Antioxidant

Capacity and Phenolic Content of Cocoa Beans, Journal of Food

Chemistry Vol. 100: 1523-1530.

Othman, A., Jalil, A. M. M., Weng, K. K.., Ismail, A., Ghani, N. A.,

Adenan, I. Epicatehin Content and Antioxidant Capacity of Cocoa

Beans From Four Different Countries, African Journal of

Biotechnology Vol. 9(7): 1052-1059.

Petry, R. D., Ortega, G. G., Silva, W. B. 2011. Flavonoid Content Assay:

Influence of the Reagent Concentration and Reaction Time on the

Spectrophotometric Behavior of the Aluminium Chloride-Flavonoid

Complex. Abstrak, Pharmazie Vol. 56 (6): 465-470.

Pomeranz, Y, Meloan, C. E. 1971. Food Analysis: Theory and Practice.

3rd

edition. USA: Chapman and Hall

40 Pribadi, I. 2009. Uji Aktivitas Penangkap Radikal Buah Psidium Guajava

L. dengan Metode DPPH (1,1-Difenil-2-Pikril Hidrazil) serta

Penetapan Kadar Fenolik dan Flavanoid Totalnya. Skripsi S-1.

Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta.

https://etd.eprints.ums.ac.id/5893/1/K100050061.pdf (13 April

2012)

Pujimulyani, D., Raharjo, S., Marsono, Y., Santoso, U. 2010. Aktivitas

Antioksidan dan Kadar Senyawa Fenolik pada Kunir Putih

(Curcuma mangga Val.) Segar dan Setelah Blanching, Jurnal

Agritech 30 (2): 68-74.

Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia. 2007. Teknologi Prapanen

Kakao, Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian, Vol. 29

No.1.

Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia. 2008. Pengolahan Kakao

Sekunder. Leaflet. Jember. Pusat Penelitian Kopi dan Kakao

Indonesia

Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia. 2011. Produk yang

Diperoleh. http://www.iccri.net/index.php?option=com_content&

view=article&id=58&Itemid=97 (13 April 2012)

Rahayu, D. S., Kusrini, D., Fachriyah, E. 2009. Penentuan Aktivitas

Antioksidan dari Ekstrak Etanol Daun Ketapang (Terminalia

catappa L) dengan Metode 1,1-Difenil-2Pikrilhidrazil (DPPH).

Seminar Tugas Akhir S-1. Semarang: Jurusan Kimia Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Diponegoro.

https://:eprints.undip.ac.id/2828/1/JURNAL_DWI_SRI_RAHAYU.

pdf (21 Januari 2012)

Redovnikovic, I. R., Delonga, K., Mazor, S., Dragovic-Uzelac, V., Caric,

M., Vorkapic-Furac, J. 2009. Polyphenolic Content and

Composition and Antioxidative Activity of Different Cocoa Liquors,

Czech Journal of Food Science Vol. 27(5):330-337.

Rohman, S. 2009. Teknik Fermentasi Dalam Pengolahan Biji Kakao.

http://www.majarinmagazine.com/2009/06/teknik-fermentasi-

dalam-pengolahan-biji-kakao (5 September 2011)

41

Santoso, L. 2005. Antioksidan Ekstrak Pollard Gandum Sistem Model

Asam Linloeat Beta Karoten. Skripsi S-1. Surabaya: Fakultas

Teknologi Pertanian, Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya.

Sari, D. C. 2009. Aktivitas Antioksidan Daun Belantas dalam Sistem

Model Asam Linoleat Beta Karoten. Skripsi S-1. Surabaya: Fakultas

Teknologi Pertanian, Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya.

Setiabudi. 2009. Jantung Koroner Penyakit Paling Mematikan Di

Indonesia. http://www.waspada.co.id/index.php?option=com_

content&view=article&id=29643:jantung-koroner-penyakit-paling-

mematikan-di-indonesia&catid=14&Itemid=98 (8 September 2011)

Situmorang, J. P. 2010. Sekilas Tentang Tanaman Kakao.

https://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/19461/4/Chapter%

2520II.pdf (31 Januari 2012)

Shumow, L., Bodor, A. 2011. An Industry Consensus Study on an HPLC

Fluorescence Method for the Determination of ()-Catechin and ()-

Epicatechin in Cocoa and Chocolate Products, Chemistry Central

Journal, 5:39

Suryanto, E., Momuat, L. I., Taroreh, M., Wehantouw, F. 2011. Potensi

Senyawa Polifenol Antioksidan dari Pisang Goroho (Musa sapien

Sp.), Journal Agritech Vol. 31 (4): 289-296.

Teow, C. C., Truong, V., McFeeters, R. F., Thompson, R. L., Pecota, K.

V., Yencho, G. C. 2007. Antioxidant Activities, Phenolics, and Carotene Contents of Sweet Potato Genotypes with Varying Flesh

Colours, Journal of Food Chemistry, 103: 829-838.

Thaipong, K., Boonprakob, U., Crosby, K.., Cisneros-Zevallos, L., Byrne,

D. H. 2006. Comparison of ABTS, DPPH, FRAP and ORAC Assays

for Estimating Antioxidant Activity From Guava Fruit Extracts,

Journal of Food Composition and Analysis, 19: 669-675.

Turkmen, N., Sari, F. dan Velioglu, Y. S. 2004. The Effect of Cooking

Methods on Total Phenolics and Antioxidant Activity of Selected

Green Vegetables, Journal of Food Chemistry Vol. 93 (4): 713-718.

42 Vijithahh, P. K., Nizar, K. 2009. Role of Antioxidants in Biological

System. Artikel. http://farmacists.blogspot.com/2009/05/role-of-

antioxidants-in-biological.html (9 Maret 2012)

Wang, C. C., Chu, C. Y., Chu, K. O., Choy, K. W., Khaw, K. S., Rogers,

M. S., Pang, C. P. 2004. Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity

Assay Versus Oxygen Radical Absorbance Capacity Assay in

Plasma, Clinical Chemistry Vol. 50 (5): 952-954.

Winarsi, H. 2007. Antioksidan Alami & Radikal Bebas: Potensi dan

Aplikasinya dalam Kesehatan. Yogyakarta: Penerbit Kanisius. http://books.google.co.id/books?id=AlC1KQ2Oaj0C&pg=PA3&dq=

winarsi+hery&hl=id&sa=X&ei=90KIT42iJoiTiAK6jL2bCw&ved=

0CDIQ6AEwAQ#v=onepage&q=winarsi%20hery&f=false (14

April 2012)

Yuliatmoko, W. 2007. Efek Konsumsi Minuman Bubuk Kakao Lindak

Bebas Lemak terhadap Aktivitas Antioksidan dan Ketersediaan

Hayati. Tesis. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian

Bogor. http://repository.ipb.ac.id/handle/123456789/10567 (12

Maret 2012)

43 Lampiran 1. Analisa Kadar Lemak Bubuk Coklat dengan Metode

Soxhlet

Prinsip:

Prinsip ekstraksi lemak dan minyak dengan ekstraksi Soxhlet

adalah dengan mengekstrak lemak/minyak dari bahan pangan dengan

menggunakan pelarut organik sehingga diperoleh campuran lemak/minyak

bersama dengan pelarutnya. Setelah itu, labu Soxhlet dipisahkan dari tabung

Soxhlet dan kemudian pelarut yang digunakan dipisahkan dari

lemak/minyak dengan cara diuapkan. Berat lemak/minyak yang diketahui

digunakan sebagai dasar untuk menghitung kadar lemak/minyak (Pomeranz

dan Meloan, 1971).

1. Ditimbang 2 gram bubuk coklat.

2. Sampel dibungkus dengan kertas saring lalu memasukkan dalam

tabung Soxhlet.

3. Air pendingin dialirkan melalui kondensor.

4. Tabung dan labu Soxhlet dipasang pada alat destilasi dan dilakukan

penambahan 60 mL pelarut n-heksana.

5. Proses ekstraksi dilakukan selama 4 jam pada suhu 80C.

6. Tabung dan labu Soxhlet yang berisi campuran pelarut dan minyak

hasil ekstraksi dipisahkan.

7. Pelarut dalam labu Soxhlet diuapkan dengan oven hingga diperoleh

cairan agak pekat.

8. Dilakukan pengeringan dalam oven dengan suhu 100C selama 1 jam.

9. Labu Soxhlet didinginkan dalam eksikator selama 10 menit.

10. Dilakukan penimbangan.

11. Pengeringan dalam oven diulangi sampai diperoleh berat labu konstan

(selisih 2 kali penimbangan berturut-turut 0,2 mg).

44

12. Kadar lemak/minyak sampel dihitung dengan rumus perhitungan

sebagai berikut:

( )

45 Lampiran 2. Analisa Kadar Total Fenol dengan Metode Kolorimetri

Folin-Ciocalteau Fenol (Lee dkk. 2003)

Prinsip:

Menurut Mediyaningsih (2009), reaksi antara senyawa fenolik

dengan reagen Folin-Ciocalteu akan menghasilkan senyawa kompleks

molibdenum tungsten (dalam reagen Folin Ciocalteu terdapat sodium

molibdat dan sodium tungstat). Warna biru yang dihasilkan ditentukan

selain oleh kadar senyawa fenolik, juga oleh variasi struktur dan agen

pereduksi non fenolik sehingga hasil analisa merupakan hasil relatif dari

senyawa fenolik (Green, 2007 dalam Mediyaningsih, 2009). Intensitas

warna biru yang semakin tua menunjukkan kadar total fenol yang semakin

besar. Analisa kadar total fenol mengukur intensitas perubahan warna yang

terjadi ketika oksida metal tereduksi oleh antioksidan polifenol seperti asam

galat dan katekin menghasilkan larutan biru (Mermelstein, 2008 dalam

Mediyaningsih, 2009).

Pengukuran kadar total fenol dilakukan dengan tahapan sebagai

berikut:

a. Pembuatan Kurva Standar Asam Galat

1. 0,025 g asam galat ditimbang secara analitis dalam kertas timbang lalu

dimasukkan dalam beaker glass 100 mL.

2. Ditambahkan 0,2 mL etanol p.a kemudian ditambahkan akuabides

hingga mencapai volume 100 mL (didapatkan larutan asam galat 250

ppm). Kemudian dilakukan homogenisasi dengan pengocokan.

Larutan ini selanjutnya disebut sebagai Larutan Induk Asam Galat.

3. Dibuat Larutan Standar Asam Galat dengan berbagai konsentrasi 0;

50; 100; 150; 200 ppm dengan mengambil masing-masing Larutan

Induk Asam Galat sebanyak 0; 2; 4; 6; 8 mL dan dimasukkan ke

46

dalam labu takar ukuran 10 mL kemudian ditambahkan akuabides

hingga mencapai volume 10 mL.

4. 0,4 mL larutan asam galat standar dipipet secara analitis, kemudian

dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL lalu ditambahkan 0,4 mL

reagen Folin-Ciocalteu dan kemudian dikocok. Setelah lima menit,

ditambahkan 4 mL 7% Na2CO3 (b/v) dan ditambahkan akuabides

hingga mencapai mencapai volume 10 mL lalu dikocok dan diinkubasi

selama 90 menit pada suhu 23oC.

5. Pengukuran absorbansi larutan standar asam galat pada max dengan

spektrofotometer UV-VIS double beam (didapatkan absorbansi

maksimum pada 750 nm).

6. Pembuatan kurva standar antara absorbansi (sebagai sumbu y) dengan

konsentrasi (sebagai sumbu x) dengan satuan ppm. Dihitung

persamaan kurva regresi linier dan dihasilkan persamaan:

Y = ax + b

b. Pengukuran Kadar Total Fenol berdasarkan Metode Folin-Ciocalteu (Lee dkk. 2003)

1. 0,4 mL sampel dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL.

2. Disiapkan blanko, yaitu akuabides.

3. 0,4 mL reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan pada campuran dan

kemudian dikocok.

4. Setelah lima menit, 4 mL 7% Na2CO3 dicampurkan.

5. Ditepatkan dengan akuabides hingga mencapai volume 10 mL.

6. Dilakukan inkubasi selama 90 menit pada suhu 23oC.

7. Dilakukan pembacaan absorbansi menggunakan spektrofotometer

pada 750 nm.

47 Lampiran 3. Analisa Kadar Total Flavonoid berdasarkan Aluminium

Klorida Kolorimetri (Zhishen dkk. 1999 dalam

Lee et al ,2003)

Prinsip:

Prinsip analisa kadar total flavonoid berdasarkan aluminium

klorida kolorimetri adalah aluminium klorida akan membentuk asam

kompleks yang stabil dengan kelompok keto C-4 , C-3 atau dengan

kelompok hidoksil C-5 dari flavon dan flavonol. Aluminium klorida akan

membentuk asam kompleks yang labil dengan kelompok orto-dihidroksil

dalam cincin A- atau B- pada flavonoid (Mabry dkk. 1970 dalam Chang

dkk. 2002).

Pengukuran konsentrasi total flavonoid dilakukan dengan tahapan

sebagai berikut:

a. Pembuatan Kurva Standar (+)-Katekin

1. 0,25 g (+)-katekin ditimbang secara analitis dalam kertas timbang dan

dimasukkan dalam beaker glass 100 mL.

2. Ditempatkan dengan akuabides pada labu takar 1.000 mL (didapatkan

larutan (+)-katekin 250 ppm). Kemudian dilakukan homogenisasi

dengan pengocokan. Larutan ini selanjutnya disebut sebagai Larutan

Induk (+)-katekin.

3. Dibuat Larutan (+)-katekin Standar dengan berbagai konsentrasi 0;

50; 100; 150; 200; 250 ppm dengan mengambil masing-masing

Larutan Induk (+)-katekin sebanyak 0; 10; 20; 30; 40; 50 mL dan

dimasukkan ke dalam labu takar ukuran 50 mL kemudian ditempatkan

dengan akuabides hingga 50 mL

4. 1 mL larutan (+)-katekin standar dipipet secara analitis, kemudian

dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL yang telah berisi 4 mL

akuabides lalu ditambahkan 0,3 mL 5% NaNO2 (b/v), dikocok dan

diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Selanjutnya ditambahkan

48

0,3 mL AlCl3 10%(b/v), dikocok dan setelah 1 menit ditambahkan 2

mL NaOH 1 M. Kemudian ditepatkan dengan akuabides hingga 10 mL

lalu dikocok.

5. Pengukuran absorbansi larutan standar (+)-katekin pada max dengan


maksimum pada 503,6 nm).




Y = ax + b

b. Pembuatan Kurva Standar (-)-Epikatekin

1. 1 mg (-)-epikatekin dilarutkan dalam 2 mL akuabides (didapatkan

larutan (-)-epikatekin 500 ppm. Kemudian dilakukan homogenisasi

dengan pengocokan. Larutan ini selanjutnya disebut sebagai Larutan

Induk (-)-epikatekin.

2. Dibuat Larutan (-)-epikatekin Standar dalam konsentrasi 50 ppm

dengan mengambil masing-masing Larutan Induk (-)-epikatekin

sebanyak 1 mL dan ditempatkan ke dalam labu takar 10 mL

(didapatkan larutan (-)-epikatekin 50 ppm) kemudian ditepatkan

dengan akuabides hingga 10 mL.

3. Larutan (-)-epikatekin standar kemudian dibuat dengan berbagai

konsentrasi 0; 10; 20; 30 dan 40 ppm.

4. 1 mL larutan (-)-epikatekin standar dipipet secara analitis, kemudian

dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL yang telah berisi 4 mL

akuabides lalu ditambahkan 0,3 mL 5% NaNO2 (b/v), dikocok dan

diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Selanjutnya ditambahkan

0,3 mL AlCl3 10%(b/v), dikocok dan setelah 1 menit ditambahkan 2

49

mL NaOH 1 M. Kemudian ditepatkan dengan akuabides hingga 10 mL

lalu dikocok.

5. Pengukuran absorbansi larutan standar (+)-katekin pada max dengan


maksimum pada 501,9 nm).




Y = ax + b

c. Pengukuran Kadar Total Flavonoid berdasarkan Aluminium Klorida Kolorimetri (Zhishen dkk. 1999 dalam Lee dkk. 2003)

1. 1 mL sampel dimasukkan ke dalam tabung volumetrik 10 mL yang di

dalamnya terdapat 4 mL akuabides.

2. Pada menit 0, ditambahkan 0,3 mL 5% NaNO2.

3. Pada menit kelima, ditambahkan 0,3 mL 10% AlCl3.

4. Pada menit keenam, ditambahkan 2 mL NaOH 1M.

5. Tiap tabung ditambah 2,4 mL akuabides dan dikocok.

6. Absorbansi pembentukan warna merah muda diukur menggunakan

spektrofotometer UV-VIS double beam pada 501,9 nm

menggunakan (-)-epikatekin sebagai standar dan pada 503,6 nm

menggunakan (+)-katekin sebagai standar.

50 Lampiran 4. Analisa Aktivitas Antioksidan dengan Spektr

hondy hartanto (6103008026)

Documents