23.1 Membuat DNA Rekombinan

Molekul DNA yang dibuat dengan DNA yang asalnya berbeda dinamakan molekul DNA rekombinan. Setiap fragmen DNA yang dimasukkan dalam molekul pembawa yang kompatibel disebut vektor. 6 tahap dasar dalam pembuatan rekombinan:

1. Isolasi dan pemurnian DNA.Vector dan molekul DNA target dapat disiapkan dengan bermacam-macam metode.

2. Pemotongan urutan DNA Merupakan tahap yang sangat penting dalam teknologi DNA rekombinan. DNA biasanya dipotong-potong dengan produk nuklease dan pembatasan endonuklease.

3. Penghubungan Fragment DNAMolekul rekombinan DNA biasanya dibentuk dengan pemotongan DNA kemudian disisipkan dan digabungkan ke dalam DNA vektor. Fragmen DNA secara khusus bergabung menggunakan DNA ligase.

4. Pengenalan DNA rekombinan dengan sel yang kompatibelDNA yang telah bergabungan dengan DNA vektor harus dikenalkan dengan sel yang kompatibel dengan DNA yang berada dalam sel, dinamakan transformasi genetik. DNA rekombinan dapat dibungkus dengan partikel virus dan ditransfer ke dalam sel dengan transfiksi.

5. Replikasi dan reaksi DNA rekombinan dalam selCloning vektor membantu DNA bereplikasi.

6. Identifikasi sel yang mengandung DNA rekombinanVektor biasanya mengandung marker genetik atau gen, yang membantu seleksi sel yang mengambil DNA asing. Identifikasi partikel fragmen DNA biasanya melibatkan tahap tambahan, yaitu screening klon DNA rekombinan yang memiliki ukuran yang besar.

23.2 Cloning Vector

Vektor untuk Mengklon

Diperlukan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu potongan DNA ke dalam sel agar DNA tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di dalam sel tersebut, antara lain:

1 Vektor berupa plasmid

2 Vektor berupa bakteriofaga

3 Cosmid

4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome) & YAC (Yeast Artificial Chromosome)

1. Plasmid

DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu makhluk hidup

Bentuknya pita ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkular

Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain

Sebuah vektor plasmid pUC19, berisi polylinker yang dapat mengenali beberapa enzim restriksi yang berbeda, sebuah gen yang mengkode resistensi terhadap ampisilin (AMPr) untuk amplifikasi selektif dan asal replikasi (ORI = origin of replication) untuk proliferasi di dalam sel inang.

Multiple Cloning Site (MCS)

Sebuah vektor plasmid dapat dibuat dari plasmid alami, kemudian segmen yang tidak perlu dihapus dan urutan DNA yang ingin dikode disisipkan. Untuk mengkloning sebuah sampel DNA, enzim restriksi yang sama harus digunakan untuk memotong kedua vektor dan sampel DNA.

Oleh karena itu, vektor biasanya berisi urutan (polylinker) yang dapat mengenali beberapa enzim restriksi sehingga vektor dapat digunakan untuk kloning berbagai sampel DNA.

Dalam dunia farmasi, teknologi DNA rekombinan menggunakan vektor plasmid sangat berguna dalam pengembangan obat-obatan. Plasmid E.coli (atau bakteri lainnya) yang digunakan sebagai vektor harus mengandung suatu gen yang menghasilkan sifat resisten terhadap antibiotik tertentu (drug-resistence gene). Pada gambar sebelumnya, plasmid mengandung AMPr yang nantinya bakteri tersebut dapat memproduksi enzim β-lactamase. Enzim tersebut membuat bakteri resisten terhadap ampisilin (antibiotik golongan beta laktam, yang cara kerjanya menghambat sintesis dinding sel bakteri). Dengan mengetahui mekanisme genetik yang menyebabkan resistensi suatu bakteri terhadap obat, maka obat baru dapat dikembangkan.

Plasmid yang Dimiliki oleh Escherichia coli

Berasal dari plasmid alami E. coliPotongan DNA tambahanPotongan DNA tambahan

Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)

Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk binatang lain

Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan

Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA asing disambung, akan dihasilkan "plasmid rekombinan"

Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai

Kloning Terorientasi

Bila diinginkan untuk menginsersikan potongan DNA asing dengan orientasi tertentu

Dilakukan dengan memotong DNA vektor maupun DNA sumber gen yang dikehendaki menggunakan dua enzim restriksi yang berbeda

Simplified Procedure

Vektor berupa Plasmid

Keunggulan:

Kecil, mudah pengerjaannya

Strategi seleksi mudah

Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran kecil (< 10kbp)

Kelemahan:

Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)

2. Vektor berupa Bakteriofaga (l phage)

l-fag merupakan virus yang dapat menginfeksi bakteri. Keuntungan utama dari vektor ini adalah efisiensi transformasi yang tinggi, sekitar 1000 kali lebih efisien daripada vektor plasmid.

Skema gambar kloning DNA menggunakan fag sebagai vektor. Pertama, DNA akan di kloning dimasukkan ke dalam DNA, menggantikan sebuah wilayah yang tidak penting dari fag. Kemudian, untuk sistem perakitan in vitro, virion membawa DNA rekombinan dapat dibentuk. Panjang genom adalah 49 kb, dan dapat membawa hingga 25 Kb DNA asing.

Vektor berupa Bakteriofaga

Keunggulan:

Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (10 - 23 kbp)

Seleksi berdasar ukuran

Kelemahan:

Lebih sulit pengerjaannya

3. Vektor Kosmid (Cosmids)

Kosmid adalah kombinasi dari plasmid vektor dan situs COS yang memungkinkan target DNA untuk dimasukkan ke dalam kepala λ-fage.

Perakitan Virion

Kloning dengan menggunakan vektor kosmid. (a) Selain AMPr, ORI, dan polylinker seperti vektor plasmid, vektor kosmid juga berisi situs COS. (b) Setelah vektor kosmid dibelah dengan enzim restriksi, mereka dikombinasikan dengan fragmen DNA. Perakitan dan langkah-langkah transformasi selanjutnya sama seperti kloning dengan bacteriophage (λ-fage).

Vektor Cosmid

Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna dari situs l cos (dihilangkan pada vektor l)

Keunggulan:

Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)

Seleksi berdasar ukuran

Pengerjaan seperti plasmid

Kelemahan:

Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)

4. Vektor YAC

Kromosom ragi buatan (Yeast Artificial Chromosome) vektor mampu membawa fragmen DNA besar (hingga 2 Mb), tetapi efisiensi transformasi sangat rendah.

Komponen penting vektor YAC:

a) Sentromer (CEN), telomer (TEL) and sekuen untuk replikasi otonom (ARS = autonomous replicating sequence) untuk proliferasi di dalam sel inang.

b) ampr amplifikasi spesifik dan sebagai marker / penanda bagi DNA TRP1 dan URA3 untuk mengidentifikasi sel yang mengandung vektor YAC.

c) situs yang dapat dikenal oleh enzim restriksi, contohnya EcoRI dan BamHI.

Kloning menggunakan vektor YAC

Vecktor YAC

Sebagian DNA target dicerna oleh EcoRI. Sementara, vektor YAC dibelah oleh EcoRI dan BamHI (enzim restriksi). Segmen vektor YAC dengan DNA fragmen disambungkan kembali untuk membentuk kromosom buatan. Kemudian lakukan proses transformasi untuk membuat sejumlah besar salinan.

Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp dan dimasukkan ke dalam yeast

Vektor BAC

BACs dan YACs

BACs : Bacterial Artificial Chromosomes

YACs : Yeast Artificial Chromosomes

Keunggulan:

telomere telomerecentromereURA3ARS HI

S3replicationorigin

markers

largeinserts

Replikasi dimediasi oriS dan oriEparA and parB mengendalikan agar hanya terdapat satu vektor dalam selMenggunakan penanda ketahanan terhadap KhloramfenikolR

Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)

Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa nukleotida total genom

Kelemahan:

Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan ukuran sangat besar

Shuttle Vector

Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang (memiliki origin of replication dari masing-masing inang)

Memilih Vektor

23.3 Identifikasi Sel Inang berisi DNA Rekombinan

Saat vektor kloning dan DNA yang akan disisipkan digabung secara in vitro, molekul DNA rekombinan dapat dimasukkan ke dalam sel inang yang kebanyakan merupakan sel bakteri seperti E.coli. Secara umum, transformasi bukanlah cara yang efisien untuk menempatkan DNA pada sel karena hanya sebagian kecil bagian sel yang disisipkan DNA rekombinan. Akibatnya sel yang berhasil mengalami transformasi harus dapat dibedakan dengan sel yang tidak mengalami transformasi. Untuk mengidentifikasi sel inang yang mengandung DNA rekombinan memerlukan seleksi gen dan uji lainnya.

Dalam penyeleksian, sel ditumbuhkan dalam kondisi dimana sel yang bertransformasi dapat bertahan hidup; sedangkan sel lain akan mati. Sel yang bertransformasi dapat diidentifikasi keberadaan DNA rekombinan yang diinginkan secara individual.

A. Strategi Penyeleksian dengan Gen markerKebanyakan seleksi memerlukan gen marker yang sesuai (gen marker : gen yang keberadaanya dapat dengan mudah dideteksi). Sebagai contoh, banyak vector plasmid bakteri membawa gen marker yang dapat mengkode β-laktamase, yang dapat mengkatalisis reaksi hidrolisis antibiotic β-laktam. Hanya sel yang ditransformasi dengan plasmid yang membawa atau mengekspresikan gen β-laktamase yang dapat tumbuh pada media yang mengandung ampisilin, sel seperti ini resistan terhadap ampisilin. Bakteri yang tidak mengandung plasmid akan mati saat ditumbuhkan pada media yang mengandung ampisilin ini. Metode seleksi ini sangat efektif dalam mengeliminasi banyak sel yang tidak tersisipi DNA pada saat tahap transformasi.Penyeleksian juga dapat dilakukan dengan penyisipan agen peng-inaktivasi. Pada teknik ini, penyisipan fragmen DNA di dalam daerah pengkodean gen fungsional pada vector akan

Ukuran DNA yang disisipkanUkuran vektor Situs enzim restriksi yang tersediaJumlah salinan (copy number)Efisiensi kloningKemampuan untuk menapis DNA sisipanPenelitian yang diinginkan

membuat gen tersebut ter-inaktivasi. Jika gen mengkode produk yang mudah terdeteksi, penyisipan penginaktivasi dapat digunakan dalam penyeleksian dan pengamatan. Sebagai contoh, plasmid Pbr322 mengandung dua gen yang resisten terhadap antibiotik (yang satu resisten ampisilin dan yang lain resisten tetrasiklin). Yang biasanya digunakan adalah cloning site dengan gen yang resisten terhadap tetrasiklin. Penyisipan DNA pada salah satu site ini akan menginaktivasi gen yang resisten terhadap tetrasiklin dan akan memberikan peningkatan pada transformant yang mengandung gen yang sensitive terhadap tetrasiklin tapi resisten terhadap ampisilin. Sel yang tidak ditransformasi dengan penyisipan inaktivator adalah ampRtetR (resisten terhadap ampislin dan tetrasiklin) sedangkan sel tanpa satu pun plasmid adlan ampStetS (sensitive terhadap ampisilin dan tetrasiklin).

B. Seleksi pada EukariotBeberapa vector plasmid yang ditumbuhkan pada ragi membawa gen ragi LEU2, yang dapat mengkode enzim β-isopropilat dehidrogenase, enzim esensial dalam jalur biosintesis leucine. Sel mutan ragi yang kehilangan fungsi gen LEU2 tidak dapat tumbuh akibat ketidakberadaan leusin. Sel yang ditransformasi dengan plasmid yang mengandung LEU-2 dapat tumbuh pada media yang miskin leusin. Kebanyakan marker ragi yang lain pada umumnya sering digunakan untuk seleksi ini.

C. Marker Visual : Penyisipan Peng-inaktivasi gen β-GalactosidaseVisual marker pun dapat digunakan untuk mengamati sel inang yang mengandung molekul DNA rekombinan. Sebagai contoh, gen lacZ pada E.coli mengkode enzim β-Galactosidase, yang dapat mengkatalisis reaksi hidrolisis dalam sintesis substrat 5-bromo-4chloro-3-indolyl β-D-Galactosidase(yang dikenal sebagai X-gal). Potongan X-gal dapat meghasilkan pewarnaan biru, 5-bromo-4-chloroindole. Keberadaan pewarnaan biru mengidentifikasikan sel mengandung β-Galactosidase aktif. Ketidakberadaan enzim ini menunjukkan X-gal ini tidak dipotong, dan tidak ada warna biru yang teramati.Kebanyakan vector cloning plasmid membawa gen lac-Z atau modifikasi yang dapat menghasilkan aktivitas β-Galactosidase. Dalam gen lacZ terdapat banyak site restriksi dimana DNA asing dapat disisipkan. Vector tanpa penyisipan menghasilkan β-Galactosidase fungsional dan memberikan peningkatan koloni berwarna biru dengan keberadaan X-gal. Saat DNA disisipkan pada salah satu site, gen lacZ terinterupsi dan rekombinan yang dihasilkan tidak dapat memproduksi β-Galactosidase fungsional. Pleh karena itu, koloni yang mengandung DNA rekombinan berwarna putih. Teknik pengamatan ini sangat baik karena single white colony dapat dibedakan dari 104 koloni yang berwarna biru.

23.4 Genomic Libraries

Teknologi DNA rekombinan terbukti sangat berguna untuk mengisolasi fragmen DNA spesifik dalam jumlah besar dengan genom yang kompleks. Proses pengkloning fragmen ini biasanya dimulai dengan konstruksi DNA-library. DNA-library hanyalah sekumpulan dari molekul DNA rekombinan yang dihasilkan dengan me-ligasi semua fragmen DNA particular pada sampel ke dalam vector. Molekul DNA rekombinan kemudian disisipkan ke dalam sel, dimana setiap rekombinan akan bereplikasi. Tipe DNA-

library yang terbentuk bergantung pada penyisipan, jenis vector yang digunakan dan jenis persoalan alamiah yang terinvestigasi.

Genom Libraries, yang menggambarkan keseluruhan DNA dari genom organisme, biasanya menggunakan vector cloning yang merupakan turunan dari bakteriofage. Vektor cosmid, YAC dan BAC pun biasa digunakan dalam mengkonstruksi genom-libraries, terutama bila genom sangat besar. Vektor YAC dapat mengakomodasi penyisipan sekitar 500kb, yang berarti untuk kebanyakan spesies eukariotik dibutuhkan sebanyak 1000 YAC yang berbeda. BAC libraries memegang peran penting dalam Human Genomic Project. BAC libraries mengandung kurang lebih 2000 BAC yang berbeda mengandung 3 miliar pasangan basa. Setiap rekombinan mengandung fragmen genom manusia sebesar 150 hingga 200 kb. Genomic libraries termasuk DNA yang terekspresi maupun yang tidak terekspresi pada manusia. Pada sel eukariot dengan genom yang besar dan kompleks, non-coding DNA meyusun fragmen yang terdapat pada library.

23.5 cDNA Libraries are made from mRNA

Proses pembuatan cDNA libraries dimulai dengan pemurnian mRNA. Kebanyakan teknik untuk memurnikan molekul mRNA dari eukariot mengambil keuntungan dari ekor poli-A yang terdapat pada mRNA eukariotik yang matang. Hal ini memungkinkan mRNA eukariotik untuk dipisahkan dari mRNA dan molekul tRNA, yang kekurangan ekor poli-A. mRNA yang mengandung ekor poli-A (kira-kira 3% dari total RNA) berikatan secara selektif dengan oligodeoksitimidilat (oligo dT) yang berikatan pula secara kovalen dengan matriks insoluble seperti selulosa.

Pada langkah pertama, populasi mRNA adalah inkubasi dengan oligo dT, yang hybridizes ke poli A urutan pada ujung 3 'dari setiap molekul mRNA. Fragmen oligo dT bertindak sebagai primer untuk sintesis DNA yang berdiri komplementer oleh reverse transcriptase. Hibrida mRNA-cDNA yang dihasilkan kemudian diobati dengan RNase H, enzim yang nicks RNA, RNA meninggalkan kecil fragmen dasar-dipasangkan ke untai DNA. Fragmen ini digunakan sebagai primer oleh DNA polimerase I, yang merusak RNA fragmen karena 5 '- 3' aktivitas exonuclease dan menggantikan RNA dengan. Sebuah untai DNA berkelanjutan karena hasil sepanjang template (reaksi analog dengan bergabung fragmen Okazaki selama replikasi DNA). Produk dari reaksi ini adalah molekul cDNA double stranded urutan yang sesuai dengan yang ada pada mRNA asli. molekul cDNA sering dikonversi menjadi lengket molekul cDNA berakhir dengan menambahkan oligonukleotida sintetik. Pembangunan perpustakaan cDNA selesai oleh ligating molekul cDNA untuk vektor dan memperkenalkan rekombinan ke dalam sel inang.

Faktanya, cDNA library pada populasi molekul mRNA yang berbeda ditemukan pada tipe sel yang berbeda. Walaupun molekul DNA genom identik pada setiap sel dalam satu organism, tetapi molekul mRNAnya berbeda tergantung pada fungsi spesifik dari setiap tipe sel. Ketika sel hati dan sel otak memiliki banyak molekul mRNA yang identik, setiap tipe sel juga memiliki molekul mNA yang mengkode setiap komponen penting yang memiliki fungsi spesifik. Pembentukna cDNA library dari jaringan spesifik dimana target protein meningkatkan kesempatan berjalannya proses cloning gen yang sukses. Sebagai contohnya, cDNA globin yang melimpah pada library yang tengah dibentuk dengan mRNA yang diisolasi

dari sel darah merah. Sebagai catatan yaitu tidak mungkin untuk mengklon gen untuk protein yang yang tidak diekspresikan di dalam jaringan.

Vector λ dan plasmid digunakan dalam pembentukan cDNA library. Library-library ini harus menunjukkan semua gen yang diekspresikan dalam sel khusus atau jaringan pada waktu khusus selama proses perkembangan. Ketika cDNA library lebih banyak diperoleh dari mRNA yang telah dewasadibandingkan dari transkrip mRNA primer atau dari gennya sendiri, cDNA yang dibentuk tidak memiliki intron dan bentunya tidak lebih kompleks bial dibandingkan dengan genom library. cDNA library yang berkualitas memiliki jumlah klon rekombinan yang banyak dan ukuran cDNA yang lebar. Kesimpulannya, kualitas dari library yang dibentuk adalah tergantung pada mRNA yang digunakan baik itu ukurannya dan kemurniannya dan efisiensi dari setiap langkah dalam proses pengerjaannya.

23.6 Screening a Library

Proses cloning yang sulit dimana diperlukan banyak waktu adalah isolasi DNA rekombinan dari banyak rekombinan yang berbeda yang terdapat dalam library. Kemungkinan suatu library (dengan ukuran tertentu)memiliki klon-klon khusus diatur dalam persamaan berikut ini:

P=1−(1−n )N atau N=ln (1−P)ln (1−n)

Dimana N adalahjumlah rekombinan di dalam library, P adalah kemungkinan menemukan klon khusus dan n adalah frekuensi dari kejadian klon yang diinginkan. Seluruh fragmen DNA diasumsikan sudah disisipkan ke dalam vector dan dipropagasi dengan efisiensi yang sama. Frekuensi kejadian (n) tergantung pada tipe dari library. Pada DNA library genom, n merupakan rasio ukuran fragmen DNA yang disipkan dengan ukuran dari gemon itu sendiri.

Pada cDNA library, kemungkinan diperolehnya klon yang kita inginkan tegantung padakelimpahan dari molekul mRNA original dan bukan ukuran dari genom. Sehingga, n dalam cDNA library merupakan kelimpahan dari molekul mRNA.

Pada umumnya, metode untuk seleksi atau “probing”, DNA library untuk rekombinan yang kita inginkan harus memungkinkan beribu-ribu rekombinan untuk dianalisis secara berkala. Probe adalah suatu molekul yang dapat mengenal secara spesifik bagian DNA yang kita inginkan dalam suatu library yang besar. Probe memiliki tipe yang berbeda-beda dan metode penyeleksiannya dikembangkan agar dapat mendeteksi klon asam nukleat (dengan berikatan dengan klon DNA) atau secara tidak langsung (dengan mendeteksi produk gen yang merupakan hasil dari klon DNA).

Sel yang terdapat dalamklon library dipelihara/ditumbuhkan di dalam plat petri secara individual dipisahkan dari koloninya. Asam nukleat atau protein dari sel dilepaskan ditransfer ke suatu filter dimana mereka dihentikan. Filter yang sudah diberi label kemudian dibawa ke probe sehingga dapat dideteksi (label yang biasa digunakan adalah isotop radioaktif, fluorescent dyes dan enzim yang aktivitasnya menghasilkan warna ketika diberikan suatu substrat yang cocok). Setelah probe yang berlebih dihilangkan dengan cara dicuci, lokasi tempat berikatannya probe secara spesifik dapat

dideteksi dengan teknik yang tepat untuk label (misal autoradiograophy untuk probe radioaktif). Lokasi ikatan probe di dalam filter dicocokkan dengan lokasi koloni klon di dalam plat petri. Karena tidak ada satu pun teknik yang 100% aman untuk digunakan, screening selalu dilakukan dengan filter ganda untuk memberikan hasil yang positif benar (diperlihatkan oleh kedua filter) agar dapat dibedakan dengan hasil yang positif salah (ditunjukkan oleh hanya satu filter).

Klon cDNA digunakan lebih banyak bila dibandingkan deengan mRNA sebagai probe untuk pengkodean gen protein pada DNA library genom. Pemurnian molekul cDNA khusus menggunakan teknologi DNA rekombinan lebih mudah bila dibandingkan dengan pemurnian molekul mRNA dari sel secara individu.

23.7 Kromosom berjalan

Sulit mengisolasi genomic library dengan teknik yang telah dijelaskan sebelumnya. Contoh : gen bias termutasi, produknya tidak teridentifikasi. Gen bertanggung jawab untuk kelainan bawaan pada manusia. Fragmen DNA rekombinan dari daerah yang paling dekat dengan kromosom digunakan sebagai titik awal ke gen yang diinginkan. Pada teknik ini, fragmen DNA yang overlap diisolasi berturut-turut pada library. Disetiap langkah, wilayah DNA yang lebih besar dari DNA dikloning,memungkinkan ilmuwan untuk ‘berjalan’ disepanjang kromosom. Contoh kromosom berjalan :

Perjalanan dimulai dengan isolasi fragmen DNA yang merupakan salah satu terminal dari rekombinan awal. Fragmen terminal diberi label dan digunakan untuk menyelidiki genomic library, yang mengidentifikasi semua rekombinan yang mengandung gen tersebut. DNA yang dimurnikan dari masing-masing rekombinan individu kemudian dibelah dengan restriksi endonuklease dan dipetakan untuk mengidentifikasi bagian yang terjauh untuk masuk ke daerah yang berdekatan dengan mulainya klon rekombinan. Fargmen terminal dari rekombinan yang terisolasi digunakan untuk meneruskan langkah kedua dalam perjalanan. Proses ini dilanjutkan sampai mencapai temoat yang diinginkan. Gen yang teregulasi pada Drosophilla melanogaster diisolasi dari kromosom berjalan. Gen ini selanjutnya digunakan sebagai model untuk mengisolasi gen homolog hewan lain. Drosophilla pekerja juga menggunakan kromosom berjalan untuk mengisolasi beberapa gen yang sangat besar (>50kb). Gen ini sering terganggu oleh intron besar ketika genomic library di screening dengan mRNA atau model cDNA, 2 atau lebih rekombinan diidemtifikasi, masing-masing berisi urutan komplementer tetapi tidak

berdekatan pada kromosom ,maupun terlibat dalam seluruh gen. Kromosom berjalan memungkinkan rekombinan yang tidak berdekatan ini terhubung, sehingga memebentuk struktur gen yang lengkap. Strategi yang sama digunakan oleh gen manusia yang sangat besar untuk cystic fibrosis dan distrofi otot.

23.8 Ekspresi protein menggunakan teknologi DNA rekombinan.

Cloning atau amplifikasi DNA dapat dimurnikan dan dipisahkan untuk membentuk RNA dan protein, atau dimasukkan kedalam organism dengan tujuan untuk mengubah fenotip mereka. Salah satu alasan teknologi rekombinan DNA memiliki pengaruh yang besar dalam biokimia karena sulitnya memurnikan dan memisahkan protein yang sangat sedikit dan menentukan urutan asam aminonya. Banyak protein yang pertama kali diketahui sebagai band dalam gel poliakrilamid atau sebagai antigen yang dikenal oleh antibody. Tidak diketahui struktur dan fungsi dari protein yang baru ditemukan. Teknologi DNA rekombinan memungkinkan protein dimurnika tanpa perlu karakterisasi lebih lanjut. Pemurnian dimulai dengan produksi protein berlebih dalam sel yang mengandung vector yang diekspresikan.

a. Vector ekspresi prokaryot.Bbrp gen eukaryote dalam vector cloning dapat disajikan di prokaryot. Kebanyakan produk gen eukaryote tidak dapat dideteksi di prokaryot kecuali gen itu diproduksidari vector ekspresi khusus. Vector ekspresi untuk host bakteri umumnya plasmid yang telah direkayasa agar mengandung zat-zat yang diperlukan dalam transkripsi dan translasi seperti promoter yang kuat, situs binding-ribosome, dan terminator transkripsi. Karena jarak antara situs binding-ribosom dan kodon inisiasi sangat penting, banyak vector mengandung situs cloning hilir inisiasi kodon. Ketika vector ini digunakan, protein diproduksi dalam jumlah yang banyak tetapi dengan sedikit residu pada N-terminus. Asam amino tambahan biasanya tidak hadir dalam studi biokimia berikutnya.Protein eukaryote dapat dibuat dari bakteri dengan memasukkan fragmen cDNA ke vector

ekspresi. Jumlah yang sangat besar pada protein yang dibutuhkan dapat dimurnikan dari sel yang ditransformasi. Dalam beberapa kasus, protein dapat digunakan untuk mengobati pasien dengan gangguan genetic. Misalnya, hormone pertumbuhan manusia, insulin dan beberapa factor pembekuan darah telah diproduksi dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan dan vector ekspresi .

Gen yang sebelumnya tidak diketahui, dapat diidentifikasi jika produk gen tersebut dapat dibuat dalam bakteri. Antibody yang mengenali protein dapat digunakan untuk

menyaring klom dari ekspresi-vektor cDNA library. Pendekatan ini sangat berguna untuk karakterisasi protein ditahap awal karena tidak perlu diketahui tentang posisi protein dalam

band poliakrilamida. Band ini dapat dihilangkan dan protein yang disuntikkan ke binatang untuk meningkatkan antibody yang nantinya digunakan untuk screening. Antibody dapat diberi label dan digunakan sebagai model untuk mengidentifikasi sel-sel rekombinan yang mengekspresikan antigen protein yang diinginkan.

b. Ekpresi protein eukaryoteSel Prokariot mungkin tidak dapat memproduksi fungsi protein dari gen eukariotik bahkan ketika semua sinyal yang dibutuhkan untuk ekspresi gen hadir karena banyak protein eukarotik harus diubah posttranlationally(contoh glycosylation). Sel Escherhia coli kekurangan beberapa enzim yang dibutuhkan untuk mengkatalisasi perubahan ini. Beberapa ekspresi vector yang berfungsi di eukariotik telah dikembangkan. Vector ini berisi replikasi eukariotik asal, gen penanda dalam pemilihan eukarot, turunan, dan region control translasi, dan tambahan fitur dibutuhkan untuk efisiensi translasi mRNA eukarotik, seperti sinyal polidenilasi dan tempat capping.

Ragi dan sel eukarotik lainnya dalam budaya adalah tuan rumah yang cocok untuk cloning gen eukariotik. Sel ini memiliki enzim yang dibutuhkan untuk menyambungkan turunan RNA primer untuk menghasilkan molekul mRNA yang matang. Untuk alasan ini, gen eukarotik dengan introns dapat diisolasi dari perpustakaan genom dan dengan langsung menyatakan pada sel ini.

Ini juga memungkinkan untuk membuat molekul DNA rekombinan yang dapat diintegrasikan ke dalam genom organism multiseluler besar, termasuk mamalia. Rekombinan seperti ini biasanya mengandung gen dibawah control promoter yang aktif dalam organism host. Jika zigot atau embrio awal berubah, mungkin tumbuh menjadi organism yang membawa DNA rekombinan dalam beberapa sel. Breeding ini dapat menghasilkan individu yang memiliki DNA rekombinan pada seluruh selnya. Individual seperti ini disebut organism transgenic karena mereka memiliki DNA asing terintegrasi secara stabil. Ilustrasi tikus transgenic yang berasal dari mencit mengandung gen hormone pertumbuhan tikus menggunakan teknologi ini.

23.9 APLIKASI TEKNOLOGI REKOMBINAN DNA

Rekayasa genetika banyak digunakan dalam bidang agrikultur, dimana perubahan gen ditujukan untuk memproduksi tanaman dengan perubahan karakteristik tertentu, seperti ketahanan terhadap hama dan penyakit, serta peningkatan kemampuan fiksasi nitrogen pada tanaman. Dalam bidang kesehatan, rekayasa genetik digunakan dalam pengembangan hewan transgenik yaitu tikus sebagai model untuk penelitian penyakit spesifik tertentu pada manusia. Manipulasi genetik seperti ini juga dapat menentukan perbedaan antara sel normal dan sel berpenyakit sehingga virulensi mikroba dapat diketahui.

A. Rekayasa Genetik pada TanamanDalam bidang biologi molekular, telah dikembangkan eksploitasi plasmid bakteri yang

disebut Ti, plasmid dari bakteri Agrobacterium tumefaciens yang membawa rangkaian yang penting dalam replikasi dan seleksi pada E.coli sehingga dapat mentransformasi berbagai macam tanaman. DNA yang telah ditransformasi dengan plasmid Ti (T-DNA) dapat digabungkan dengan vektor kompatibel E. coli untuk menghasilkan cloning vektor E. coli tertentu. Selanjutnya, DNA asing dapat disisipkan ke dalam T-DNA pada wilayah non-esensial, dan plasmid rekombinan dapat mentransform Agrobacterium tumefaciens. Ketika bakteri menginfeksi tanaman, T-DNA masuk ke dalam sel tanaman, lalu berintegrasi dengan genome tanaman inang. Sebagai contoh, gen luciferase dari kunang-kunang ditransformasikan pada tanaman tembakau menggunakan plasmid Ti. Pancaran cahaya akan muncul dari semua jaringan tanaman bila tanaman tersebut disiram dengan larutan luciferin ( substrat untuk luciferase dari kunang-kunang).

Teknologi kloning T-DNA juga telah banyak digunakan memperkenalkan beberapa gen untuk ketahanan terhadap herbisida. Resistensi herbisida dibuat dengan mengubah target enzim herbisida atau dengan memperkenalkan gen tanaman atau bakteri yang memiliki produk untuk mengkatabolisme herbisida. Sebagai contoh, strain bakteri Klebsiella pneumoniae mengandung plasmid yang mengkode nitrilase spesifik untuk herbisida bromoxynil (turunan dari benzonitril) sebagai sumber nitrogen. Mentransfer gen nitrilase pada tanaman tomat menghasilkan tanaman transgenik yang resisten terhadap herbisida. Selain itu, ketahanan terhadap serangga juga dikembangkan dengan memproduksi tanaman yang mengandung gen yang mengkode protein bakteri yang toksik pada serangga tertentu yang mengganggu tanaman tersebut.

B. Rekayasa Genetik pada ProkariotPengembangan penelitian di bidang genomik bakteri semakin banyak dilakukan akibat berkembangnya resistensi bakteri yang menyebabkan terjadinya penurunan efektivitas antibiotik. Genome bakteri yang paling pertama dipublikasikan adalah genome bakteri Haemophilus influenzae pada tahun 1995. Selama 5 tahun, lebih dari 30 rangkaian genome mikroorganisme telah diteliti. Perbandingan urutan genome dari suatu organisme yang berbeda berguna dalam memahami bagaimana perbedaan strain dari genus yang sama akan mungkin memiliki perbedaan pada virulensi atau jaringan yang terinfeksi. Penelitian genome bakteri juga dapat membantu pada pengembangan obat yang efektif untuk melawan patogen.

23.10 Aplikasi Untuk Penyakit Pada Manusia

Aplikasi utama untuk teknologi DNA rekombinan adalah untuk memproduksi protein dalam jumlah besar.

Gen atau cDNA untuk suatu protein yang diinginkan dapat diisolasi, diklon di dalam vector, dan diproduksi dalam jumlah besar untuk diteliti atau untuk pengobatan.

Contoh: insulin, interleukin, interferon, growth hormones, EPO, faktor koagulasi VIII. Suatu gen yang telah diklon juga dapat digunakan sebagai probe untuk mengidentifikasi

penyakit genetik pada manusia. Dengan teknologi DNA rekombinan, kecacatan pada gen manusia dapat diperbaiki

menggunakan gen yang telah dimodifikasi. Terapi gen menggunakan teknologi DNA rekombinan memberikan manfaat besar bagi

pengobatan penyakit genetik namun isu etika yang muncul harus diperhatikan.

23.11 Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR digunakan untuk memperbanyak DNA yang terdapat dalam jumlah kecil. Dengan PCR, tidak perlu lagi menggunakan sampel dalam jumlah besar untuk diklon atau diteliti.

Cukup mengambil sedikit sampel DNA dan diperbanyak menggunakan PCR.

Proses PCR:

Campuran yang dimasukkan kea lat PCR berisi: target DNA yang akan diperbanyak, dua primer, Taq polymerase, dan deoksiribonukleotida.

Terdapat tiga tahap:o Denaturation: Target DNA berupa DNA rantai ganda. Campuran dipanaskan sampai

sekitar 90oC untuk mengubah rantai ganda DNA menjadi rantai tunggal.o Annealing: Setelah terbentuk rantai tunggal, campuran didinginkan hingga sekitar

60oC. Pendinginan ini mengakibatkan kedua primer berikatan dengan rantai tunggal DNA pada kodon yang seusai.

o Elongation: Campuran dipanaskan lagi sampai suhu 72oC. Enzim Taq polymerase akan menggabungkan nukleotida-nukleotida pada ujung kedua primer sehingga terbentuk rantai DNA baru.

Ketiga tahap ini diulang-ulang sampai terbentuk sejumlah rantai DNA yang diinginkan.

23.12 Site-direction Mutagenesis

• Merupakan teknik yang mempunyai pengaruh yang kuat terhadap pembelajaran produk gen dan protein yang lain.

• Mutasi yang diinginkan bekerja langsung ke dalam ke dalam gen dengan sintesis dari oligonukleat.

• Ketika oligonukleat digunakan sebagai bahan primer replikasi DNA in vitro, copyan gen yang terbentuk merupakan mutasi yang diinginkan.

• Mutan gen dapat disintesis dengan sempurna dengan metode in vitro, tetapi site-directed mutagenesis ini jarang digunakan untuk produksi mutan protein.

• Site-directed mutagenesis umumnya digunakan untuk memperkenalkan single-nukleotida mutasi ke dalam gen.