Rekayasa Genetika Elisabeth 1306371035

CARA MEMBUAT PRIMER

Primer yaitu suatu  polimer asam nukleat pendek (oligonukleotida)  yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat, dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates), buffer PCR, dan enzim DNA polimerase (Reece 2004: 153). Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan primer. Terdapat dua dua jenis primer dalam suatu reaksi PCR yaitu primer reverse dan forward yang bekerja pada dua untai berbeda (sense dan antisense) dalam satu DNA (Nicholl 2002: 121).

Langkah umum membuat primer: 1. Mengetahui untai DNA yang akan kita amplifikasi. 2. Membuat dua jenis primer, yaitu primer forward dan reverse. 3. Menentukan primer berdasarkan syarat-syarat membuat primer yang ideal

(dibahas dibawah).

Membuat desain primer menggunakan aplikasi, sbb.

Primer merupakan komponen PCR yang sangat menentukan akurasi sekuen DNA yang ingin diamplifikasi. Urutan nukleotida primer akan menjadi penentu pada bagian mana primer akan menempel (anneal) pada genom. Jika urutan nukleotidanya tidak sesuai dengan kode gen yang kita inginkan, dapat dipastikan produk PCR yang dihasilkan akan keliru. Oleh sebab itu, sebelum melangkah pada

tahap amplifikasi dengan PCR, primer yang akan digunakan harus dipastikan dahulu spesifitasnya. Caranya ialah dengan membuat desain primer.Primer yang digunakan dalam amplifikasi umumnya terdiri dari dua jenis, yakni forward dan reverse. Forward primer bergerak dengan arah  5′ –> 3′ untai DNA template. Sementara reverse primer bergerak dengan arah 3′ –> 5′ untai DNA template. Kedua primer ini dapat didesain dengan mengunakan program aplikasi yang terdiri dari BIOEDIT, GENAMICS EXPRESSION, OLIGOCALCULATOR, dan FAST PCR. Untuk memahami cara kerjanya, berikut ini contoh langkah mendesain primer untuk gen selulase pada Bacillus subtilis atau bglC.

1. Menentukan posisi bglC dalam  whole genom Bacillus subtilis.2. Mencari tahu enzim restriksi yang tidak memotong sekuen gen dengan 

menggunakan program  aplikasi BIOEDIT.3. Memilih enzim restriksi yang akan digunakan untuk insersi gen dengan

mempelajari peta sirkuler dan situs pemotongan pET-21b. Restriksi yang sesuai dengan pET-21 ialah NdeI, NheI, BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII,NotI, XhoI, EagI, AvaI,

4. Menentukan posisi forward primer dan reverse primer dengan Genamics Expresion. Posisi primer diupayakan berdekatan dengan start dan stop kodon serta mengarah ke situs pemotongan enzim restriksi.

Keterangan: Data sumber gen selulase diperoleh B.subtilis str. DLG

5. Jika situs pemotongan enzim restriksi di dekat start dan stop kodon sulit disesuaikan dengan posisi primer, dapat dilakukan mutasi situs pemotongan pada  2-3 nukleotida. Mutasi 2-3 nukleotida pada sekuen gen selulase tidak akan mengurangi daya lekat primer  terhadap untai DNA asalkan presentase Guanin (G) dan Sitosin (C)  primer cukup tinggi.

6. Mengecek desain primer dengan Primer Calculator (pada Genamics Expression) dan atau dengan Oligocalculator.contoh tampilan:

  

 Hasil oligo shelf complimentary untuk reverse primer

7. Mengecek desain primer dengan Fast PCR untuk mengetahui tingkat spesifitas primer dan ukuran produk PCRnya.

SYARAT MEMBUAT PRIMER YANG IDEAL Pertimbangan desain yang penting yang diuraikan di bawah ini sebagai kunci untuk amplifikasi spesifik dengan hasil tinggi.

1. Panjang Primer: Hal ini secara umum diterima bahwa panjang optimal primer PCR adalah 18-22 mer (basa).

Also keep in mind that most oligonucleotide synthesis reactions are only 98% efficient.  This means that each time a base is added, only 98% of the oligos will receive the base.  This is not often critical with shorter oligos, but as length increases, so does the probability that a primer will be missing a base.  This is very important in mutagenesis or cloning reactions.  Purification by HPLC or PAGE is recommended in some cases. 

2. Primer Melting

Temperature: Primer Melting Temperature (Tm) merupakan temperatur yang diperlukan oleh separuh primer dupleks mengalamai disosiasi/lepas ikatan. Primer dengan Tm berkisar antara 52-58 oC sangat ideal, sedangkan Tm diatas 65oC akan mengurangi efektifitas aneling sehingga proses amplifikasi DNA kurang berjalan baik. Tm ini sangat ditentukan oleh jumlah basa GC (GC contains).Tm primer dapat dihitung dengan formula:

a. Tm ( oC) = ((G+C) x4) + ((A+T) x2))……….secara kasar (kurang akurat)

b. Tm( oC) = {ΔH/ ΔS + R ln(C)} - 273.15……..secara akurat 3. Primer annealing temperature : The primer annealing temperature (Ta)

merupakan suhu yang diperkirakan primer dapat berikatan dengan template (DNA) dengan stabil (DNA-DNA hybrid stability). Jika suhu aneling tinggi akan menyulitkan terjadinya iktan primer dengan DNA template sehingga akan menghasilkan produk PCR yang rendah (kurang efisien). Namun jika Ta terlalu rendah akan menyebabkan terjasinya penempelan primer pada DNA template yang tidak spesifik. Ta dapat dihitung dengan menggunakan formula di bawah ini: Ta = 0.3 x Tm(primer) + 0.7 Tm (product) – 14.9 Tm(primer) = Tm primer Tm(product) = Tm produk PCR

4. GC Content : Jumlah Basa G dan C (GC content) di dalam primer yang ideal sekitar 40-60%. The GC content of a primer is the percentage of nucleotides that are either a G or C nucleotides. G-C base pairs have 3 hydrogen bonds rather than just 2 like A-T base pairs. Thus, in comparing two primers with equal length, the one with the higher GC content will have a higher melting temperature.

5. GC Clamp : Jumlah basa G dan C yang terdapat pada 5 basa terakhir (3’) disebut dengan GC clamp. GC clamp yang baik sekitar 3 basa G/C dan tidan melebihi 5 basa G/C. keberadaan G/C di ujung 3’ primer sangat membantu terjadinya stabilitas iktan antara primer dengan DNA template yang diperlukan untuk inisiasi polymerase DNA (proses PCR). Meletakkan 3 atau lebihCs atau Gs pada ujung 3’ primer akan memicu mispriming. Hal ini harus dihindari.

6. Primer Secondary Structures : i) Hairpins : terbentuknya struktur loop/hairpin pada primer sebaiknya dihindari, namun sangat sulit untuk

Oligonucleotide length Percent with correct sequence

10 bases (0.98)10 = 81.7%

20 bases (0.98)20 = 66.7%

30 bases (0.98)30 = 54.6%

40 bases (0.98)40 = 44.6%

memperoleh primer tanpa memiliki struktur hairpin. Hairpin pada ujung 3' dengan ΔG (energy yang dipelukan untuk memecah struktur hairpin) = -2 kcal/mol dan hairpin internal dengan ΔG = -3 kcal/mol masih dapat ditoleransi. ii) Self Dimer : primer dapat beriktan dengan primer lainnya yang sejenis disebut dengan self-dimer . Self-dimer pada ujung 3' dengan ΔG = -5 kcal/mol dan self- dimer pada bagian internal dengan ΔG= -6 kcal/mol masih dapat ditoleransi. iii) Cross Dimer : Primer dapat beriktan dengan primer pasangannya (reverse dan forward) sehingga disebut cross dimmers. Cross dimmer re homologous. Optimally a 3' end cross dimer with a ΔG of - 5 kcal/mol and an internal cross dimer pada ujung 3' dengan ΔG = -5 kcal/mol dan self- dimer pada bagian internal dengan ΔG= -6 kcal/mol masih dapat ditoleransi.

7. Repeats : primer sebaiknya tidak memiliki urutan pengulangan dari 2 basa dan maksimum pengulangan 2 basa sebanyak 4 kali masih dapat di toleransi. Misalnya ATATATAT.

8. Runs : Primers sebaiknya tidak memiliki urutan basa yang di ulang terus menerus. Pengulangan basa berurutan sampai 4 kali masih dapat di toleransi. Misalnya AGCGGGGGATGGGG memiliki urutan basa G diulang 5 kali berturut-turut.

9. Avoid Cross homology : untuk meghindari cross homologi dapat dilakukan dengan cara menganalisis homologi primer dengan DNA genome melalui BLAST-NCBI.

10.Amplicon Length : Panjang PCR produk yang ideal berkisar antara 100-500 basang basa.

11.Optimum Annealing temperature (Ta Opt): Suhu annealing optimum sangat mempengaruhi hasil pcr. TaOpt ini dapat dihitung dengan cara Ta Opt = 0.3 x(Tm of primer) + 0.7 x(Tm of product) - 25 5. Primer Pair Tm

12.Mismatch: Perbedaan Tm sepasang primer sebaiknya tidak lebih dari 5 o C.

MENGHITUNG MELTING POINT SUATU PRIMER The melting temperature of a primer, abbreviate Tm is defined as the temperature at which 50% of that same DNA molecule species form a stable double helix and the other 50% have been separated to single strand molecules. The melting temperature depends on both primer length and sequence. A good rule of thumb for calculating melting temperatures is 4°C*(# G/C nucleotides) + 2°C*(# A/T nucleotides). [This is the rule used to calculate melting temperature in the primer catalog tables. However, to more accurately calculate melting temperature, you can also use one of several online tools. For PCR and sequencing applications, primers should have a melting temperature of 55-65°C, which generally corresponds to a primer 20-25 nucleotides in length with about 40% GC content.

The melting temperature can also be known as the annealing temperature in reference to the temperature at which primers start to bind template DNA during PCR.

The main factors affecting Tm are salt concentration, strand concentration, and the presence of denaturants (such as formamide or DMSO). Other effects such as sequence, length, and hybridization conditions can be important as well.

Equations

The simplest equation for Td is the Wallace rule2:

(1) Td = 2°C(A+T) + 4°C(G+C)

Td is a filter-based calculation where A, G, C, and T are the number of occurrences of each nucleotide. This equation was developed for short DNA oligos of 14-20 base pairs hybridizing to membrane bound DNA targets in 0.9M NaCl.

The melting temperature for the sequence TGCTCA is, 2(1+2) + 4(1+2) = 18°C. The nature of the immobilized target strand provides a net decrease in the Tm observed when both target and probe are free in solution. The magnitude of the decrease is approximately 7-8°C.

Another familiar equation3 for DNA which is valid for oligos longer than 50 nucleotides from pH 5 to 9 is:

(2) Tm = 81.5 + 16.6 log M + 41(XG+XC) - 500/L - 0.62F

Where M is the molar concentration of monovalent cations, XG and XC are the mole fractions of G and C in the oligo, L is the length of the shortest strand in the duplex, and F is the molar concentration of formamide.

This is a far more useful equation to most researchers, as it includes adjustments for salt (although the equation is < when M=0) and formamide , the two most common agents for changing hybridization temperatures.

Thus, at M = 0.9, and F = 0, Tm = 81.5+16.6(log(0.9))+41(.17+.33)-500/6-0.62(0)=17.9° C. Similar equations apply for RNA

DefinitionsTm - The temperature at which 50% of the oligonucleotide and its perfect complement are in duplex.Td - The temperature at a particular salt concentration, and total strand concentration at which 50% of an oligo and its perfect filter-bound complement are in duplex.

TheoreticalSeveral studies have derived accurate equations for Tm using thermodynamic basis sets for nearest neighbor interactions.5The equation for DNA and RNA is:

Where ΔH (Kcal/mol) is the sum of the nearest neighbor enthalpy changes for hybrids, A is a small, but important constant containing corrections for helix initiation, ΔS (eu) is the sum of the nearest neighbor entropy changes, R is the Gas Constant (1.987 cal deg-1 mol-1) and Ct is the total molar concentration of strands. If the strand is self complementary, Ct /4 is replaced by Ct.

ΔH and ΔS values for nearest neighbor interactions of DNA and RNA are shown in Table 1. Please note that this equation includes a factor to adjust for salt concentration.

For example, our sample sequence would result in the following expression assuming 200 nM strand concentration at 900 mM NaCl:                1000*(-5.8-11.1-7.8-5.6-5.8)        ----------------------------------------------------------                               - 273.15 + 16.6log(0.9)        [(-10.8)+(-12.9-26.7-20.8-13.5-12.9)+(1.987)ln[(2.0E-7)/4]]Therefore: Tm = 1.725°C

Notice the considerable difference between the results of equations (1) and (3) in this case. This shows how much of an effect sequence can have on the Tm.

ComparisonsSo which value do we use? Remember that Equation 1 was derived for 14-20mers used in membrane hybridizations and may be expected to have a limited range of applicability - an important point, as this equation is used by almost all researchers for oligos used for PCR as well as blots. Equation 3 is certainly more appropriate in this case. On the other hand, Equation 3 becomes inappropriate for oligos longer than a 50-mer. For long oligos, equation 2 is probably the best choice. The best equation for a particular researcher will depend on the oligo and the type of experiment involved.

Solution based amplification strategies can use the Wallace rule for convenience, but one should add 8° C to the result to convert Td to Tm. Accuracy will also be compromised if the salt concentration varies much from 0.9 M. Researchers doing Southern, Northern or other filter hybridizations can use equation (1) as is. As with any theoretical approach, the results of these equations should be used with caution. Many experiments involve reagents or conditions that invalidate the results of these

equations. Sometimes only an empirical approach provides a satisfactory answer. For instance, in situ hybridizations provide sufficiently different environments from case to case that anomalous results may occur.

Counter ion identity, solvation effects, conjugated groups (biotin, digoxigenin, alkaline phosphatase, fluorescent dyes, etc.), and impurities may also affect the Tm. In these cases, theoretical equations are inaccurate, but still provide a useful estimate to begin development.

ANOTHER BASIC MELTING TEMPERATURE (TM) CALCULATIONS

The two standard approximation calculations are used. For sequences less than 14 nucleotides the formula isTm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4

For sequences longer than 13 nucleotides, the equation used isTm= 64.9 +41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)

ASSUMPTIONS:Both equations assume that the annealing occurs under the standard conditions of 50 nM primer, 50 mM Na+, and pH 7.0.

Salt Adjusted Melting Temperature (Tm) Calculations

A variation on two standard approximation calculations are used. For sequences less than 14 nucleotides the same formula as the basic calculation is use, with a salt concentration adjustment

Tm= (wA+xT)*2 + (yG+zC)*4 - 16.6*log10(0.050) + 16.6*log10([Na+])where w,x,y,z are the number of the bases A,T,G,C in the sequence, respectively.

The term 16.6*log10([Na+]) adjusts the Tm for changes in the salt concentration, and the term log10(0.050) adjusts for the salt adjustment at 50 mM Na+. Other monovalent and divalent salts will have an effect on the Tm of the oligonucleotide, but sodium ions are much more effective at forming salt bridges between DNA strands and therefore have the greatest effect in stabilizing double-stranded DNA, although trace amounts of divalent cations have significant and often overlooked affects

For sequences longer than 13 nucleotides, the equation used isTm= 100.5 + (41 * (yG+zC)/(wA+xT+yG+zC)) - (820/(wA+xT+yG+zC)) + 16.6*log10([Na+])

This equation is accurate for sequences in the 18-25mer ra

OligoCalc uses the above equation for all sequences longer than 13 nucleotides.

The following equation is provided only for your reference. It is not actually used by OligoCalc. It is reportedly more accurate for longer sequences.Tm= 81.5 + (41 * (yG+zC)/(wA+xT+yG+zC)) - (500/(wA+xT+yG+zC)) + 16.6*log10([Na+]) - 0.62F

This equation is most accurate for sequences longer than 50 nucleotides. It is valid for oligos longer than 50 nucleotides from pH 5 to 9. Symbols and salt adjustment term as above, with the term (41 * (yG + zC-16.4)/(wA + xT + yG + zC)) adjusting for G/C content and the term (500/(wA + xT + yG + zC)) adjusting for the length of the sequence, and F is the percent concentration of formamide.

REFERENSI http://science.lecture.ub.ac.id/files/2012/04/design-primer.pdfhttps://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/seq_anal/primer_design/primer_design.htmhttp://oomyceteworld.net/protocols/primer%20designing2.pdfhttp://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/oligos-melting-temp.htmlhttp://www.entelechon.com/2008/08/dna-melting-temperature/http://parts.igem.org/Help:Primers/Glossaryhttp://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.htmlhttp://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html