A. Sejarah Penemuan

         Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter

Perlmann dan Eva Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang

imunologi  (ELISA konvensional) untuk menganalisis interaksi antara antigen dan

antibodi di dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan

menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelopor/ reporter/ signal.

         Dalam perkembangan selanjutnya, selain digunakan sebagai uji kualitatif

untuk mengetahui keberadaan suatu antibodi atau antigen dengan menggunakan

antibodi atau antigen spesifik, teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji

kuantitatif untuk mengukur kadar antibodi atau antigen yang diuji dengan

menggunakan alat bantu berupa spektrofotometer atau dengan cara menetukan

jumlah penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga dapat dibuat suatu

kurva standard an kadar antibodi atau antigen yang tidak diketahui dapat

ditentukan.

B. Prinsip Dasar Tes ELISA

      Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai

berikut :

         Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu

permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui

dua cara, yaitu penempelan secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan

microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibody atau

antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara

ini digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau antigen

spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan

sampel => bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik ,

sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik)

dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara

antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut

dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada saat

substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi

atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan

bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pda

ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen

spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa

pendaran flourescense.

C. Jenis tes ELISA

Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik

ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat

antibodi-enzim, dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi

(primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibody kedua

(sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal.

Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA

sandwich.

Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis

teknik. Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan

teknik ELISA tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini

adalah beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain :

a. ELISA Direct

           Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik

ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen

pada sampel ELISA direct menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal)

untuk mendetaksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.

           Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang

mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel

pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk

membuang antigen yang tidak menempel pda dinding lubang microtiter. Lalu

antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang-

lubang microtiter sehingga dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan,

yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antibody tertaut

enzim signl yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke dalam lubang-lubang

microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal,

sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan

antigen yang diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan

signal dapat dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan antigen

tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan kolorimetri,

chemiluminescent, atau fluorescent end-point.

           ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :

a. Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut

dengan enzim.

b. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan

mahal.

c. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari

antibodi pada percobaan yang berbeda.

d. Amplifikasi signal hanya sedikit.

e. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan

sebelum digunakan untuk uji ELISA direct.

Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain :

a. Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.

b. Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi

silang dengan antibody lain   (antibody sekunder) dapat diminimalisasi.

b. ELISA Indirect

Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA

yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi

dan diukur konsentrasinya merupakan antibody. ELISA indirect menggunakan

suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibody sekunder spesifik tertaut enzim

signal untuk mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan pada sampel yang

diuji.

Pada ELISA indirect, pertama mocrotiter diisi dengan larutan yang

mengandung antigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapal menempel

pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk

membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter.

Kemudian larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan

dimasukkan ke dalam lubang-lubnag microtiter, sehingga terjadi terjadi interaksi

antara antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan. Selanjutnya microtiter

kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen

spesifik. Lalu ke dalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibody

sekunder spesifik tertaut enzim signal, sehingga pada lubang microtiter tersebut

terjadi interaksi antara antibody yang diinginkan dengan antibody sekunder

spesifik tertaut enzim signal.  Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang

antibody sekunder tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antibody

spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang

dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yag tertaut dengan antibody

sekunder speifik yang telah berinteraksi dengan antibody yang diinginkan akan

bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.

ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain :

Membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA

direct karena ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat

terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan dan

antara antibody  yang diinginkan dengan antibody sekunder tertaut enzim signal,

sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu

pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibody spesifik

tertaut enzim signal.

Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain :

a. Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar

komersial di pasar.

b. Immunoreaktifitas  dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh

oleh penautan enzim signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka

pada wadah berbeda.

c. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan

memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.

c. ELISA Sandwich

           Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk

menangkap antigen yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal

untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip

kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA

sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena

antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibody primer

spesifik dan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik  ELISA

sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi

antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent

seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich, antibody primer

seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder

seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedagkan antibody sekunder

seringkali disebut sebagai antibody deteksi.

           Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan

untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah

pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA

sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan

akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibody.

           Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang

mengandung antibody penangkap, sehingga antibody penangkap tersebut dapat

menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas

untuk membuang antibody penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang

microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan

dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara

antibody penangkap dengan antigen yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter

kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak bereaksi dengan antigen

penangkap. Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi

antibody detector sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara

antigen yang diinginkan dengan antibody detector. Selanjutnya microtiter dibilas

lagi untuk membuang antibody detector yang tidak berinteraksi dengan antibody

spesifik. Kemudian pada tahap akhir  ELISA indirect, ditambahkan substrat yang

dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut pada antibody

detector yang telh berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi

dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

a. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’

b. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir

c. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

d. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

e. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan 

antigen

f. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan

berikatan dengan antibodi primer.

g. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat

dibuang.

h. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal

berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia.

i. Diukur absorbansinya  untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari

antigen

           Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yng mempengaruhi

tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain :

a. Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada

dinding-dinding microtiter.

b. Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen

sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari

teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA

sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat sensitivitasnya yang relatif

lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi

dengan dua jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody

detector. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki

kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi

antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibody

yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang

berbeda (epitopnya harus berbeda).

d. ELISA Biotin Sterptavidin (Jenis ELISA Modern)

Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga

dikembangkan untuk mendeteksi antibody dengan tingkat sensitivitas relatif lebih

tinggi. Teknik ini dikenal sebagai teknik ELISA penangkap antibody, dimana

prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich, hanya saja yang digunakan dalam

teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detector (antigen bertaut enzim

signal, bersifat opsional apabila antibody yang diinginkan tidak bertaut dengan

enzim signal).

Contoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik ELISA untuk mendeteksi

vitamin biotin yang bertaut dengan suatu antibody avidin dengan mengubah

antibody avidin menjadi antibody streptavidin, dimana satu molekul streptavidin

dapat mengikat empat molekul biotin (pengembangan dari ELISA indirect),

sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin kuat akibat interaksi antara

biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak.

e. ELISA Kompetitif

Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA

terdahulu.Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu

competitor ke dalam lubang mikrotiter.Teknik ELISA kompetitif ini dapat

diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau antibody.

Pada pendeteksian antigen, pertama  mikrotiter diisi antibody spesifik yang

dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik

bertaut enzim signal, sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada

bagian dinding-dinding lubangmikrotiter. Lalu larutan yang mengandung antigen

spesifik yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang

mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang

mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen spesifik bertaut enzim signal

dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antibody spesifik

yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen spesifik

tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik.

Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat

bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim

yang tertaut dengan antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan

bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada

proses pendeteksian ini, pendeteksian positif ditandai oleh tidak adanya signak

yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang diinginkan telah menang

berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan

antibody spesifik.

Sedangkan pada pendeteksian antibody, pertama mikrotiter diisi antigen

spesifik yang dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun

antibody spesifik tertaut enzim signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat

menempel pada bagian dinding-dinding mikrotiter, kemudian mikrotiter dibilas

untuk membuang antigen spesifik yang tidak menempel pada dinding-dinding

mikrotiter. Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik yang telah ditautkan

dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody yang

diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi

kompetisi antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang

diinginkan untuk dapatberinteraksi dengan antigen spesifik, yang dilanjutkan

dengan membilas mikrotiter untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim

signal atau antibody yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu,

kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat

bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik, sehingga enzim

yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan

bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada

proses pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya

signal yang ditimbulkan, yang berarti antibody yang diinginkan telah menang

berkompetisi dengan antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi

dengan antigen spesifik.

Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya

purifikasi terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang

diinginkan, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi

akibat sifat spesitifitas dari antibody dan antigen.

Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah

dibahas sebelumnya, yaitu: 

1. Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran

antigennya 

2. Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang

yang telah dilapisi antigen 

3. Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak

antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat

pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah

disebut kompetisi 

4. Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik untuk antibodi

primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim 

5. Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi

sinyal kromogenik/ fluoresensi.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen

orisinal,semakin lemah sinyal yang dihasilkan.

f. ELISA Multiplex

Teknik ELISA merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan

untuk pengujian secara simultan,sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik

ELISA terdahulu.

       D. Kelebihan dn Kelemahan Teknik ELISA

Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :

a. Teknik pengerjaan relatif sederhana

b. Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja,

sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)

c. Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.

d. Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar

antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara

antibodi atau antigen yang bersifat sangat spesifik)

e. Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Kekurangan dari teknik ELISA antara lain :

a. Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini

hanya jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu

antigen)

b. Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi

poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang

relatif mahal.

c. Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian

akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan

inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen

asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan

menimbulkan signal.

d. Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga

pembacaan harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini

dapat diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).