disee mikroo biokim

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Maksud dan Tujuan Praktikum

1.1.1 Maksud Praktikum

Untuk mengetahui cara untuk mengindentifikasi suatu bakteri dengan

beberapa uji biokimia dan mengetahui pengaruhnya terhadap pertumbuhan

bakteri.

1.1.2 Tujuan Praktikum

a. Untuk mengidentifikasi bakteri melalui uji biokimia

b. Untuk mengetahui dan memahami cara uji biokimia dalam mengidentifikasi

bakteri

c. Untuk mengetahui pengaruh uji biokimia terhadap pertumbuhan bakteri

1.2 Prinsip Praktikum

Mengetahui cara identifikasi suatu mikroorganisme dengan menggunakan

beberapa reaksi biokimia, mengetahui bakteri yang dapat menghidrolisa

poliskarida, protein dan lemak, mengetahui fermentasi karbohidrat dari

mikroorganisme, mengetahui mikroorganisme yang dapat memproduksi H2S,

mengetahui mikroorganisme yang dapat mencairkan gelatin, mengetahui

mikroorganisme yang dapat menghasilkan enzim karalase, mengetahui

kemampuan mikroorganisme membentuk asam dari hidrolisis glukosa,

mengetahui bakteri yang memiliki enzim urease. Mengetahui jenis bakteri yang

dapat mengutilisasi sitrat, dan mengetahui mikroorganisme yang memiliki enzim

lysine dekarboxylase.

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teori Umum

Biokimia adalah studi tentang molekul dan reaksi kimia yang dikatalisis

oleh enzim yang terjadi dalam semua organisme hidup. Jutaan reaksi kimia yang

dikatalis oleh enzim berlangsung di dalam sel hidup. Reaksi-reaksi ini secara

kolektif sebagai metabolisme. Metabolisme adalah aktifitas sel yang amat

terkoordinasi, mempunyai tujuan dan mencakup berbagai kerja sama banyak

sistem multi enzim. Metabolisme mempunyai 4 fungsi spesifik yaitu 1) untuk

memperoleh energi kimia dari desradasi sari makanan yang kaya energi kimia 2)

untuk mengubah molekul nutrien menjadi prekursor unit pembangun bagi

makromolekul sel 3) menggabung unit-unit pembangun ini menjadi protein, asam

nukleat, lipid, polisakarida dan komponen sel lainnya dan 4) untuk membentuk

dan mendegradasi biomolekul yang diperlukan di dalam fungsi khusus sel.

(Sitompul, 2011)

Prinsip dasar biokimia adalah bahwa setiap aspek kehidupan melibatkan

reaksi kimia antara molekul-molekul biologis. Reaksi tersebut tunduk pada hukum

fisika dan kimia. Uji biokimia adalah teknik mendeteksi resistensi terhadap suatu

zat yang sangat esensial berdasarkan kualifikasi enzim yang bertanggung jawab

pada proses resistensi (Widiarti, 2005).

Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan mengamati hasil reaksi

biokimia yang terjadi pada bakteri, salah satu metode terbaru untuk identifikasi

pada tingkat reaksi biokimia adalah metode Biologi. Metode Biologi dirancang

untuk mengidentifikasi bakteri, jamur dan yeast berdasarkan reaksi biokimia yang

terjadi karena perbedaan sumber karbon yang terdapat di dalam gas lubang

mikroplate. Mikroplate Biologi pertama kali diperkenalkan pada tahun 1989.

(Marlina,2007)

Identifikasi Bakteri berpedoman pada buku Bargey’s Determinative

Bacteriology antara lain dengan menganalisis sifat biokimia pewarnaan gram,

produksi gas H2S, uji katalase, uji oksidase “cytachrome”, uji methyl red,

fermentasi karbohidrat (glukosa, fruktosa, sellobiosa, galaktosa dan manitol).

(Feliatra, 1999)

Bakteri adalah sel prokariotik yang khas, uniseluler dan tidak mengandung

struktur yang terbatasi membran di dalam sitoplasma. Sel-selnya secara khas

berbentuk bola seperti batang dan spiral. Bakteri yang khas berdiameter sekitar

0,58µm (Pelczar,1986).

Pertumbuhan bakteri dapat dipengaruhi beberapa factor yaitu yang

pertama, nutrisi dalam bentuk yaitu pertama, nutrisi dalam bentuk zat-zat kimiawi

meliputi karbon, nitrogen, belerang , unsure logam, vitamin dan air. Kedua suhu,

optimum yang diperlukan untuk pertumbuhan (T = t 37oC). ketiga pH optimum

yang berkisar antara 6,8-7. Keempat, oksigen (O2) meliputi aerob dan anaerob.

Kelima, zat kimia yang meliputi antiseptic, fenol dan alkohol. Keenam, cahaya

yang baik untuk pertumbuhan bakteri yaitu dalam keadaan gelap (Prasetyo, 2006).

2.2 Uji Biokimia

Berikut beberapa uji biokimia yang digunakan untuk identifikasi bakteri

antara lain:

a. Uji Methyl Red

Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri dapat membentuk

asam sedemikian banyaknya sehingga dapat menubah indikator metil merah

menjadi merah. Beberapa jenis bakteri dapat memebentuk asam tetpai tidak cukup

banyak untuk dapat mengubah indikator dan penurunan pH sampai 5,0, pada

umumnya adalah sudah menghambat kelanjutan hidup mikroorganisme.

Pengujian inijangan dilakukan sebelum biakan berumur 2 hari pada suhu 37oC

atau 3 hari pada suhu 30oC. reaksi ini tidak dapat dipercepat dengan meningkatkan

kadar glukosa dalam medium.

b. Uji Pencairan Gelatin

Medium pembiakan tegak dari gelatin nutrisi, tiogikolat gelatin medium,

dieramkan selama 7 hari pada suhu kamar, kemudian diperhatikan apakah terjadi

pencairan gelatin.

(Irianto, 2006)

c. Uji Katalase

Uji ini digunakan untuk mendeteksi adanya enzim katalase. Enzim ini terdapat

pada sel-sel yang mempunyai metabolisme aerobik. Bakteri anaerob tidak

mempunyai enzim katalase. Reagen yang digunakan sebagai pereaksi

mengandung 3% larutan hydrogen peroksida yang menghasilkan gas (oksigen).

Bakteri yang positif katalase ditandai terbentuknya gelembung udara pada kaca

objek (Marlina, 2007).

d. Uji fermentasi Karbohidrat

Substrat yang digunakan untuk tes fermentasi karbohidrat adalah glukosa,

laktosa, manitol, maltosa dan sakrosa. Uji fermentasi karbohidrat dengan substrat

glukosa dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke 50 mL

media pepton water yang mengandung 0,5 mL bromthymol blue 0,4% dan

glukosa 1% diinkubasi 24-48 jam pada temperatur 30oC. Hasil positif ditandai

dengan terbentuknya warna kuning dan tes negatif ditandai dengan terbentuknya

biru. Tes fermentasi karbohidrat dengan substrat yang digunakan adalah laktosa,

manitol, maltose, dan sukrosa.

e. Uji Tes Utilitas Citrate

Uji penggunaan sitrat dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten

merkuri ke media. Simmon’s citrate agar dan diinkubasi 24-48 jam pada

temperature 300C. reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna biru.

f. Uji Produksi H2S

Uji produksi H2S dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke

media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) selama 24-48 jampada temperature 300C.

reaksi positif ditandai dengan terbentuknya endapan hitam.

(Pratiwi, 2012)

g. Uji Tes Urease

Tes urease dilakukan dengan menginokulasi bakteri resisten merkuri ke media

padat urea christen (sigma) selama 24-48 jam pada temperature 30 oC. Tes positif

ditandai dengan terbentuknya warna merah.

Urease merupakan suatu enzim pemecah ikatan-ikatan dan nitrogen pada

senyawa amida. Senyawa amida yang dapat digunakan untuk tes urease adalah

urea. Urea dengan adanya enzim urease akan diubah menjadi karbon dioksida dan

amoniak. Keberadaan enzim dideteksi dengan berubah warna media cair urea

menjadi merah.

h. Uji Tes Lysine Dekarboxylase

Tes dekarboksilase dengan substrat DL-Lisin dilakukan dengan

menginokulasi bakteri resisten merkuri ke media Decarboxylase Broth Base

Moeller (sigma) yang mengandung DL-lisin 2% dan diatur pH 8 dengan

penambahan NaOH 0,1 N selanjutnya diinkubasi selama 24-48 jam pada

temperatur 30oC. Tes positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu. Hal yang

sama juga dilakukan untuk tes dekarboksilase dengan substrat DL-arginin dan

DL-ornithin dengan konsentrasi 2%.

i. Uji Hidrolisa Polisakarida, Protein dan Lemak

Uji hidrolisis polisakarida bertujuan untuk mengetahuiapakah suatu bakteri

mampu menghasilkan polisakarida menjadi monosakarida.uji ini menggunakan

medium starch agar dengan menggunakan iod sebagai indicator. Ketika medium

ditetesi dengan iod maka akan membentuk kompleks biru sampai coklat, namun

jika bakteri tersebut memiliki enzim hydrolase maka akan terbentuk zona bening.

(Nofiani, 2009)

2.3 Uraian Bakteri

2.3.1. Escherchia coli

a. Klasifikasi

Phylum: Protophyta, Kelas: Schizomycetes, Ordo: Eubacteriales, Family:

Enterobacteriaceae, Genus: Escherchia, Spesies: Escherchia coli.

b. Morfologi

Bakteri ini berbentuk batang, gram negatif, fakultatif aerob, tumbuh baik pada

media sederhana. Dapat melakukan fermentasi laktosa dan fermentasi glukosa,

serta menghassilkan gas.

c. Penyebab penyakit

Escherchia coli merupakan flora normal di dalam usus manusia dan akan

menimbulkan penyakit bila masuk ke dalam organ atau jaringan lain. Escherchia

coli merupakan penyebab utama meningitis pada bayi yang baru lahir dan

penyebab penyakit infeksi tractus urinarius (pyelonephritis/cystisis) pada manusia

yang dirawat di rumah sakit. Stran (jenis) tertentu dapat menyebabkan diarrhea

pada anak.

2.3.2. Staphylococcus aureus

a. Klasifikasi

Phylum: protopyta, Kelas: schizomycetes, Ordo: eubacteriales, Family:

micrococcaceae, Genus: Staphylococcus, Spesies: Staphylococcus aureus.

b. Morfologi

Bentuk coccus, gram positif, formasi staphylae, menegluarkan endotoxin tidak

bergerak, tidak mapu membentuk spora, fakultatif anaerob, sangat tahan terhadap

pengeringan, mati pada suhu 6 setelah 60 menit, merupakan flora normal pada

kulit dan saluran pernapasan bagian atas. Pada pemeriksaan padat koloninya

berwarna emas. Di dalam terdapat pada tanah, air dan debu di udara.


Menimbulkan infeksi bernanah dan abses. Infeksi akan lebih berat bila

menyerang anak-anak, usia lanjut dan orang yang daya tahan tubuhnya menurun,

seperti penderita diabetes mellitus, luka bakar dan AIDS. Selain itu dapat

menyebabkan penyakit seperti infeksi pada felikel rambut, dan kelenjar keringat,

bisul, infeksi pada luka, meningitis, endocarditis, pneumonia, pyelonephritis,

osteoroyolitis.

2.3.3. Salmonella thyphosa

a. Klasifikasi


enterobacteriaceae, Genus: Salmonella, Spesies: Salmonella typhosa.

b. Morfologi

Bentuk batang, gram negatif, fakultatif aerob, bergerak dengan flagel

penitriah, mudah tumbuh pada pembenihan biasa dan tumbuh baik pada

pembenihan yang mengandung empedu. Di alam bebas Salmonella typhi dapat

tahan hidup lama dalam air, tanah atau pada bahan makanan. Dalam fese di luar

tubuh manusia tahan hidup 1-2 bulan. Dalam air susu dapat berkembang biak dan

hidup lebih lama sehingga sering merupakan batu loncatan untuk penularan

penyakitnya.

c. Penyebab penyakitnya

Pada manusia menimbulkan penyakit typhus abdominalis. Masa inkubasinya

antara 7-14 hari. Gejalanya berupa: demam dengan suhu tinggi 40 oC. Terutama

sore hari, sering kali meracau dan gelisah. Penderita sangat lemah dan apatis,

anorexia, tetapi umumnya mengalami konstipasi (tidak bisa buang air besar).

2.3.4. Bacillus subtilis

a. Klasifikasi


bacillaceae, Genus: Bacillus, Spesies: Bacillus subtillis.

b. Morfologi

Bentuk batang, gram positif, menghasilkan exotoxin, tidak bergerak,

mempunyai kapsul, mampu membentuk spora, biasanya menyusun diri berupa

rantai yang panjang. Bakteri ini hidup sebagai parasite pada ternak, kuda,

kambing, biri-biri dan burung unta. Bentuk spora bertahan lama (beberapa tahun),

pda kulit dan bulu binatang, wol dan tanah hewan.


Bakteri ini menggunakan sumber N dan C untuk energi pertumbuhan. Spora

resiten terhadap perubahan lingkungan. Bacillus subtillis menyebabkan penyakit

pada manusiadengan fungsi imun terganggu, misalnya meningitis dan

gastroenteritis akut (Absor, 2006).

2.4. Uraian medium

2.4.1. Lysine Iron Agar

Uji agar ini diperkenalkan oleh Edward dan fite (1961) untuk deteksi

simultan dekarboksilase lisin (LDC) dan hidrogen sulfide (H2S) untuk

mengidentifikasi Enterobactericeae terutama Salmonella dan Arizona.

Jonson (1996) dan Timms (1971) memperoleh hasil yang baik dengan

lysine iron agar. Identifikasi ditingkatkan dengan menggunakan medium ini dalam

kombinasi dengan Iron Tripler Sliger Agar (MERCK No. 3915) (THATCHER

and CLARK, 1968).

Komposisi: pepton daging 5,0; ekstrak ragi 3,0; D(+) glukosa 1,0; lysine

monohidroklorida 10,0; natrium tiosulfat 0,04; amonium besi (III) sitrat 0,5;

bromocresol ungu 0,02; agar-agar 12,5.

2.4.2. Methyl Red

Tes kultur media untuk methyl red (CLARK dan LUBS tes VOBES

DROSKAUER (1989) yang digunakan untuk diferensial biokimia terutama dalam

kelompok Coll-Aerogenes. Komposisi: pepton daging 7,0 ; D (+) glukosa 5,0 ; di-

kalium hydrogen fosfat 5,0.

2.4.3. Milk Agar

Untuk menentukan jumlah bakteri aerobic susu, produk susu, air, es krim

dan bahan lainnya. Medium kultur ini sesuai dengan rekomendasi dari

EUROGLACE (MEE, lembaga industry es krim) yang disampaikan ke komisi

MEE untuk pemeriksaan es krim (ICLOSE 1968). Komposisi pepton daging 5.0 ;

ekstrak ragi 3.0 ; susu bubuk 7.0 ; agar-agar 12.0

2.4.4. Kliger Iron Agar

Tes kultur media yang diusulkan oleh kliger (1917) untuk

mengidentifikasi bakteri grm negative usus. Kliger iron agar dapat dimodifikasi

seperti yang diusulkan oleh Bader dan Hotz (1951) dengan menambahkan urea

0.2% untuk memberikan iron urea agar.

Komposisi pepton kasein 15.0 ; pepton daging 5.0 ; ekstrak daging 3.0 ;

ekstrak ragi 3.0 ; natrium klorida 5.0 ; laktosa 10.0 ; D (+) glukosa 7.0 ; besi

amonium (III) sitrat 0.5 ; sodium tiosulfat 0.5 ; fenol merah 0.024 ; agar-agar

12.0.

2.4.5. Nutrient Agar

Kultur media umum yang untuk perkembang biakan mikroorgansme yang

kurang tepat. Sesuai acua American Public Associatin (1971). Komposisi: pepton

daging 5.0 ; ekstrak daging 3.0 ; agar-agar 12.0.

2.4.6. Gelatin

Untuk menentukan jumlah bakteri dalam air dengan konsentrasi rendah.

Komposisi: ekstrak daging 10.0; pepton daging 10.0; sodium klorida 5.0 ; gelatin

12.0.

2.4.7. Manitol

Seleksi agar diperkenalkan oleh PITZSCH (1967) untuk isolasi

Proteusterutama dari daging dan produk daging.

Komposisi: pepton daging 10.0; ekstrak daging 7.0; sodium klorida 3.0;

di-natrium hidrogen fosfat 2,0; D(-) manitol 15,0; air biru 0,625; metacrome

kuning 1,875.

2.4.8. Simmon’s Citrate Agar

Uji agar sintetik yang diusulkan oleh simmons (1926) untuk

mengidentifikasi mikroorganisme 9terutama enterobacteriaceae dan jamur

tertentu) atas dasar metabolism sitrat, sitrat sebagai sumber karbohidrat satunya.

Kultur media ini sesuai dengan acuan dan American Public Health

Association (1975) untuk pemeriksaan air. Bila dibandingkan dengan koser

Citrate Broth , media padat ini memiliki keuntungan berupa kekeruhan akibat

pertumbuhan mikroba tidak digunakan sebagai cirri-ciri identifikasi.

Komposisi: pepton daging 1,0; D (+) glukosa 1,0; natrium klorida 5,0; di-

kalium hidrogen fosfat 2,0; fenol merah 0,012; agar-agar 12,0; juga ditambahkan

urea 20,0.

BAB III

METODE KERJA

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

a. Autoklaf

b. Batang pengaduk

c. Cawan petri

d. Drigalsky

e. Freezer

f. Hot plate

g. Inkubator

h. Jarum ose bulat

i. Jarum ose lurus

j. Labu Erlenmeyer

k. Laminar Air Flow (LAF)

l. Object glass

m. Pembakar spiritus

n. Pipet tetes

o. Pipet volume

p. Pro pipet

q. Rak tabung

r. Sendok tanduk

s. Spatula

t. Spoid

u. Tabung durham

v. Tabung reaksi

w. Timbangan digital

3.1.2 Bahan

a. Alumunium foil

b. Aquades

c. H2O2 3%

d. Kapas

e. Medium

1) Nutrient Agar (Agar, pepton, ekstrak daging)

2) Kliger Iron Agar (KIA)

3) Lysine Iron Agar (LIA)

4) Manitol

5) Methyl red

6) Gelatin

7) Simmons Citrate Agar (SCA)

8) Urea agar

9) Milk agar

f Sampel

1) Air got

2) Air sumur

3) Air sungai karang mumus

4) Air sungai mahakam

5) Tanah sampah

g. Bakteri

1) Bacillus subtillis

2) Esherichia coli

3) Salmonella thyposa

4) Staphylococcus aureus

3.2 Cara Kerja

3.2.1 Pembuatan Medium

a. Nutrient Agar (NA)

1) Ditimbang ekstrak daging 0,3 gram, pepton 0,5 gram, dan agar 1,5 gram

2) Dimasukkan bahan ke dalam labu Erlenmeyer

3) Ditambahkan aquades hingga 100 mL dan dihomogenkan

4) Dipanaskan dengan hot plate hingga mendidih

5) Didinginkan dan labu erlenmeyer ditutup dengan kaps dan alumunium foil

6) Disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 1210 C selama 15 menit dan tekanan

2 atm

b. Milk Agar

1) Ditimbang Milk Agar instan sebanyak 1,2 gram




5) Didinginkan dan labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil


2 atm

c. Manitol

1) Ditimbang Manitol instan sebanyak 10,8 gram





6) Disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 1210 C selama 15 menit dan

tekanan2 atm

d. Kliger Iron Agar (KIA)

1) Ditimbang Kliger Iron Agar instan sebanyak 2,25 gram






2

atm

e. Gelatin

1) Ditimbang Gelatin sebanyak 7,5 gram


3) Ditambahkan aquades hingga 50 mL

4) Dihomogenkan dengan cara diaduk menggunakan batang pengaduk

5) Ditutup labu erlenmeyer dengan kapas dan alumunium foil


2

atm

f. Methyl Red

1) Ditimbang Methyl Red instan sebanyak 1,7 gram


3) Ditambahkan aquades hingga 100 mL

4) Dihomogenkan dengan cara diaduk menggunakan batang pengaduk

5) Ditutup labu erlenmeyer dengan kapas dan alumunium foil


2

atm

g. Urea Agar

1) Ditimbang Urea Agar instan sebanyak 2,5 gram

2) Dimasukkan bahan ke dalam labu erlenmeyer





2

atm

h. Simmons Citrate Agar (SCA)

1) Ditimbang Simmons Citrate Agar instan sebanyak 2,3 gram






2

atm

i. Pembuatan larutan H2O2 3 %

1) Dambil larutan H2O2 50 % sebanyak 0,6 mL

2) Dimasukkan dalam labu takar 10 mL

3) Ditambahkan aquades hingga tanda batas

4) Dihomogenkan larutan

j. Lysine Iron Agar (LIA)

1) Ditimbang Lysin Iron Agar instan sebanyak 3,4 gram






2 atm

3.2.2 Pembuatan Kultur Sampel

a. Tanah sampah (Metode sebar)

1) Disiapkan sampel tanah sampah

2) Disiapkan cawan petri yang telah disterilisasi

3) Dimasukkan medium NA sebanyak 10 mL dengan menggunakan spoid

4) Ditunggu hingga medium Na memadat

5) Disebarkan sampel tanah sampah dengan menggunakan spatula

6) Ditutup cawan petri dan dibungkus

7) Diinkubasi sampel dalam keadaan steril

8) Diletakkan dalam inkubator dengan suhu 370 C selama 1x24 jam

b. Air Sungai Mahakam (Metode tuang)

1) Disiapkan sampel air sungai mahakam

2) Disiapkan cawan petri yang telah disterilisasi

3) Dimasukkan sampel dengan menggunakan spoid sebanyak 2 mL


5) Dihomogenkan sampel dan medium





c. Air Sungai Karang Mumus ( Metode tuang)

1) Disiapkan sampel air sungai karang mumus

2) Disiapkan cawan petri yang telah disterilisasi sebelumnya








d. Air Sumur (Metode tuang)

1) Disiapkan sampel air sumur









e. Air Got (Metode tuang)

1) Disiapkan sampel air got







8) Diisolasi sampel dalam keadaan steril


3.2.3 Pembuatan Biakan Sampel

a. Disiapkan sampel yang sudah di isolasi di dalam cawan petri

b. Dimasukkan medium NA ke dalam tabung reaksi, dibuat agar miring dan

ditunggu

hingga medium memadat

c. Diambil sampel pada cawan petri dengan jarum ose bulat lalu digoreskan

secara

zigzag pada medium di dalam tabung reaksi

d. Ditutup tabung reaksi dengan kapas dan diinkubasi didalam inkubator selama

1x24

jam dengan suhu 370 C

3.2.4 Pembuatan Biakan Bakteri

a. Esherichia coli

1) Disiapkan biakkan murni Esherichia coli

2) Disiapkan tabung reaksi yang telah berisi medium agar miring

3) Digoreskan secara zigzag dengan ose bulat steril pada biakkan murni kemudian

digoreskan pada tabung reaksi yang berisi medium agar miring

4) Ditutup tabung reaksi dengan kapas dan alumunium foil

5) Dilakukan seluruh pengerjaan pada LAF

6) Diletakkan tabung reaksi pada incubator dengan suhu 370 C selama 1x24 jam

b. Bacillus subtillis

1) Disiapkan biakkan murni Bacillus subtillis







c. Staphylococcus aureus

1) Disiapkan biakkan murni Staphylococcus aureus







d. Salmonella thyposa

1) Disiapkan biakkan murni Salmonella thyposa







3.2.5 Prosedur Uji Biokimia

a. Uji Hidrolisis Polisakarida, Protein, dan Lemak

1) Disiapkan 3 cawan petri yang berisi medium Milk Agar

2) Dibagi atau ditandai menjadi dua bagian setiap cawan petri, lalu sampel dan

biakkan bakteri digoreskan secara zigzag dengan ose bulat steril pada medium

3) Ditutup cawan petri dan dibungkus dengan kertas

4) Diinkubasi dalam incubator selama 2x24 jam pada suhu 370 C

5) Diamati reaksi positif bila terdapat daerah bening disekeliling biakan pada

cawan

petri

b. Uji Katalase

1) Ditetesi larutan H2O2 3% (2-3 tetes) pada object glass

2) Diambil biakan menggunakan ose bulat secara steril (E. coli, S.aureus, dan 3

sampel)

3) Diamati bila reaksi positif terdapat gelembung O2

c. Uji Methyl Red

1) Disiapkan 6 tabung reaksi berisi medium Methyl red dan tabung durham

didalamnya

2) Ditanamkan biakkan pada medium ( 1 biakkan bakteri E.coli, 4 sampel dan 1

kontrol)

3) Diinkubasi biakkan selama 5-7 x 24 jam dengan suhu optimum 370 C

4) Diamati bila reaksi positif bila warna medium menjadi warna kuning

dibandingkan dengan control

d. Uji Fermentasi Karbohidrat

1) Disiapkan 8 tabung reaksi dan diisi dengan medium manitol sebanyak 5 mL

2) Dimiringkan 100 dan ditunggu hingga padat

3) Dogoreskan biakkan/sampel menggunakan ose bulat pada tabung reaksi (3

bakteri,

4 sampel, dan 1 kontrol)

4) Diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 370 C

5) Dimati bila reaksi positif terjadi perubahan warna medium menjadi bening

dibandingkan kontrol

e. Uji Produksi H2S

1) Disiapkan 7 tabung reaksi, diisi dengan medium KIA, diletakkan di rak tabung

dan

di tunggu hingga memadat

2) Ditusuk biakkan/sampel menggunakan ose lurus pada tabung reaksi (4 sampel,

3

bakteri dan 1 kontrol)


4) Diamati bila reaksi positif terdapat warna hitam disepanjang tusukan pada

medium

dibandingkan dengan kontrol

f. Uji Pencairan Gelatin

1) Disiapkan 7 tabunng nreaksi dan dimasukkan medium gelatin

2) Ditanamkan biakkan/sampel uji dengan ose bulat pada tabung yang berisi

medium

cair gelatin (4 sampel, 2 biakkan dan 1 kontrol)


4) Dimasukkan ke dalam freezer selama 10-15 menit sampai 1x24 jam

5) Diamati bila reaksi positif medium gelatin menjadi cair dibandingkan dengan

kontrol

g. Uji Tes Urease

1) Disiapakan 7 tabung reaksi dan dimasukkan medium urea agar

2) Ditunggu hingga medium memadat

3) Ditusuk biakkan/sampel uji dengan ose lurus pada medium di tabung reaksi (4

sampel, 2bakteri dan 1 kontrol)

4) Diinkubasi 24 jam pada suhu 370 C

5) Diamati bila reaksi positif terjadi perubahan warna menjadi merah dan

dibandingkan dengan kontrol

h.Uji Tes Utilisasi Citrate

1) Disipakan 7 tabung reaksi dan dimasukkan medium SCA, lalu dimiringkan 100,

dan dibiarkan hingga memadat

2) Ditanamkan biakkan sampel/bakteri dengan ose bulat (zigzag) pada tabung

reaksi

(4 sampel, 2 bakteri, dan 1 kontrol)


4) Diamati bila reaksi positif terjadi perubahan warna medium menjadi warna biru

tua/ biru gelap dibandingankan dengan kontrol

i. Uji Tes Lysine Decarboxylase

1) Disipakan 7 tabung reaksi dan dimasukkan medium LIA

2) Ditunggu hingga memadat

3) Ditanamkan biakkan sampel/bakteri dengan ose lurus pada tabung reaksi (4

sampel, 2 bakteri, dan 1 kontrol)


5) Diamati bila reaksi positif bila ada tusukan violet di dalam medium

BAB IVHASIL PENGAMATAN

4.1 Tabel Pengamatan

4.1.1 Warna medium

No Nama Medium Warna Medium

.Awal Sterilisasi Padat + Sterilisasi

1. Lysine Iron Agar (LIA) Deep Red Deep Red Violet

2. Kliger Iron Agar (KIA) Red Red Red

3. Simmons Citrate Agar (SCA)Deep

Green

Deep

GreenDeep Green

4. Mannitol Red Red Red

5. Milk Agar Yellow Yellow Yellow

6. Urea Agar Yellow Orange Orange

7. Methyl Red Yellow Yellow Deep Yellow

8. Gelatin Yellow Yellow Yellow

9. Nutrient Agar Yellow Yellow Yellow

4.1.2 Hidrolisa Polisakarida, protein, dan lemak

No. Bakteri / sampel HasilKeterangan

Awal Akhir

1. Bacillus subtilis - Kuning Tidak Ada Zona Bening

2. Escherichia coli - Kuning Tidak Ada Zona Bening

3. Air Sumur - Kuning Tidak Ada Zona Bening

4. Air Sungai Karang Mumus - Kuning Tidak Ada Zona Bening

5. Tanah Sampah - Kuning Tidak Ada Zona Bening

Positif (+) : Adanya daerah bening di sekeliling biakan pada cawan petri

menunjukkan bakteri dan sampel mampu menghidrolisis polisakarida, protein,

dan lemak.

4.1.3 Fermentasi Karbohidrat

a) Kelompok 2


Awal Akhir

1. Bacillus subtilis + Merah Jingga

2. Escheriachia coli + Merah Kuning (Butt)

3. Air Sumur + Merah Kuning (Butt)

4. Air Sungai Karang Mumus + Merah Kuning (Butt)

5. Tanah Sampah + Merah Kuning (Butt)

6. Kontrol - Merah Merah

b) Kelompok 6


Awal Akhir

1. Bacillus subtilis + Merah Kuning

2. Escherichia coli + Merah Kuning

3. Air Sumur + Merah Kuning

4. Air Sungai Karang Mumus + Merah Kuning

5. Tanah Sampah + Merah Kuning


Positif (+) : Perubahan warna medium menjadi bening/kuning, menunjukkan

bakteri dan sampel mampu memfermentasikan karbohidrat.

4.1.4 Uji Produksi H2S


Awal Akhir

1. Escherichia coli + Merah Hitam (slant surface)

Kuning (butt)

2. Salmonella thyposa + Merah Merah (slant surface)

Kuning (butt)

3. Air Sumur + Merah Hitam (slant surface)

Kuning (butt)

4. Air Sungai Karang Mumus + Merah Hitam (slant surface)

Kuning (butt)

5. Tanah Sampah + Merah Hitam (slant surface)

Kuning (butt)


Positif (+) : Perubahan warna terdapat warna hitam di sepanjang tusukan pada

medium dan dibandingkan dengan kontrol menunjukkan bakteri dan sampel

mampu mengahasilkan H2S.

4.1.5 Pencairan Gelatin

No

.Bakteri / sampel Hasil

Keterangan

Awal Akhir

1. Bacillus subtilis - Cair Beku

2. Escherichia coli - Cair Beku

3. Air Sumur - Cair Beku

4. Air Sungai Karang Mumus - Cair Beku

5. Tanah Sampah - Cair Beku

6. Kontrol - Cair Beku

Positif (+) : Perubahan medium gelatin menjadi cair dan dibandingkan dengan

kontrol, menunjukkan bakteri dan sampel memiliki enzim gelatinase.

4.1.6 Uji Katalase

No.Nama

Medium

Kelompo

kHasil

Keterangan

Awal Akhir

1. Escherichia coli 1 + tidak ada

gelembung

O2

Ada Gelembung

O2

(Sedikit)

2 + tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Sedikit)

3 + tidak ada

gelembung

Ada gelembung

O2

O2 (Sedikit)

4 + tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Sedikit)

5 + tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Sedikit)

6 + tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Sedikit)

2. Staphylococcus

aureus 1 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

2 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

3 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

4 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

5 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

6 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

3. Air Sumur 1 + tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Sedikit)

2 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Sedikit)

3 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Sedikit)

4 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Sedikit)

5 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Sedikit)

6 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Sedikit)

4.. Air Sungai Karang

Mumus 1 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

2 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

3 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

4 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

5 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Sedikit)

6 + tidak ada Ada gelembung

gelembung

O2

O2

(Banyak)

5. Tanah Sampah

1 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

2 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

3 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

4 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

5 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

6 +

tidak ada

gelembung

O2

Ada gelembung

O2

(Banyak)

Positif (+): Jika terdapat gelembung menunjukkan bakteri dan sampel memilki

enzim katalase.

4.1.7 Uji Methyl Red


GelembungAwal Akhir

1. Escherichia coli + Jingga kuning, ↓ putih +++

2. Streptococcus mutans + Jingga kuning, ↓ putih +

3. Air Sumur + Jingga kuning, ↓ putih ++

4. Air Sungai Karang + Jingga kuning, ↓ putih ++

Mumus

5. Tanah Sampah + Jingga kuning, ↓ putih ++

6. Kontrol - Jingga jingga -

Positif (+) : Perubahan warna medium menjadi warna merah.

4.1.8 Tes Urease

a) Kelompok 1


Awal Akhir

1. Bacillus subtilis + Jingga Merah (slant surface)

2. Escherichia coli + Jingga Merah (slant surface)

3. Air Sumur + Jingga Merah (slant surface)

4. Air Sungai Karang Mumus + Jingga Merah (slant surface)

5. Tanah Sampah + Jingga Merah (slant surface)

6. Kontrol - Jingga Jingga

b) Kelompok 2


Awal Akhir

1. Bacillus subtilis + Jingga Merah (slant surface)

2. Escherichia coli + Jingga Merah (slant surface)

3. Air Sumur + Jingga Merah (slant surface)

4. Air Sungai Karang Mumus + Jingga Merah (slant surface)

5. Tanah sampah + Jingga Merah (slant surface)

6. Kontrol - Jingga Jingga

Positif (+) : Perubahan warna dari warna awal menjadi warna merah dibanding

kontrol, menunjukkan bakteri dan sampel memiliki enzim urease.

4.1.9 Tes Lysine Decarboxylase

a) Kelompok 3

No. Bakteri / sampel Hasil Keterangan

Awal Akhir

1. Escherichia coli + Violet Violet (butt)

2. Salmonella thyposa+ Violet

Violet (Slant surface)

Yellow (butt)

3. Air Sumur + Violet Violet (butt)

4. Air Sungai Karang Mumus + Violet Violet (butt)

5. Tanah sampah+ Violet


Yellow (butt)

6. Kontrol - Violet Violet

b) Kelompok 4


Awal Akhir

1. Escherichia coli + Violet Violet (butt)

2. Salmonella thyposa+ Violet


Yellow (butt)

3. Air Sumur+ Violet


Yellow (butt)

4. Air Sungai Karang Mumus + Violet Violet (butt)

5. Tanah Sampah+ Violet


Yellow (butt)

6. Kontrol - Violet Violet

Positif (+) : Warna violet (ungu tua) pada permukaan medium dan warna kuning

pada tusukan.

4.1.10 Tes Utilisasi Citrate

a) Kelompok 5


Awal Akhir

1. Staphyllococcus aureus + Hijau Biru

2. Escherichia coli + Hijau Biru

3. Air Sumur + Hijau Biru

4. Air Sungai Karang Mumus + Hijau Biru

5. Tanah sampah + Hijau Biru

6. Kontrol - Hijau Hijau

b) Kelompok 6


Awal Akhir

1. Staphyllococcus aureus + Hijau Biru

2. Escheriachia coli + Hijau Biru

3. Air Sumur + Hijau Biru

4. Air Sungai Karang Mumus + Hijau Biru

5. Tanah Sampah + Hijau Biru

7. Kontrol - Hijau Biru

Positif (+) : Perubahan warna medium menjadi warna biru tua/biru gelap dan

dibanding dengan kontrol, menunjukkan bakteri dan sampel mampu

menggunakan sitrat sebagai sumber energi.

4.2 Perhitungan

4.2.1 Gelatin

Instan = 15 % atau 15 gram / 100 mL → dibuat 50 mL

Gelatin = 151000

x 50 = 7,5 gram

Jadi, dibutuhkan gelatin instan sebanyak 7,5 gram untuk membuat 50 mL medium gelatin.

4.2.2 Kligler Iron Agar (KIA)

Instan = 55 g / 1 L → dibuat 50 mL

KIA = 551000

x 50 = 2,75 gram

Jadi, dibutuhkan KIA instan sebanyak 2,75 gram untuk membuat 50 mL medium KIA.

4.2.3 Larutan H2O2 3%

Stok = 50 % → dibuat 10 mL

Larutan H2O2 50 % = = 3 %50 %

x 10 = 0,6 mL

Jadi, dibutuhkan 0,6 mL larutan H2O2 50 % untuk membuat larutan H2O2 3 %

sebanyak 10 mL.

4.2.4 Lysine Iron Agar (LIA)


LIA = 341000

x 100 = 3,4 gram

Jadi, dibutuhkan LIA instan sebanyak 3,4 gram untuk membuat 100 ml medium

LIA.

4.2.5 Mannitol


Mannitol =1081000

x 100 = 10,8 gram

Jadi, dibutuhkan Mannitol instan sebanyak 10,8 gram untuk membuat 100 mL

medium Mannitol.

4.2.6 Methyl Red


Methyl Red = 171000

x 100 = 1,7 gram

Jadi, dibutuhkan Methyl Red instan sebanyak 1,7 gram untuk membuat 100 mL

medium Methyl Red.

4.2.7 Milk Agar


Milk Agar = 241000

x 100 = 1,2 gram

Jadi, dibutuhkan Milk Agar instan sebanyak 1,2 gram untuk membuat 50 mL

medium Milk Agar.

4.2.8 Nutrient Agar (NA)

Komposisi :Ekstrak daging = 3 g / 1L

Pepton = 5 g / 1L dibuat 250 mL

Agar = 15 g / 1L

Ekstrak Agar = 31000

x 250 = 0,75 gram

Pepton = 51000

x 250 = 1,25 gram

Agar = 151000

x 250 = 3,75 gram

Jadi, dibutuhkan 0,75 gram ekstrak daging 1,25 gram pepton dan 3,75 gram agar

untuk membuat 250 mL medium NA.

4.2.9 Simmons Citrate Agar (SCA)


SCA =231000

x 100 = 2,3 gram

Jadi, dibutuhkan SCA instan sebanyak 2,3 gram untuk membuat 100 mL medium

SCA.

4.2.10 Urea Agar

Instan = 2,4 g / 1 L → dibuat 100 mL

Urea Agar = 2 ,495

x 100 = 2,53 gram

Jadi, dibutuhkan Urea Agar instan sebanyak 2,53 gram untuk membuat 100 mL

medium Urea Agar.

BAB VPEMBAHASAN

Biokimia merupakan ilmu yang mempelajari tentang senyawa-senyawa

yang ada dalam sistem hidup, penyusun senyawa-senyawa tersebut ke dalam sel-

sel dan interaksi kimia yang terjadi sel-sel pada makhluk hidup tersusun dari

biomolekul untuk dapat mempertahankan hidup sel-sel mengalami metabolisme

sel menyerap energy dan makanan atau nutrisinya. Energi ini digunakan untuk

membentuk biomolekul penyusun sel.

Karakterisasi dan klasifikasi sebagian besar mikroba seperti bakteri

berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada

beberapa tipe media. Memproduksi tipe metabolit tertentu yang dideteksi dengan

interaksi mikroba dengan reagent test yang menghasilkan warna reagent. Reaksi

dalam sel akan teridentifikasi dengan melakukan pengujian-pengujian tertentu. Sel

akan member respon sesuai dengan kemampuan yang dimilikinya, misalnya

menghasilkan enzim katalase, enzim gelatinase atau kemampuan untuk

menghidrolisis lemak.

Sampel yang digunakan pada percobaan ini antara lain adalah air sumur,

air sungai karang mumus, dan tanah sampah. Sampel-sampel tersebut terlebih

dahulu dibuat kulturnya dengan medium nutrient agar (NA), sedangkan bakteri

yang digunakan antara lain adalah Escherchia coli, Salmonella thyposa, Bacillus

subtilis dan Staphlococcus aureus.

Staphylococcus aureus mempunyai bentuk yang bulat mangenyerupai

bentuk buah anggur yang tersusun rapi dan tidak beraturan, memiliki diameter

kira – kira 1,5 Nm, merupakan bakteri gram positif dan tidak aktifmelakukan

pergerakan. Bakteri ini mudah tumbuh dalam berbagai macam media,

bermetabolisme aktif dengan menghasilkan pigmen dari yang berwarna putih

sampai kuning tua. Staphylococcus bersifat pathogen dan menyebabkan berbagai

macam penyakit. Bakteri ini mampu menghemolisis darah agar, katalase oksidase

positif dan negative, dapat tumbuh pada suhu sekitar 15 – 45oC.

Streptococcus mutans adalah salah satu jenis dari bakteri yang mendapat

perhatian khusus, karena kemampuannya dalam proses pembentukan plak dan

karies gigi. Bakteri ini pertama kali diisolasi dari plak gigi oleh Clark pada tahun

1924 yang memiliki kecenderungan berbentuk coccus dengan formasi rantai

panjang apabila ditanam pada medium yang diperkaya seperti pada Brain Heart

Infusion (BHI) Broth, sedangkan bila ditanam di media agar memperlihatkan

rantai pendek dengan bentuk sel tidak beraturan.

Bacillus subtilis berbentuk batang lurus, dengan panjang tumbuh 0,5–2,5 x

1,2–10 Nm. Bakteri ini sering tersusun berpasangan atau membentuk rantai,

membulat atau melingkar. Bacillus subtilis termasuk dalam bakteri Gram positif

dan mampu bergerak dengan flagella. Bersifat aerobic dengan kemampuannya

yang beragam terhadap panas, pH dankadar garam. Bakteri ini tumbuh dengan

baik pada suhu antara 25-35oC. Bakteri ini biasanya ditemukan pada tanah dan

mampu menghasilkan enzim protease yaitu enzim proteolitik yang mengkatalisis

pemutusan ikatan peptide pada protein akan menimbulkan penyakit bila masuk

kedalam organ ataupun jaringan lainnya. Bakteri ini bersifat anaerob fakultatif.

Escherichia coli adalah flora normal di dalam usus manusia dapat

menghasilkan ATP secara respirasi aerobic jika terdapat oksigen, tetapi juga

mampunmelakukan fermentasi tanpa oksigen. Bakteri ini merupakan bakteri

pathogen yang banyak ditemukan pada saluran pencernaan manusia. Bentuk dai

bekteri ini adalah seperti batang dengan ukuran 1,1–1,5 Nm x 2,0–6,0 Nm,

tumbuh dengan mudah pada medium nutrient sederhana pada rentang suhu 20-40 oC dan suhu optimum adalah 37 oC.

Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari

interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia.

Kemampuan bakteri menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan

sumber energi yang didapat digunakan untuk diidentifikasi. Identifikasi bakteri

dapat dilakukan dengan beberapa uji produsi H2S, uji pencairan gelatin, uji

katalase, uji methyl red, uji tes urease, uji tes lysine decarboxylase dan uji utilisasi

sitrate.

Nutrient agar (NA) adalah medium umum yang digunakan untuk isolasi

bakteri atau mikroorganisme. Nutrient agar memiliki komposisi berupa pepton

sebagai sumber nitrogen, agar untuk memedatkan medium serta, ekstrak daging

sebagai sumbernutrisi lainnya. Hampir seluruh bakteri dapat tumbuh dalam

medium nutrien agar oleh karena itu nutrien agar disebut sebagai medium umum.

Nutrien agar memang merupakan medium khusus untuk bakteri, namun

adakalanya jika pengujian kurang steril akan tumbuh jamur sebab air merupakan

faktor pertumbuhan utama untuk jamur.

Kliger Iron Agar (KIA) adalah medium yang digunakan untuk pegujian H2S.

Medium ini juga merupakan medium kultur terbaik untuk mengidentifikasi

bakteri gram negatif yang berkaitan dengan usus. Komposisi dari KIA adalah

pepton dari kasain, pepton dari daging, ekstrak daging, ekstrak ragi, sodium

klorida, laktosa, glikosa, magnesium besi (III) sitrat, sodium tiosulfat, fenol merah

dan agar. Medium ini memiliki warna awal merah dan tertap merah saat dalam

penyimpanannya. Sehinnga uji positifnya adalahsaat medium berubah warna

kunng.

Lysine Iron Agar (LIA) adalah merupakan medium yang digunakan untuk

pengujian tes lysine decarboxylase. Medium LIA memiliki komposisi yaitu

pepton dari daging, ekstrak ragi, D(+) glukosa, lysine monihidra, sodium tiosulfat,

ammonium besi (III) sulfat, bromocreso ungu dan agar. Medium LIA memiliki

warna awal merah dan pada saat dalam keadaan akan berubah menjadi warna

violet. Cara pembuatan medium LIA sama seperti medium padat lainnya yaitu

dilarutkan didalam aquadest lalu dipanaskan hingga mendidih dan dapat

disterilisasi setelah itu baru disimpan.

Simmons Citrate Agar (SCA) adalah medium selektif untik uji tes utilisasi

sitrat. SCA memiliki komposisiyaitu ammonium dehidrogen phosfat, di-potasium

hidrogen hosfat, sodium klorida, sodium sitrat, magnesium sulfat, bromtymel biru

dan agar. Medium ini memiliki warna awal deep green dan saat penyimpanan

padat serta sterilisasi warnanya tetap deep green tidak ada pertumbuhan.

Methyl red merupakan medium yang konsistensinyacair dan juga digunakan

untuk pengujian methyl red. Methyl red memiliki komposisi indikator methyl red,

pepton, dan ekstrak daging. Methyl red berwarna kuning pada awal pembuatan

dan pada saat disterilisasi konsistensinya tetap cair dan warnanya pun tetap

kuning.

Gelati adalah medium yang konsistensinya cair. Umumnya medium gelati

ini digunakan untuk menguji bakteri pendegradasi galetin. Komposisi dari

medium galetin adalah khusus pepton dari daging dan ekstrak daging. Galetin

memiliki warna awal kuning dan saat disterilisasi atau pun penyimpanan warna

gelatin tidak berubah yakni tetap kuning.

Manitol adalah medium yang konsistensinya padat dan pada umumnya

digunakan untuk uji fermentasi karbohidrat. Manitol memiliki komposisi yaitu

pepton, dari daging, ekstrak daging, sodium klorida.

Urea agar adalah medium yang konsistensinya padat dan pada umumnya

digunakan untuk uji tes urease. Urea agar memiliki komposisi berupa pepton dari

daging, glukosa, sodium klorida, pottasium dihidrogen phosfat, D(+) glikosa,

fenol merah dan agar. Urea agar memiliki warna awal jingga dan pada saat

sterilisasi dan penyimpanan juga warnanya tetap jingga. Cara pembuatannya sama

dengan cara pembuatan pada medium yang lainnya yaitu hanya dilarutkan dan

dipanaskan hingga mendidih lalu didiamkan sampai dingin dan disterilisasi.

Milk agar adalah medium yang konsistensinya padat dan juga umumnya

digunakan untuk uji hidrolisa polisakarida, protein dan lipid. Milk agar memiliki

komposisi yaitu pepton dari daging, ekstrak ragi, susu bubuk dan agar. Milk agar

juga digunakan untuk menentukan bakteri aerob dan kadang juga mengandung ice

cream. Milk agar memiliki warna awal kuning dan saat sterilisasi ataupun saat

padat warna milk agar tetap kuning.

Setelah semua medium dibuat maka dilakukan isolasi mikroorganisme dan

dalam percobaan ini. Ada beberapa sampel yang digunakan untuk isolasi bakteri

yaitu air sumur, air sungai karang mumus, dan tanah sampah. Medium yang

digunakan untuk isolasi bakteri adalah medium nutrien agar. Nutrien agar

digunakan kerena nutrien agar ini merupakan medium umum dan tidak selektif

sehingga dapat ditumbuhi oleh bakteri apa saja.

Tanah sampah adalah sampel yang digunakan untuk isolasi. Konsistensi

bentuk tanah sampah adalah padatan maka yang digunakan adalah metode tabur

untuk isolasi. Cara melakukan metode tabur yaitu medium NA dipadatkan dahulu

didalam cawan petri agar tidak tumpah. Setelah pdat barulah tanah sampah ditabur

atau disebar di atas medium menggunakan spatula. Kemudian diisolasi lalu

disterilisasi selama 2x24 jam dengan tujuan agar didapat hasil yang bagus dan

steril.

Air sumur, air sungai mahakam dan air sungai karang mumus adalah ketiga

sampel yang diisolasi dengan metode sebar. Cara melakukan metode sebar yaitu

medium dimasukkan didalam cawan petri dan kemudian dibiarkan hingga padat.

Setelah padat baru sampel dimasukkan dan diratakan menggunakan drigalsky.

Setelah itu disterilisasi 2x24 jam pada 37 oC tujuannya agar pertumbuhan dari

bakterinya maksimal. Hasil pengamatannya adalah hanya sedikit bakteri yang

tumbuh saat diisolasi. Hal ini dapat disebabkan karena kontak dari medium

dengan sampel hanya di permukaannya saja sehingga hanya sedikit bakteri yang

tumbuh. Artinnya metode tuang lebih cocok untuk sampel cair dibandingkan

dengan metode sebar.

Pengujian pertama yaitu uji hidrolisa polisakarida protein dan lemak.

Medium yang digunakan adalah milk agar dengan waktu inkubasi 2x24 jam pada

suhu 37 oC. Bakteri dapat mengahsilkan enzim amolitik yang dapat memecah pati

menjadi monosakarida yang dibutuhkan untuk metabolisme pada media dengan

nitrogen. Bakteri yang dapat menghidrolisis protein adalah bakteri yang

memproduksi enzim proteinase ekstraseluler, semua bakteri mempunyai enzim

proteinase seluler. Bakteri yang mampu menghidrolisis lemak menjadi senyawa

sederhana yaitu asam lemak dan gliserol. Reaksi positif daro pengujian ini adalah

adanya daerah bening disekeliling biakan pada cawan petri. Daerah bening

tersebut menunujukkan adanya kemampuan bakteri atau sampel untuk

memproduksi antibiotik. Berdasarkan pengujian Bacillus subtilis, Escherchia coli,

kultur air sumur, air sungai karang mumus dan tanah sampah menunjukkan reaksi

negative. Sebenarnya Bacillus subtilis memiliki kemampuan memproduksi

antibiotic dalam bentuk lipopeptida seperti yang telah dijelaskan sebelumnya.

Reaksi negatif tersebut dapat disebabkan karena penginokulan yang dilakukan

berulang kali sehingga daerah bening tidak dapat teramati dengan jelas.

Uji fermentasi karbohidrat menggunakan medium manitol. Fermentasi

karbohidrat merupakan suatu kemampuan yang dimiliki oleh beberapa bakteri

untuk memetabolisme karbohidrat tanpa mengunakan atau membutuhkan oksigen

sehingga dapat menghasilkan karbondioksida dan air. Manitol disini berfungsi

sebagai sumber karbohidrat yang nantinya akan difermentasikan oleh indikator

brom cresol ungu yang kemudian akan menumbuhkan bakteri pada medium cair.

KH akan mengalami fermentasi dan kemudian akan menghasilkan asam, asam

yang telah dihasilkan tersebut akan menurunkan pH dari medium dan

menyebabkan perubahan warna pada medium. Metode yang digunakan pada

pengujian ini adalah metode gores dengan medium agar miring dengan waktu

inkubasi selama 2x24 jam pada suhu optimum yaitu 37 oC, waktu tersebut

merupakan waktu yang dibutuhkan oleh bakteri untuk memfermentasi KH dengan

baik.

Hasil positif pada uji ini adalah apabila medium yang awalnya berwarna

merah berubah menjadi bening atau kuning. Perubahan warna tersebut disebabkan

karena adanya indikator fenol merah serta pada pH diatas 7 dan indikator ini

berwarna merah dan pada pH dibawah 7 maka indikator akan berwarna kuning,

dan ini menandakan telah terjadi reaksi fermentasi yang menghasilkan asam-asam

seperti asam laktat. Bakteri yang digunakan dalam pengujian permentasi adalah

Escherichia coli, dan Bacillus subtilis. Sampel yang digunakan adalah air sungai

karang mumus, air sumur dan tanah sampah. Hasil uji untuk seluruh sampel

ataupun bakteri adalah positif dengan adanya perubahan warna medium menjadi

kuning. Hal ini menunjukkan bahwa pada sampel terdapat banyak kemungkinan

golongan bakteri baik bakteri gram positif maupun gram negatif.

Uji pembentukan H2S adalah uji untuk melihat apakah suatu bakteri dapat

menghasilkan H2S dari asam amino. Selain itu uji ini dilakukan untuk

mengidentifikasi mikroba yang dapat menguraikan asam amino yang mengandung

sulfur. Mikroorganisme yang dapat bereaksi positif akan menghasilkan enzim

desulfurase saat dibiakkan di dalam medium yang mengandung asam amino,

dimana akan terdapat sulfur sehingga diuraikan menjadi H2S. Dimana pada

medium terkandung logam Fe2+ yang akan bereaksi dengan H2S dan kemudian

menghasilkan FeS yang berwarna hitam. Medium yang digunakan untuk

pengujian ini adalah Kliger Iron Agar atau KIA. Bakteri yang digunakan untuk

pengujian ini adalah Escherichia coli, dan Salmonella thyposa. Sedangkan sampel

yang digunakan adalah tanah sampah, air sungai karang mumus dan air sumur.

Uji positif yang ditunjukkan adalah medium berubah menjadi kuning dan

ada yang terjadi slant surfacenyamerah dengan butt hitam atau dirty dan tidak

green serta seluruhnya menunjukkan uji positif terbentukknya H2S. Dibutuhkan

waktu selama 7 hari untuk inkubasi, agar bakteri atau sampel dari bakteri mampu

bereaksi pada asam amino yang mengandung S dari H2, sedangkan untuk Fe

menjadi FeS dibutuhkan waktu selama 7x24 jam agar bisa bereaksi.

Uji katalase adalah uji yang digunakan untuk mendeteksi adanya enzim

katalase. Enzim ini terdapat pada sel-sel yang mempunyai metabolisme aerobic

serta untuk mengidentifikasi bakteri aerobic atau anaerobic. Bakteri anaerobik

tidak mempunyai enzim katalase. Reagen atau pereksi adalah H2O2 3 %. Enzim

dengan H2O2 akan bereaksi positif membentuk O2 yang ditandai dengan adanya

gelembung. Bakteri dan sampel yang digunakan dalam pegujian ini adalah

Escherichia coli, Staphylococcus aureus, air sungai karang mumus, air sumur dan

tanah sampah. Bakteri yang paling banyak gelembung adalah Escherichia coli dan

sampel yang paling banyak adalah air sungai mahakam. Seharusnya Escherichia

coli hanya terdapat sedikit gelembung karena bukan merupakan bakteri yang

aerob, namun kesalah ini mungkin pada penggunaan jarum ose yang masih sama

untuk semua bakteri.

Enzim katalase pada bakteri pada umumnya berperan dalam menetralisir

efek bakterisidal hidrogen peroksida. Uji positif pada pengujian ini biasanya

sampel mengandung genus Staphylococcus dan family Enterobacteriaceae.

Enterobactereriaceae merupakan kelompok bakteri yang dapat

memnyebabkan infeksi pada saluran pencernaan manusia beserta hewan. Bakteri

ini merupakan bakteri Gram negatif yang biasanya memiliki bentuk seperti basil

dan tidak membentuk spora, berkapsul serta memiliki flagel. Bakteri ini dapat

tumbuh baik hampir pada semua medium buatan serta mampu mengurai

karbohidrat seperti glukosa dan laktosa menjadi asam dan gas seperti bakteri

Escherichia coli.

Uji pencairan gelatin. Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah suatu

bakteri memiliki enzim gelatin yang mampu menghidrolisis gelatin. Medium yang

digunakan adalah gelatin, dengan waktu inkubasi 2x24 jam pada suhu 37 oC.

sebelum pengamatan medium yang berisi biakan terlebih dahulu dimasukkan ke

dalam frezer 10-15 menit, agar pengamatan pencairan gelatin lebih mudah

teramati. Berdasarkan pengujian Escherchia coli, Bacillus subtilis air sumur, air

sungai karang mumus dan tanah sampah menunjukkan reaksi negatif. Sehingga

diduga semua sampel bakteri tidak memiliki enzim gelatin yang mampu

menghidrolisis gelatin.

Uji methyl red adalah uji yang digunakan untuk melihat sejumlah besar

bakteri gram negatif seperti Escherichia coli. Selain itu untuk membedakan antara

mikroorganisme yang mampu mengubah glukosa menjadi piruvat. Medium

methyl red mengndung indikator metil merah yang akan berubah menjadi merah

jika suasananya semakin asam dan menjadi kuning jika berda dalam suasana basa.

Uji positif pada reaksi ini adalah apabila terjadi perubahan warna medium

menjadi kuning atau merah. Bakteri yang digunakan pada uji ini adalah

Escherichia coli dan Streptococcus mutans, dan sampelnya adalah air sungai

karang mumus, air sumur, dan tanah sampah. Lama waktu inkubasi untuk

pengujian ini adalah selama 5–7 hari, tujuannya agar fermentasi atau reaksi yang

terjadi dapat sempurna.

Uji methyl red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam

campuran dimana beberapa bakteri dapat memfermentasikan glukosa dan

menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH

media pertumbuhannya menjadi 5,0 atau lebih rendah. Uji ini dilakukan untuk

menghasilkan asam Melalui proses hidrolisis yang menghasilkan asam organik

sederhana pada percobaan ini adanya indikator methyl red dalam medium dapat

menunjukkan perubahan pH asam methyl red akan menjadi merah pada suasana

asam pH 4,4 dan akan berwarna kuning pada suasana basa pH 6,2. Uji ini

berguna dalam identifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan,

seperti pada golongan coliform dan enterobacteriaceae.

Uji ini berhubungan dengan uji fermentasi karbohidrat menggunakan

medium monitol. Sehingga selain perubahan warna medium hasil positif uji ini

adalah pembentukan gas yang terdapat dalam tabung durham. Medium

dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sebelumnya telah dimasukkan tabung

durham. Diinokulasikan selama 7x24 jam dalam inkubator pada suhu 37 oC. Hasil

pengamatan ialah pada semua tabung menunjukkan hasil dengan adanya

perubahan warna dari terbentuknya gelembung udara pada tabung durham. Hal ini

dapat membuktikan bahwa terdapat bakteri yang mampu membentuk asam dari

hidrolisis glukosa pada sampel.

Tes urease adalah tes untuk mengidentifikasi bakteri yang dapat

menguraikan urea, dimana urea tersebut merupakan pathogen terhadap sel. Urea

kemudian akan dipecah menjadi NH3 dan CO. Prinsip uji ini adalah urea yang

terdapat pada media, terhidrolisis menjadi karbondioksida dan ammonia dengan

enzim urease. Amonia akan menyebabkan terjadinya suasana yang alkalis atau

basa. Bakteri yang digunakan dalam tesini adalah Escherichia coli dan Bacillus

subtilis. Dan sampel yang digunakan adalah air sumur, air sungai karang mumus,

dan tanah sampah.

Hasil reaksi positif pada tes urease adalah medium berubah warna merah.

Perubahan warna pada medium ini terjadi karena adanya indikator fenol merah.

Ketika urea terurai menjadi NH3 dan CO2 maka suasana dari menjadi basa dan

indikator ini akan menimbulkan warna dari kuning, merah hingga ungu

tergantung pH dari Escherichia coli mendapatkan hasil positif menggunakan tes

ureas sedangkan Bacillus subtilis hasil tesnya adalah negatif. Bakteri Escherichia

coli adalah bakteri adalah bakteri gram negatif yang mampu mengurai urea menjdi

ammonia dan CO2. Sedangkan Bacillus subtilis adalah bakteri gram positif

sehingga tidak menghidrolisis urea. Sampel yang mengalami tes positif adalah air

sumur, air sungai karang mumus dan tanah sampah dimana menunjukkan slant

surface merah (negatif). Hasil dari data menyatakan bahwa kemungkinan di dalam

air sungai karang mumus, air sumur, dan tanah sampah terdapat bakteri

Escherichia coli dan pada biakan terdapat bakteri Bacillus subtilis.

Tes utilisasi sitrat adalah tes menggunakan medium Simmons Citrate

Agar (SCA). Uji ini dilakukan untuk melihat kemampuan dari mikroorganisme

menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Apabila

mikroorganisme tersebut dapat menggunakan sitrat tersebut maka asam akan

dihilangkan dari medium dan akan menyebabkan terjadinya peningkatan pH

sehingga dapat mengubah warna dari hijau menjadi biru. Agar sitrat ini

merupakan medium sintetik dengan sumber karbon satu-satunya adalah sitrat dan

sumber nitrogennya adalah amonium dan bukan asam amino. Kemudian juga

terdapat indikator bromtimol biru yang akan berubah menjadi warna biru dalam

suasana alkalis. Sehingga jika baktri menggunakan sitrat sebagai sumber terhadap

satu-satunya maka suasana menjadi basa dan medium berubah menjadi warna

biru. Bakteri yang digunakan pada tes ini adalah Escherichia coli, dan

Staphylococcus aureus.Sampelnya adalah air sumur, air sungai karang mumus,

dan tanah sampah. Tes positif terjadi pada seluruh sampel uji maupun pada

bakteri, hal ini menandakan bahawa ada bakteri yang mengunakan sitrat sebagai

sumber energi mereka. Karena tes utilisasi saat ini tidak berfokus atau spesifik

untuk golongan gram positif tetapi gram negatif saja.

Pengujian terakhir ialah pengujian lysine dekarboksilase sampel yang

digunakan ialah Escherchia coli, dan Salmonella thyposa sampel air sumur, air

sungai karang mumus dan tanah sampah. Sedangkan medium yang digunakan

adalah lysine iron agar (LIA). Komposisi LIA adalah pepton, ekstrak ragi, D(+)

glukosa, L-lysin monohidroklorida, Na2SO3 dan ammonium iron (III) sitrat

indikator BTB dan agar. Lysine dekarboksilase oleh mikroorganisme LDC. Positif

menghasilkan cadavenin amine yang menyebabkan pH indikator bromoaerosol

berwarna ungu menjadi violet sebagai dekarboksilase yang hanya terjadi pada

medium asam (dibawah pH 6,0). Medium biakan pertama-tama harus diasamkan

dengan fermentasi glukosa selanjutnya medium ini hanya bisa digunakan untuk

pembanding biakan fermentasinya glukosa menyebabkan keseluruhan biakan

medium menjadi berwarna kuning. Perubahan warna juga dapat terjadi karena

terbentuknya ion sulfida dari produksi H2S oleh enzim lysine dekarboksilse. Pada

inkubasi jangka panjang, alkalinisasi permukaan medium bakteri dapat

menghasilkan warna violet. Berdasarkan pengamatan yang telah dilakukan maka

dapat diidentifikasi bahwa seluruh bakteri positif memiliki enzim lysine

dekarboksilase.

Suhu dan waktu yang digunakan disesuaikan dengan pengujian yang

dilakukan. Hal ini dikarenakan suhu dan waktu tersebut adalah suhu dan waktu

optimum tumbuhnya biakan. Sehingga dapat diperoleh hasil pengujian yang

maksimal dan sesuai dengan literatur yang ada. Selain itu juga merupakan suhu

dan waktu optimum untuk pengujian enzim.

BAB VI

PENUTUP

6.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan maka dapat

disimpulkan bahwa :

1. Pada uji hidrolisis polisakarida bakteri maupun sampel menunjukan hasil

yang negatife sehiga tidak bisa digunakan untuk pengembangan antibiotik.

2. Pada uji fermentasi karbohidrat bakteri maupun sampel yang menunjukan

hasil positif adalah bakteri Escherichia coli, Bacillus subtilis, dan

Staphylococcus aureus, Serta pada sampel adalah air sungai mahakam,

tanah sampah, dan air got.

3. Pada uji katalase bakteri maupun sampel yang menunjukan hasil yang

positif adalah bakteri Escherichia coli, serta pada sampel adalah air sungai

Mahakam.

4. Pada uji pencairan gelatin bakteri maupun sampel menunjukan hasil yang

negatif.

5. Pada uji Produksi H2S bakteri maupun sampel yang menunjukan hasil

positif adalah bakteri Escherichia coli, Salmonella thyposa dan

Streptococcus mutans, Serta pada sampel adalah tanah sampah, air sungai

karang mumus dan air got.

6. Pada uji methyl red bakteri maupun sampel yang menunjukan hasil positif

adalah bakteri Escherichia coli dan Streptococcus mutans, dan sampelnya

adalah air sungai karang mumus, air got, dan tanah sampah.

7. Pada uji tes urease bakteri maupun sampel yang menunjukan hasil positif

adalah bakteri Escherichia coli, dan sampelnya adalah air got, air sumur,

dan tanah sampah.

8. Pada uji tes Lysine Dekarboksilase bakteri maupun sampel yang

menunjukan hasil positif adalah bakteri Escherichia coli, Salmonella

thyposa, dan Streptococcus mutans, Sampelnya yaitu air got dan tanah

sampah.

9. Pada Uji tes utilisasi sitrat bakteri maupun sampel yang menunjukan hassil

positif adalah Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Streptococcus

mutans, Sampelnya adalah air sungai mahakam, air sungai karang mumus,

dan tanah sampah.

6.2 Saran

Sebaiknya pengerjaan dilakukan dengan kondisi yang steril agar bakteri

maupun sampel yang digunakan tidak terjadi kontaminasi, serta dalam pengujian

harus benar – benar teliti agar bakteri maupun sampel yang digunakan tidak salah

dan susuai dengan pengujian.

DAFTAR PUSTAKA

Absor, Ulii. 2006. Aktivitas Antibakteri Ranting Patah Tulang (Euphorbia

tirucalli Linn.). Program Studi Biokimia FMIPA ITB: Bogor.

Entjang, Indan. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi. Citra Aditya Bakti:

Bandung.

Feliatra. 1999. Identifikasi Bakteri Pada Patogen (Vibrio sp) di Perairan Nongsa

Batam Provinsi Riau. Jurnal Natur Indonesia volume 11 nomor 1.

Irianto, Koes. 2007. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme 2. Yrama

Widya: Bandung.

Marks, Dawn B. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah Pendekatan Klinis.

EGC: Jakarta.

Marlina. 2007. Identifikasi Bakteri Vibrio Parahaemolitycus PCR. Jurnal Sains

dan Teknologi Farmasi volume 12 nomor 1.

Merck, E. Handbook Culture Media MERCK Frankturter Strabe 250 D-6100

Darmstadt 1.

Nofiani, Risa. 2004. Bakteri Resisten Merkuri Spektrum Sempit dari Daerah

Bekas Penambangan Emas Tanpa Izin Mandor Kalimantan Barat. Jurnal

Natur Indonesia volume 6 nomor 2.

Pelczar, Michael J. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Pres: Jakarta.

Prasetyo, Heru. 2006. Kandungan Selenium Total Dalam Bakteri Termofilik

Terseleksi Dari Sumber Air Panas. Program Studi Biokimia FMIPA ITB:

Bogor.

Pratiwi , Arena Yogi. 2012. Penapisan Bakteri Resisten Terhadap Merkuri

Sebagai Alternatif Agen Bioremidiasi pada Pencemaran Tanah

Pertambangan. Departemen Biokim FMIPA ITB: Bogor.

Sitompul, S.M. 2011. Penuntun Praktikum Biokimia Tanaman. Laboratorium

Fisiologi Tumbuhan. Jurusan Budidaya Pertanian Fakultas Pertanian

Universitas Brawijaya: Malang.

disee mikroo biokim

Documents