Prinsip pemeriksaan metode Prinsip pemeriksaan metode Elisa, PCR dan ElektroforeseElektroforese

Dr.Ozar Sanuddin, SpPK(K)S , Sp K(K)Bagian Patologi Klinik

F k lt k d kt r USU/UISUFakultas kedokteran USU/UISUMedan

Prinsip pemeriksaan ImunologisPrinsip pemeriksaan Imunologis

Umumnya berdasarkan pada interaksiUmumnya berdasarkan pada interaksi antigen(Ag) dan antibodi(Ab).I t k i ti d tib di tbInteraksi antigen dan antibodi tba :- Tingkat primer.- Tingkat sekunder.- Tingkat tertierTingkat tertier.

Tingkat primerTingkat primer

Merupakan awal reaksi ikatan molekuler antara Ag dan Abmolekuler antara Ag dan AbReaksi tidak terlihat dengan mata

telanjang(biasa)Perlu indikator

indikator :- Radioisotop- Enzim atauEnzim atau - zat warna flouresen.

Indikator dilengketkan ke Ag atau Ab.

Nama metode pemeriksaan untukNama metode pemeriksaan, untuk menentukan interaksi antara Ag danAb disesuaikan dengan namaAb disesuaikan dengan nama indikator diatas.Ilmu yang mempelajari tentang reaksiIlmu yang mempelajari tentang reaksi Ag dan Ab serologi

RadioisotopRadio Immuno AssayRadioisotop Radio Immuno Assay (RIA).

Enzim Enzyme Immuno AssayEnzim Enzyme Immuno Assay (EIA) Elisa

Fl I fl iFlouresen Immunoflouresensi

Metode ini untuk menentukan kadar Agatau Ab yang rendah ngy g g

Tingkat sekunderTingkat sekunder

PresipitasiPresipitasi Aglutinasi.

Tingkat tertierTingkat tertier

Interaksi antara Ag dan Ab terjadiInteraksi antara Ag dan Ab terjadi dalam tubuh manusia/ invivo.

Teknik ELISATeknik ELISA

Untuk menentukan kadar Ag atau AbUntuk menentukan kadar Ag atau Ab.Indikator berupa enzim dilenketkanpada Ag atau Abpada Ag atau Ab.Ada beberapa metode.

Prinsip Metode ElisaPrinsip Metode Elisa

Bil kit dit k i ti (A )Bila kita mau menditeksi antigen(Ag): Ag(serum) + AbEAg- AbE komplek icuci Inkubasi dengan substrat kromogenik( l t k b ) b bil(semula tak berwarna) berwarna,bila dihidrolisis oleh enzim intensitas warna yang terjadidiukur denganwarna yang terjadidiukur dengan fotometer/ spektrofotometer kadar antigen.antigen.

Prinsip Metode Elisa[Sambungan]Hidrolisis oleh enzim berlangsung dalam waktu ttt.a tu tttReaksi berhenti bila ditambahkan asam atau basa kuat.a au basa uaReaksi harus berlangsung dalam keaadan optimal dimana p- kadar reaktan- temperaturtemperatur- masa inkubasi yang telah ditentukan secara eksperimental setiap reagensecara eksperimental setiap reagen dari fabrik ber beda prosedur berbeda.

Reaksi optimal sudah ditentukanReaksi optimal sudah ditentukan secara eksperimental,dengan penetapanpenetapan - kadar reaktan

t t- temperatur- masa inkubasi setiap reagen dari fabrik berbeda prosedur berbeda.p

Metode ElisaMetode Elisa

Metode kompotitifMetode kompotitifNon kompotitif [Langsung]I di k t d i hIndirek atau sandwich

Metode kompotitifMetode kompotitif

Umumnya untuk menentukan Ag Umumnya untuk menentukan Ag. Ab spesifik [dilekatkan pada partikel

/sumur ] dicampur bersama sama Ag */sumur ] dicampur bersama sama Ag * tambahkan serum [Ag] yang akan

b i d A * t k ik tbersaing dengan Ag*untuk mengikat Ab diatas kompleks Ag*-Ab-Ag

Metode Elisa[sambungan]Metode Elisa[sambungan]

Non kompotitif[ menentukan AbNon kompotitif[ menentukan Ab atau AgIndirek/sandwich menentukan AbIndirek/sandwich menentukan Ab dan Ag

A Ab A tiAb* tib di- Ag-Ab-AntiAb* antibodi yang dicari- Abs Ag Ab*Ag yang dicari

ElektroforeseElektroforese

Dikenalkan oleh Tiselius 1930Dikenalkan oleh Tiselius,1930 berkembang menentukan protein serum dan urinserum dan urinElektroforese merupakan teknik pemeriksaan yang berguna untukpemeriksaan yang berguna untuk pemisahan dan mengukur kadar makromolekul (protein)makromolekul (protein)

Komponen komponen El kt fElektroforese

Dapar/BufferDapar/BufferMedia pendukung.

M di l- Media gel agarosa- Media selulosa asetat Power suply unitPewarna ProteinPewarna Protein Densitometer

Power suply unit

Menghasilkan energi pada kedua elektroda pergerakan dan p gpemisahan molekul protein.

Tegangan dan besar arus dapat Tegangan dan besar arus dapat dikendalikan.

Pewarna ProteinPewarna Protein

Panceou redPanceou redamino black C i blCoomassie blue

DensitometerDensitometer

Alat pengukur kuantitas berdasarkan intensitas warna pita padaintensitas warna pita pada elektroforese, saat media pendukung melalui sistem optik yang bekerjamelalui sistem optik yang bekerja seperti fotometer

Prinsip Dasar ElektroforesePrinsip Dasar Elektroforese

Tergantung pada :Tergantung pada :A. Muatan partikelB K t i iB. Kecepatan migrasi.

A. Muatan :A. Muatan Partkel bermuatan, dalam media pendukung nya bila terpapar dengan medan listrik akannya, bila terpapar dengan medan listrik, akan bergerak kearah elektroda yang berlawanan.Molokul protein bersifat ampoter Bila proteinMolokul protein bersifat ampoter. Bila protein berada pada lingkungan pH dibawah titik iso elektrisnyaprotein akan bermuatan neto y ppositip dan sebaliknyaPada pH isoelektrik protein tidak bermuatan listrik atau muatannya nol

B. Kecepatan Migrasi.B. Kecepatan MigrasiKecepatan migrasi protein tergantung

pada :1.Kekuatan medan listrik.

Makin besar perbedaan muatan netomakin cepat gerakan.neto makin cepat gerakan.

2.Ukuran molekul : Makin kecil molmakin cepatMakin kecil mol makin cepat

gerakan

3.Media pendukung :3.Media pendukung : Pori pori media bersifat filter.

4 Viscositas media4.Viscositas mediaMakin tinggi viscositas makin lambat gerakangerakan

5.Kekuatan medan listrik : tegangan listrik besarmigrasi cepatbesarmigrasi cepat.

6.Endoosmosis yaitu gerakan berlawanan arah dalam media pendukungarah dalam media pendukung.

7.Kadar ion dalam dapar: kadar ion rendah migrasi cepatrendah migrasi cepat

8.Suhu: suhu tinggi migrasi cepat.

6.Endoosmosis:yaitu gerakan berlawanan arah dalam media pendukung.p g

7.Kadar ion dalam dapar: kadar ion rendah migrasi cepatkadar ion rendah migrasi cepat

8.Suhu: suhu tinggi migrasi cepat.

Fraksi fraksi Serum Protein Elektroforesis

Dengan gel agarosa :Prealbumin- Prealbumin

- Albumin- Alfa 1 globulin- Alfa 2 globuling- Beta globulin

Gama globulin- Gama globulinFraksi fraksi protein terlihat berupa pita

it ifik l t k dpita yang spesifik letaknya dan digambarkan densitometer berupa kurva

Fraksi fraksi protein terlihat berupa pitaFraksi fraksi protein terlihat berupa pita pita yang spesifik letaknya.

Densitometermenghasilkan fraksiDensitometer menghasilkan fraksi protein berupa kurva

Berdasarkan Pergerakan SPEBerdasarkan Pergerakan SPEPrealbumin

F k i t i b i i li- Fraksi protein yang bermigrasi paling dekat ke anoda.

Albumin,- Fraksi protein terbanyak.p y- Fungsi mempertahankan tekanan

osmotikosmotik

Alfa1 globulinAlfa1 globulinAlfa 2 globulin.B t 1 l b liBeta1globulin.Beta 2 globulin.Gamma globulin migrasi terdekat ke katoda.

Polymerase Chain Reaction(PCR).ym ( ).

Metode yang cepat dan sederhanaMetode yang cepat dan sederhana,untuk mengkopi dan memperbanyak urutan DNA spesifik yang dinginkanurutan DNA spesifik yang dinginkan dan divisualisasikan sebagai pita yang jelas pada agarose geljelas pada agarose gel.

Scara mendasar sebenarnya PCRScara mendasar sebenarnya PCR mengulangi siklus :

Denaturasi- Denaturasi- Hibridasi dari DNA yang dinginkan

d b t DNA idengan bantuan DNA primer- Extensi regio DNA tsb oleh enzim

DNA polymerase.

Pada PCR konvensionalPada PCR konvensional - Target amplifikasi adalah asam

nukleat harus dilakukan terlebihnukleat harus dilakukan terlebih dahulu sampai selesaiB didit k i- Baru diditeksi.

Pada PCR yang baru amplifikasi dilakukan terhadap sinyal sedangkan target asam nukleat tidak diamplifikasi.

Pada PCR yang baruPada PCR yang baru Amplifikasi dilakukan terhadap sinyal.T t kl t tid k diTarget asam nukleat tidak diamplifikasi.

Prinsip PCR1 Ekstraksi DNA1. Ekstraksi DNA 2. Alat PCR

a. Target DNAgb. Persiapan larutan reaksi PCR (d NTP,,bufer,primer DNA

danTaq DNA polymerasec Denaturasi DNAc. Denaturasi DNA

Initial denaturation : 5 menit,t 94 CDenaturation : 1 menit 94 CPrimer annealing : 1 menit 50 CCopying of DNA by DNA polymerase fi l l ti 10 it 72 Cfinal elongation 10 menit ,72 C

Program alat PCR bisa dilakukan 25 -30 siklusg