TEST ELISA

聽 Sejarah ELISA

Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan suatu

immunoassay adalah radioimmunoassay, teknik menggunakan antigen berlabel radioaktif

atau antibodi. Dalam radioimmunoassay, radioaktivitas memberikan sinyal, yang

menunjukkan apakah suatu antigen tertentu atau antibodi hadir dalam sampel.

Radioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam kertas oleh Rosalyn Sussman Yalow

dan Salomo Berson diterbitkan pada tahun 1960. Sebuah mikrobiologi menggunakan

enzim suatu Linked tes Assay (ELISA) immunosorbent, dalam rangka untuk

mengembangkan metode untuk deteksi cepat antigen p24 HIV dalam sampel darah.

Karena radioaktivitas menimbulkan ancaman kesehatan potensial, alternatif yang

lebih aman itu dicari. Sebuah alternatif yang cocok untuk radioimmunoassay akan

mengganti sinyal non-radioaktif di tempat sinyal radioaktif. Ketika enzim (seperti

peroksidase) bereaksi dengan substrat yang sesuai (seperti ABTS atau 3,3 ', 5,5'-

tetramethylbenzidine), perubahan warna terjadi, yang digunakan sebagai sinyal. Namun,

sinyal tersebut harus dikaitkan dengan keberadaan antibodi atau antigen, yang mengapa

enzim harus dihubungkan dengan antibodi yang sesuai. Proses menghubungkan secara

independen dikembangkan oleh Stratis Avrameas dan GB Pierce. Karena itu perlu untuk

menghilangkan antibodi atau antigen terikat dengan mencuci, antibodi atau antigen harus

tetap ke permukaan wadah;. Yaitu, immunosorbent telah harus dipersiapkan. Sebuah

teknik untuk mencapai hal ini diterbitkan oleh Wide dan Jerker Porath pada tahun 1966.

聽

Pada tahun 1971, Petrus Perlmann dan Eva Engvall di Universitas Stockholm di

Swedia, dan Anton Schuurs dan Bauke van Weemen di Belanda mandiri makalah yang

disintesis pengetahuan ini ke dalam metode untuk melakukan EIA / ELISA.

聽

聽 Pengertian ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu

teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi

untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu

sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang

medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam

pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal

ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik

dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan

antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap

terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim

menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat

cahaya dengan panjang gelombang 聽 tertentu disinarkan pada suatu

sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga

jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya

fluoresensi.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan

spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah

antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu

permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter

polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada

permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi

lain yang 聽 spesifik untuk antigen yang sama, disebut 鈥 ?

i>sandwich 鈥 ?/i> ELISA). Setelah antigen diimobilisasi,

antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan

antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan

enzim, atau dapat dideteksi 聽 secara langsung oleh antibodi

sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di

antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen

lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang

tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate

ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang

visibel, yang menunjukkan 聽 kuantitas antigen dalam sampel.

Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik,

meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat

fluorogenik yang jauh lebih sensitif.

Aplikasi ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel,

karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi 聽

antibodi 聽 dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran

antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi

allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA

聽 juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada

berbagai kelas obat.

ELISA adalah tes skrining dahulu banyak digunakan untuk HIV karena kepekaan

tinggi. Dalam ELISA, serum seseorang diencerkan 400 kali lipat dan diterapkan pada

pelat yang antigen HIV yang terpasang. Jika antibodi terhadap HIV hadir dalam serum,

mereka dapat mengikat antigen HIV. Pelat ini kemudian dicuci untuk menghapus semua

komponen lain dari serum. Sebuah "antibodi sekunder" khusus disiapkan - antibodi yang

mengikat antibodi lain - kemudian diterapkan ke piring, mencuci diikuti oleh yang lain.

Ini antibodi sekunder secara kimiawi terkait di muka untuk enzim.

"Anti IgG manusia" Antibodi Ganda Sandwich ELISA

Dengan demikian, piring akan berisi enzim sebanding dengan jumlah antibodi

sekunder terikat ke piring. Sebuah substrat untuk enzim diterapkan, dan katalisis oleh

enzim mengarah ke perubahan pada warna atau fluoresensi. Hasil ELISA dilaporkan

sebagai nomor; aspek paling kontroversial dari tes ini adalah menentukan "cut-off" titik

antara positif dan hasil negatif. Sebuah titik cut-off dapat ditentukan dengan

membandingkannya dengan standar yang dikenal. Jika tes ELISA digunakan untuk

skrining obat di tempat kerja, konsentrasi cut-off, 50 ng / mL, misalnya, didirikan, dan

sampel yang berisi konsentrasi analit standar akan disiapkan. Diketahui bahwa

menghasilkan sinyal yang lebih kuat daripada sampel dikenal adalah "positif." Mereka

yang menghasilkan sinyal lemah, yang "negatif." Dokter Dennis E Bidwell dan Alister

Voller menciptakan tes.

Kegunaan lain dari ELISA meliputi:

1. deteksi antibodi mikobakteri dalam TB.

2. deteksi rotavirus dalam tinja.

3. deteksi penanda hepatitis B dalam serum.

4. deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja.

聽 Tipe-tipe ELISAAda beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikut:1.聽聽聽聽聽 Indirect ELISA2.聽聽聽聽聽 Sandwich ELISA3.聽聽聽聽聽 Competitive ELISA聽

聽 1.聽聽聽聽 Indirect ELISA

聽

(Gambar Mekanisme Indirect ELISA)

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi

konsentrasi antibodi dalam serum adalah:

a) 聽 聽 聽 聽 聽 Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui

konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate

mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan

plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen

yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar 聽 yang

digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu

sampel yang akan diuji.

b) 聽 聽 聽 聽 聽 Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti

bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam

semua lubang plate mikrotiter. 聽 Tahap ini dikenal sebagai

blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik

dari protein lain ke plate.

c) 聽 聽 聽 聽 聽 Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian

dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui,

dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan

untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap

ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi

protein total harus sama dengan antigen standar.

d) 聽 聽 聽 聽 Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk

antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya

akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang,

bukan pada protein serum yang lain atau protein yang

terbloking.

e) 聽 聽 聽 聽 聽 Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang

antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi

sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat

spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi

berkonjugasi dengan enzim.

f)聽 聽 聽 聽 聽 聽 Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-

antibodi yang tidak terikat.

g)聽 聽 聽 聽 聽 Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk

mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.

h) 聽 聽 聽 聽 聽 Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer,

spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit

antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan

memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode

indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik,

sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang

plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel

harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada

permukaan lubang.

聽 2.聽聽聽聽 Sandwich ELISA

聽

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

a) 聽 聽 聽 聽 聽 Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi 鈥 榩 enangkap

鈥?/span>

b)聽聽聽聽聽 Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir

c)聽聽聽聽聽 Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

d)聽聽聽聽 Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

e)聽聽聽聽聽 Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan 聽 antigen

f)聽聽聽聽聽聽 Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan

berikatan dengan antibodi primer

g) 聽 聽 聽 聽 聽 Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat

dibuang

h) 聽 聽 聽 聽 聽 Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal

berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia

i)聽聽聽聽聽聽聽 Diukur absorbansinya 聽 untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari

antigen

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji

sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki.

Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk

protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan

kuantitas antigen yang terimobilisasi.

Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

聽

聽 3.聽聽聽聽 Competitive ELISA

Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah

dibahas sebelumnya, yaitu:

a)聽聽聽聽聽 Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya

b)聽 聽 聽 聽 聽 Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang

telah dilapisi antigen

c)聽聽聽聽聽 Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen

dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang

menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi

d) 聽 聽 聽 聽 Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer.

Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim

e) 聽 聽 聽 聽 聽 Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal

kromogenik/ fluoresensi.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin

lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

聽

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai

berikut:

聽

聽 4.聽聽聽聽 Beberapa dan Portable ELISA (M & P ELISA) (ELISA Reverse di makalah yang diterbitkan)

Sebuah teknik baru (EP 1 499 894 B1 di EPO Buletin 25.02.209 N. 2009/09;

USPTO 7510687 di USPTO Buletin 2009/03/31; ZL 03.810.029,0 di SIPO RRC Buletin

2009/08/04) menggunakan fase padat terdiri dari polistiren immunosorbent batang

dengan 8-12 ogives menonjol. Seluruh perangkat direndam dalam tabung reaksi berisi

sampel dikumpulkan dan langkah-langkah berikut (cuci, inkubasi dalam conjugate dan

inkubasi dalam chromogenous) dilakukan oleh mencelupkan ogives di microwells standar

microplates pra-diisi dengan reagen.

Keuntungan dari teknik ini adalah sebagai berikut:

Para ogives masing-masing dapat peka terhadap reagen yang berbeda, memungkinkan

deteksi simultan dari antibodi yang berbeda dan / atau antigen yang berbeda untuk multi-

target tes;

Volume sampel dapat ditingkatkan untuk meningkatkan sensitivitas tes di klinik (darah,

air liur, urin), makanan (susu curah, telur dikumpulkan) dan (air) lingkungan sampel;

Satu ogive yang tersisa unsensitized untuk mengukur reaksi non-spesifik sampel;

Penggunaan perlengkapan laboratorium untuk mengeluarkan alikuot sampel, mencuci solusi

dan reagen dalam microwells tidak diperlukan, memfasilitasi pengembangan siap

menggunakan laboratorium-kit dan di tempat kit.

5.聽聽聽聽 Material Dalam Metode ELISA

脴聽 Antigen

脴聽 Monoclonal Ab

脴聽 Microplate

脴聽 Blocking Buffer

脴聽 Serum sample

脴聽 Conjugate (secondary Ab + Enzyme)

脴聽 Subtrate

脴聽