PEMERIKSAAN SEROTIPE VIRUS DENGUE DENGAN METODE RT-PCR

Dyah Widiastuti

Balai Litbang P2B2 Banjarnegara

Demam Berdarah Dengue (DBD)

• merupakan masalah kesehatan masyarakat diIndonesia

• Kasus DBD dilaporkan pertama kali diIndonesia pada tahun 1968 di Surabaya danJakarta.

• Angka insidensi nasional tahun 2010 mencapai65,7/100.000 penduduk

• daerah terjangkit mencapai lebih dari 80,48% kabupaten/kota.

Serotype Virus Dengue

virus Dengue yang terdiri dari empat serotype yaitu

• Dengue-1

• Dengue-2

• Dengue-3

• Dengue-4

termasuk dalam genus Flavivirus, familiFlaviviridae

• Keterkaitan virus Dengue secara serologis dengan Flavivirus yang lain telah dikaji oleh Sabin (1950) dalam Henchal and Putnak (1990) yang kemudian melaporkan adanya reaksi silang (cross reaction) antara serum convalescent penderita Dengue yang mengandung anti-Dengue dengan antigen dari Yellow fever virus, Japanese encephalitis virus dan West Nile virus

Biomolekuler Virus Dengue

• virion Dengue memiliki genom yang terdiri dari satu single-stranded (ss) RNA

• Genom virus Dengue mengkode tiga protein struktural yang meliputi protein kapsid (C), protein membrane (M), dan envelope (E) dan tujuh protein non struktural (NS).

5′-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2BNS3-NS4A-NS4B-NS5-3′

Struktur dan Komposisi virus Dengue

Pemeriksaan RT-PCR untuk Deteksivirus Dengue

• RT-PCR adalah salah satu jenis PCR, yaitusuatu teknik laboratoris yang digunakanuntuk membentuk kopi suatu sekuen DNA dalam jumlah yang banyak dalam prosesyang disebut amplifikasi.

• Pada RT-PCR, rantai RNA terlebih dahuluditranskrip menjadi suatu complementary DNA (cDNA) dengan menggunakan enzimreverse transcriptase

One Step dan Two Step RT-PCR

• One step: Tahap reverse transcription (RT) dilakukan pada tabung yang sama

• Two step: Tahap reverse transcription (RT) pada tabung yang berbeda

• Kelebihan one step:

- waktu lebih singkat

- hemat biaya

- mengurangi risiko kontaminasi

Protokol Yong (2007)

Primer untuk deteksi RNA virus Dengue dengan One Step Multiplex RT-PCR

• Untuk forward primer (Dcon) didesain sekuenyang komplemen pada daerah 5’UTR, sedangkan4 reverse primer yang lain (D1, D2, D3 danD4) didesain untuk komplemen dengan daerahtarget yang spesifik dari protein M dan C untukmasing-masing serotipe.

• Keseluruhan primer ini memiliki melting temperatures (Tm) dan GC content (GC%) yang sama pula. Dengan demikian, keseluruhanprimer tersebut dapat bekerja secara sinkronpada kondisi yang sama.One step multiplex RT-PCR

Program dalam thermal cycler

(i) sintesis cDNA 1 siklus : 60˚C selama 45 menit;

(ii) predenaturasi 1 siklus : 94˚C selama 2 menit;

(iii)amplifikasi 30-35 siklus : 94˚C selama 30 detik (denaturasi), 60˚C selama 30 detik(annealing), 68˚C selama 1 menit (ekstensi);

(iv) ekstensi akhir 1 siklus : 68˚C selama 5 menit.

Prinsip kerja

• Sintesis DNA : merubah RNA menjadi cDNA

• Denaturasi : membuka rantai double helix

• Annealing : penempelan primer

• Ekstensi : polimerisasi copy DNA