Diagram Alir

Isolasi Mikroorganisme

5 gr sampel tanah

45 ml pepton

Homogenkan (10-1

)

Diambil 1 ml

Homogenkan (10-2

)

Pour sampai 10-5

Spread hingga 10-6

Diambil 1 ml dari 3

pengenceran terakhir

Diratakan dengan memutar cawan

membentuk angka 8

Diambil 0,1 ml dari 3

pengenceran terakhir

Diratakan dengan hoki glass

secara aseptis

Diinkubasi pada suhu 37oC

selama 24 jam

Kultur campuran

NA

Isolat tunggal dalam NA

Diambil dengan ose secara aseptis

Dipindahkan ke media NA dalam cawan

petri dengan teknik goresan kuadran

Inkubasi T= 37oC

Kultur tunggal

Diambil dengan ose secara aseptis

Digoreskan ke NA + pati 1% Digoreskan ke NA + skim milk 1% Digoreskan ke NA + olive oil 1%

Inkubasi T= 37oC, t = 24 jamInkubasi T= 37

oC, t = 24 jamInkubasi T= 37

oC, t = 24 jam

Ditetesi larutan iodin 1%

Diamati perubahan warna

Biru = negatif

Coklat = parsial

Bening = positif

Diamati pembentukan zona bening Diamati pembentukan zona keruh

Tinjauan Bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum Isolasi Mikroorganisme Penghasil Enzim (Amilase, Protease, Lipase) ini yaitu : sampel tanah, peptone, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, CaCl2.7H2O, agar, nutrient agar, akuades, pati, skim, iodine, Rhodamine B-agar, nutrient broth, olive oil, serta tributyrin agar. Berikut merupakan penjelasan tentang bahan-bahan tersebut.

Sampel tanah Secara alami, tanah terdiri atas populasi yang berlimpah meliputi tumbuhan dan

hewan mikroskopis, serta mikroorganisme yang berperan dalam menjaga keseimbangan lingkungan yang berlangsung dinamis. Sampel tanah disini berfungsi sebagai sumber mikroba penghasil amilase, protease, dan lipase yang akan diisolasi. Di dalam tanah terdapat banyak sekali kehidupan baik bakteri, jamur dan mikroorganisme lain. Di dalam tanah, keadaan mikroba sangat beragam baik jumlah jenis, kepadatan populasi, maupun aktivitas fungsionalnya. Keanekaragaman ini berkaitan dengan perbedaan kandungan dan jenis bahan organik, kadar air, jenis penggunaan tanah, tingkat pengelolaan tanah, dan kandungan senyawa pencemar (Panagan, 2011).

Pepton Pepton adalah produk campuran polipeptida, dipeptida, dan asam amino, dapat

dihasilkan dari bahan-bahan yang mengandung protein melalui reaksi hidrolisis asam atau enzimatis berfungsi sebagai sumber Nitrogen bagi mikroba. Dengan adanya Niitrogen ini mikroba akan mengalami pertumbuhan yang cepat. Pepton biasa ditambahkan pada media NA (Nutrient Agar). Selain sebagai sumber N, pepton juga sebagai sumber S organic untuk kultur. Pepton dapat diekstrak dari protein hewani berupa daging, organ tubuh bagian dalam, gelatin, susu dan kasein serta tanaman maupun khamir (Manurung, 2010).

K2HPO4 Dikalium fosfat (K2HPO4) memiliki kandungan berupa unsur K yang tinggi dan

sebagai sumber P. Fungsi K2HPO4 adalah sebagai larutan buffer untuk menstabilkan pH medium (Sutarma, 2000).

KH2PO4 KH2PO4 merupakan larutan penyangga asam (buffer asam) yang berfungsi sebagai

larutan pengencer. Larutan pengencer diperlukan untuk mengatur tingkat konsentrasi media pertumbuhan mikroba agar pertumbuhan mikroba menjadi optimal. KH2PO4 tidak mempengaruhi pH sehingga baik untuk digunakan sebagai larutan pengencer. Hal ini karena pertumbuhan bakteri sensitive terhadap perubahan pH, sehingga diperlukan larutan pengencer yang dapat mempertahankan kondisi pH media yang sesuai dengan kebutuhan mikroba. Kandungan kalium dan fosfat pada KH2PO4 berguna untuk memberi nutrisi sel mikroorganisme serta sebagai elemen kunci dalam pengendalian metabolism sel, proses transport, dan dibutuhkan pada metabolisme karbohidrat (Sutarma, 2000).

MgSO4.7H2O MgSO4.7H2O atau Epsom salt (garam Epsom) memiliki pH 6,0 (5,5 ke 7,0) dan

hampir semua mineral bentuk MgSO4 terjadi sebagai hidrat. MgSO4.7H2O berperan sebagai sumber S yang berperan dalam stabilisasi ribosom, stabilisasi membrane, dan dinding sel (Sutarma, 2000).

MnSO4.H2O MnSO4.H2O berfungsi sebagai sumber mineral Mangan (Mn) yang berperan dalam

pertumbuhan mikroba (Sutarma, 2000).

CaCl2.7H2O CaCl2.7H2O berfungsi sebagai sumber mineral yakni Kalsium dan Kalium untuk

mendukung pertumbuhan mikroorganisme (Sutarma, 2000).

Agar Agar memiliki struktur D-galactose, 3,6-anhydro-L-galactose, dan D-glucuronic acid

dan biasanya terbuat dari ganggang merah. Agar berfungsi sebagai gelling agent pada media yang terbuat dari ekstrak alga. Peran agar disini yaitu untuk memadatkan media cair sehingga sel tidak larut dalam cairan. Agar cocok digunakan sebagai bahan pemadat karena setelah agar dilarutkan pada suhu mendidih dapat didinginkan sampai suhu 40-42C sebelum memadat dan tidak akan mencair lagi sebelum suhu mencapai 80-90C. Agar merupakan bahan yang cocok untuk digunakan, meskipun padat, akan tetapi agar lunak dan mudah ditembus oleh biakan. Selain itu agar mengandung sejumlah air yang diperlukan bagi biakan. Agar juga lebih stabil bila dibandingkan dengan air yang lebih mudah menguap dan berubah (Handayani, 2012).

Akuades

Akuades berfungsi sebagai pelarut dalam pembuatan media. Akuades dapat

melarutkan agar, pepton, dan sumber-sumber mineral lain seperti CaCl2.7H2O,

MnSO4.H2O, MgSO4.7H2O, dan lain-lain dalam pembuatan media. Akuades juga

berfungsi untuk menghomogenkan medium dan sumber O (Fuad, 2001).

Pati Pati pada isolasi bakteri penghasil enzim amilase berfungsi sebagai substrat untuk

pertumbuhan bakteri penghasil amilase. Pati disini akan didegradasi oleh bakteri penghasil amilase. Pati juga menjadi indikator dalam penentuan indeks amilolitik atau penentuan bakteri yang mampu mendegradasi pati. Uji ini dilakukan dengan meneteskan iodin 1% pada isolat dalam media pati tersebut. Pati yang tidak terurai akan berwarna biru kehitaman karena mengikat iodium. Pati yang terurai akan ditandai dengan adanya pembentukan zona bening yang menunjukkan bahwa pati yang terdapat di dalam media dihidrolisis oleh enzim amilase menjadi senyawa yang sederhana seperti maltosa, dekstrin dan glukosa (Rachmania, 2004).

Skim Susu skim merupakan susu yang mengandung protein tinggi sekitar 3,7% dan lemak

sekitar 0,1%. Susu skim digunakan sebagi sumber substrat. Susu skim mengandung kasein yang dapat dipecah oleh mikroorganisme proteolitik menjadi senyawa nitrogen terlarut sehingga pada koloni dikelilingi area bening. Area bening ini menunjukkan bahwa mikroba yang tumbuh di area bening tersebut memiliki aktivitas proteolitik (Naiola, 2002).

Iodine Iodin berfungsi sebagai indikator yang digunakan pada isolasi mikroorganisme

penghasil amilase. Pada uji ini Iodin 1% diteteskan di atas koloni. Penetasan larutan Iodin 1% diberikan untuk membuktikkan apakah bakteri yang tumbuh pada media adalah bakteri amilolitik. Pati yang tidak terhidrolisis akan membentuk warna biru dengan iodin yang menunjukkan tidak terdapatnya enzim amylase yang dihasilkan oleh bakteri selain bakteri amilolitik. Pati yang terhidrolisis di sekeliling koloni akan terlihat

area bening, sebagai akibat adanya aktivitas enzim amylase. Area bening tersebut mengindikasikan bahwa pati atau amilum sudah terhidrolisis oleh enzim amylase pada bakteri. Sementara itu, pati yang hanya terhidrolisis sebagian atau tidak terhidrolisis secara sempurna akan terlihat area sengan warna coklat kemerahan disekeliling koloni mikroba yang tumbuh tersebut (Setyati, 2012).

Rhodamine B-agar Rhodamine B-agar digunakan sebagai medium dalam isolasi mikroorganisme

penghasil lipase. Rhodamine B merupakan indikator fluorosens yang sensitif terhadap lipase. Bakteri penghasil lipase akan menghasilkan kompleks berwarna orange pada media Rhodamine B. Hal ini disebabkan oleh reaksi antara Rhodamine B dengan asam lemak yang merupakan produk dari kerja lipase yang dihasilkan oleh mikroba membentuk senyawa kompleks berwarna orange dan berpendar di bawah radiasi sinar UV (Telussa, 2013).

Nutrient Broth Komposisi dalam nutrient broth adalah ekstrak beef dan pepton. Media ini

berbentuk cair. Sumber N dalam nutrient broth dimanfaatkan sebagai makanan dan sumber nutrisi bagi pertumbuhan mikroba (Fuad, 2001).

Nutrient Agar (NA) Merupakan media padat yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba, isolasi,

memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba, dimana dalam proses pembuatannya harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media. NA ini merupakan media untuk mengisolasi bakteri (Panagan, 2011). Dalam percobaan warna NA sebelum dilarutkan dalam aquades adalah coklat, dan setelah dilarutkan dalam aquades berubah menjadi kekuning-kuningan dan terdapat endapan. Jadi untuk menghilangkan endapan tersebut maka dipanaskan dalam penangas air dengan tabung Erlenmeyer disumbat dengan alat penyumbat. Setelah sterilisasi warna medium menjadi agak coklat (Manurung, 2010).

Olive Oil

Olive oil digunakan dalam isolasi mikroorganisme penghasil lipase sebagai substrat

dan sebagai induser bagi mikroba dalam memproduksi lipase. Olive oil terdiri dari

trigliserida dengan ester asam lemak rantai panjang yang merupakan substrat spesifik

yang dikatalisis oleh lipase. Produk hasil hidrolisis substrat tersebut akan berpendar

warna orange apabila disinari di bawah lampu UV pada panjang gelombang 350 nm.

Pendaran ini terjadi karena terbentuknya suatu kompleks antara ion asam lemak yang

dihasilkan pada reaksi hidrolisis enzimatik oleh lipase dengan kationik rhodamine B.

Olive oil juga berfungsi sebagai induser karena mengandung asam lemak oleat-linoleat

yang cukup tinggi, maka trigliserida ini tepat untuk digunakan sebagai induser bagi

lipase (Telussa, 2013).

Tributyrin Agar

Tributyrin agar atau Tween 80 digunakan dalam isolasi mikroorganisme penghasil lipase sebagai substrat bagi enzim (Telussa, 2013).

Daftar Pustaka

Alim, T. 2013. Cara Kerja Enzim. Diakses tanggal 22 Mei 2014. .

Biogen, 2008. Amilase. Diakses tanggal 21 Mei 2014. .

Fuad, Fathir.2001. Media Pertumbuhan Mikroba. http://fuadfathir.multiply.com. Diakses tanggal 7 Mei 2014.

Handayani. 2012. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Jakarta: Universitas Negeri Jakarta. Isahi, D.S. 2013. Enzim. http://biologimediacentre.com/enzim/. Diakses tanggal 1 Mei 2014. Kusnadi, J. 2014. Modul Praktikum Bioteknologi Terpadu. Malang: Universitas Brawijaya. Manurung. P. 2010. Pembuatan Medium dan Sterilisasi . http://pebrinmanurung.blogspot.

com/2010/10/pembuatan-medium-dan-sterilisasi.html. diakses tanggal 4 Mei 2014. Naiola, E., N. Widhyastuti. 2002. Isolasi, Seleksi dan Optimasi Produksi Protease dari

Beberapa Isolat Bakteri. Dalam Jurnal Berita Biologi. Vol. 6 (3): 467- 473. Neutron, T. 2014. Enzim 2. Diakses tanggal 22 Mei 2014. http://biology.tneutron.com

/2014/01/enzim-2.html. Panagan, Almundy. 2011. Isolasi Mikroba Penghasil Antibiotika dari Tanah Kampus Unsri

Indralaya menggunakan Media Ekstrak Tanah. Dalam Jurnal Penelitian Sains. Vol 14(3): 27-30.

Prayitno, D. A. 2011. Penggunaan Enzim dalam Industri Pangan. Semarang: Fakultas Teknik-UNDIP.

Prayitno, D.A. 2011. Penggunaan Enzim dalam Industri Pangan. Semarang: FT-UNDIP. Rachmania N, Iswati R, Imas T. 2004. Karakterisasi -amilase Bacillus firmus KH.9.4

alkalotoleran dari Limbah Cair Tapioka. Dalam Jurnal Biota 3: 129-135. Rath & Subramanyam. 1998. Dalam e-jurnal. 2013. Mikroba Penghasil Amilase.

http://www.e-jurnal.com/2013/09/mikroba-penghasil-amilase.html. diakses tanggal 2 Mei 2014.

Resthy. 2012. Pengembangan Inokulum Yeast (Khamir). http://achendresthy-03-virgo.blog spot.com/2012/11/pengembangan-inokulum-yeast-khamir.html. diakses tanggal 6 Mei 2014.

Safnowandi. 2012. Enzim dan Protein. http://safnowandi.wordpress.com/2012/02/17/enzim -dan-protein/. Diakses tanggal 6 Mei 2014.

Setiowati, T. 2007. Biologi Interaktif untuk SMA/MA Kelas XII. Jakarta: Azka Press. Setyati, W. A. 2012. Isolasi dan Seleksi Bakteri Penghasil Enzim Ekstraseluler (Proteolitik,

Amilolitik, Lipolitik dan Selulolitik) yang Berasal dari Sedimen Kawasan Mangrove. Dalam Jurnal Ilmu Kelautan. Vol. 17 (3): 164-168.

Susanti, E. 2003. Isolasi dan Karakterisasi Protease dari Bacillus subtilis 1012M15. Dalam Biodiversitas. Vol 4 (1) : 12-17.

Sutarma. 2000. Kultur Media Bakteri. Bogor: Balai Penelitian Veteriner. Telussa, I. 2013. Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Lipase Dari Coco Butter Subtitute dan

Karakterisasi Lipasenya. Ambon: Universitas Pattimura. Ummah, J. 2012. 7 golongan enzim/ macam-macam enzim. http://jadidatulummah.blogspot

.com/2012/08/tugas-d-7-golongan-enzim-macam-macam.html. diakses tanggal 1 Mei 2014.