Teknik Analisa

I. Sejarah Penemuan dan Prinsip Dasar Teknik ELISA

Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter

Perlmann dan Eva Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang

imunologi (ELISA konvensional) untuk menganalisis interaksi antara antigen dan

antibodi di dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan

menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelapor/ reporter/ signal.

Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simpel dapat dijabarkan sebagai

berikut:

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik

biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi

kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan

sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai

bidang industri.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas

untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui

diimobilisasi pada suatu permukaan solid(biasanya berupa lempeng mikrotiter

polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau

spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang

sama, disebut ‘sandwich’ ELISA).

Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk

kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan

enzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan

dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci

dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi

yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan

substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan

kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat

kromogenik, meskipun metode metode terbaru mengembangkan substrat

fluorogenik yang jauh lebih sensitif. Dalam perkembangan selanjutnya, selain

digunakan sebagai uji kualitatif untuk mengetahui keberadaan suatu antibodi atau

antigen dengan menggunakan antibodi atau antigen spesifik, teknik ELISA juga

dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur kadar antibodi atau

antigen yang diuji dengan menggunakan alat bantu berupa spektrofotometer atau

dengan cara menentukan jumlah penambahan atau kadar antibodi atau antigen,

sehingga dapat dibuat suatu kurva standar dan kadar antigen atau antibodi yang

tidak diketahui dapat ditentukan.

ELISA tradisional secara khusus memiliki reporter dan substrat yang

menghasilkan beberapa bentuk perubahan warna yang dapat diamati untuk

mengetahui kehadiran antigen atau analyte. Bentuk teknik ELISA terbaru seperti

teknik flurogenic,electro chemiluminescent , dan real-time PCR dibuat untuk

mengetahui sinyal kuantitatif. Metode ini dapat memberikan berbagai keuntungan

diantaranya sensitifitas yang tinggi dan bersifat multiplexing (Leng et al , 2008).

II. Kelebihan & Kekurangan Teknik ELISA

Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain:

Teknik pengerjaan relatif sederhana.

Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang digunakan hanya satu saja,

sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)

Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.

Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar

antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara

antibodi dan antigen yang bersifat sangat spesifik)

Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain:

Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini

hanya jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu

antigen)

Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi

poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya

yang relatif cukup mahal.

Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian

akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang

disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder

atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim

signal dan menimbulkan signal.

Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat,

sehingga pembacaan harus dilakukan dengan cepat (pada

perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan

untuk menghentikan reaksi).

III. Alat & Bahan Yang Digunakan

Bahan

Kit ELISA yang terdiri dari :

plate ELISA yang telah dilapisi (coated) dengan antibodi atau antigen

Antigen yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau

dikuantifikasi berupa antibodi).

Antibodi yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau

dikuantifikasi berupa antigen).

Larutan standard (kontrol positif dan negatif).

Sampel yang ingin dites.

standar antibiotik

Konjugate atau enzim penanda

Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal

Larutan pencuci ( Buffer )

Larutan penghenti reaksi (stop solution)

Peralatan

- Timbangan

- Gelas ukur

- Single mikro pipet 5-50 μl, 50-1000 μl

- Multi channel mikro pipet 5-50 μl, 50-300 μl

- Bak reservoar

- Homogenizer/stomacher/mortar,

- Sentrifuger atau filter

- Penangas air

- Inkubator

- ELISA Plate washer atau labu semprot

- ELISA Plate Reader dengan filter panjang gelombang 400-600 nm untuk

pengukuran kuantitatif

- Komputer

IV. Macam-Macam Teknik ELISA

Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik

ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat

antibodi-enzim, dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi

(primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua

(sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal.

Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA

sandwich.

A. Indirect ELISA

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk menentukan

konsentrasi antibodi dalam serum adalah:

1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya

ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan

menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi

antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk

mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum

albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.

Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-

spesifik dari protein lain ke plate.

3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan

sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang

sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen

dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein

total harus sama dengan antigen standar.

4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang

diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen

terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau

protein yang terbloking.

5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi,

ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi

enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi

berkonjugasi dengan enzim.

6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang

tidak terikat.

7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan

sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.

8. Hasil dikuantifikasi dengan Elisa Reader / spektrofotometer,

spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi

terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai

molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode

imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan

menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil

dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada

permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di

bawah ini.

B. Sandwich ELISA

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’

2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir

3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen

6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan

berikatan dengan antibodi primer

7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi‐enzim yang tidak terikat dapat dibuang

8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/

berfluoresensi/ elektrokimia

9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji

sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang

dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada

sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan

lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja

sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi

tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain:

Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada

dinding lubang microtiter

Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen

Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari

teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich

ini pada dasarnya berada pada tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi

karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan 2 jenis antibodi,

yaitu antibodi penangkap dan antibodi detektor. Namun demikian, teknik ELISA

sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan

untuk mendeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua

jenis antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang

berbeda (epitopnya harus berbeda).

V. Contoh Langkah Kerja Teknik ELISA

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai

berikut:

Standart Operating Procedure (SOP)

MicroPlate Reader Instructions

(Thermo Multiskan EX)

1. Turn on plate reader (back, right ), and let it warm up for at least 1 min

2. Log on to computer with

3. Click on “Ascent software” icon.

4. When window comes up, click on “measure” in the left side column.

5. Select your filter.

6. Put plate in holder. (Remove lid.)

7. Click on START at the top, middle of the computer screen

8. Data will magically appear on the computer screen. (Remove your plate from

its

holder.)

9. Now you can copy and paste the data into Excel, then store it appropriately.

10. TURN OFF THE PLATE READER.

11. Log off of the computer.

12. Replace the cover on the plate reader.

13. Admire your data, then turn out the lights on your way out.

Modul Training Elisa Microplate ReaderLab.Biologi FMIPA UNNESSemarang, 11 Nopember 2012

Created by : Enang KholisMobile : 0812 8202721Email : enangkholis@yahoo.com