1. Sebutkan berbagai cara penanaman bakteri ?

Teknik penanaman dari suspensiTeknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari

pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.a.1. Spread Plate (agar tabur ulas)

Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni.Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut :

Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat.

Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.

Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.

Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.

a.2. Pour Plate (agar tuang)Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri

lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut :

Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC) Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan

media, kemudian diinkubasi.

Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru.

b.1 Goresan SinambungCara kerja : Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan

ke cawan atau medium baru.

b.2 Goresan TCara kerja : Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada

gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna Lakukan hal yang sama pada daerah 3

b.3 Goresan Kuadran (Streak quadrant)Cara kerja :Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan

awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

2.Bagaimana cara menghitung koloni ?

Metode MPN ( Most Probable Number) atau APM (Angka Paling Mungkin)

Sejarah perkembangan

Metode MPN muncul pada awal abad 20. Estimasi paling akurat dari tabel MPN di publikasikan oleh Mc Crady pada tahun 1915 kemudian dasar statistik dari metode MPN dikemukakan oleh Halvorson dan Ziegler (1933), Eisenhart dan Wilson (1943) dan Cochan (1950). Pada tahun 1957 Woodward menyarankan tentang pengabaian hasil positif (banyak tabung positif pada pengenceran tinggi dan sebaliknya) yang dapat meningkatkan kesalahan laboratorium dalam tabel MPN. Kemudian  De Mann pada tahun 1983 mempublikasikan tentang metode perhitungan tingkat kepercayaan (convidence interval) dalam tabel MPN.

Prinsip yang digunakan dalam metode MPN

MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel.

Contoh :Data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000.Lalu dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang

dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan.

Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah : Bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel Sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri coliform termasuk E.

coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai). Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga

minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi tersebut. Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang terluka dan tidak mampu

menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.

MPN dinilai dari perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU, bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. Metode MPN dirancang dan lebih cocok untuk diterapkan pada sampel yang memiliki konsentrasi <100/g atau ml. Oleh karena itu nilai MPN dari sampel yang memiliki populasi mikroorganisme yang tinggi umumnya tidak begitu menggambarkan jumlah mikroorganisme yang sebenarnya. Jika jumlah kombinasi tabung positif tidak sesuai dengan tabel maka sampel harus diuji ulang. Semakin banyak seri tabung maka semakin tinggi akurasinya tetapi juga akan mempertinggi biaya analisa.

Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan. Umumnya media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan bakteri tertentu. Misalnya dalam mendeteksi faecal coliform dan E coli dapat menggunakan media Brilliant Green Lactose 2% Bile (BGLB) broth. Di dalam media ini mengandung lactose dan garam empedu (bile salt) yang hanya mengizinkan faecal coliform dan E.coli untuk tumbuh. Jika terdapat ketidaksesuaian jenis media dan bakteri yang diinginkan maka metode MPN akan menghitung bukan bakteri yang dituju. Untuk menghitung coliform dapat menggunakan Lauryl Sulphate Tryptose (LST) broth, sedangkan untuk menghitung E.coli diperlukan media EC (Escherichia coli) broth.  Berdasarkan prinsip diatas apakah mungkin metode MPN dapat untuk menghitung jenis bakteri selain jenis-jenis coliform ?

Jadi nilai MPN adalah suatu angka yang menggambarkan hasil yang PALING MUNGKIN.

Aspek peluang dalam metode MPN

Berdasarkan prinsip diatas maka “seharusnya/sebaiknya” jumlah tabung positif pada pengenceran 1/10 > 1/100 > 1/1000 (misalnya 5-3-1) karena setiap pengenceraan mengurangi jumlah mikroorgansime target dan akibatnya semakin kecil kesempatannya untuk membuat tabung menjadi positif. Namun seringkali hasil yang didapat tidak sesuai dengan logika peluang, seperti 5-3-4 yang menghasilkan nilai 210 (lihat tabel dibawah). Bisa saja banyak sel tidak sengaja terambil dan memperbanyak pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak berlangsung sempurna.

 Untuk memahami peranan peluang dalam mendistribusikan sel sehingga menghasilkan tabung positif maka jumlah

tabung positif (digaris bawah) pada tabel dicoba untuk dirunut dan diilustrasikan kembali dalam proses penanamannya pada gambar berikut (dianggap bahwa nilai MPN/ml sama dengan sel/ml). Namun perlu diingat, jumlah sel yang terambil tidak selalu seperti itu, semuanya adalah peluang dan angka yang didapat adalah angka paling mungkin.

 

Perbandingannya dengan plate count

Telah disebutkan diatas bahwa MPN cocok untuk sampel dengan konsentrasi mikroorganisme rendah khususnya dari jenis sampel air, susu, atau makanan terutama yang memiliki partikel-partikel yang larut didalamnya. Partikel-partikel tersebut dimungkinkan mampu mempengaruhi keakuratan perhitungan bakteri jika menggunakan metode penanaman pada cawan petri. Hal ini karena sel bakteri yang terpisah dapat mengelompok pada partikel makanan dan mungkin tidak terpisah pada proses homogenisasi dalam pengenceran bertingkat sehingga saat diplating satu kumpulan tersebut menjadi satu koloni dan membuat data plate count menjadi bias. Metode MPN dapat mengeliminasi kekurangan ini.

Kaidah pemilihan tabung positif dan cara pelaporannya

Syarat umum yang dipakai dalam pemilihan tabung positif adalah Pilih pengenceran terendah yang tidak semua tabung menghasilkan tabung positif Pilih pengenceran tertinggi yang paling tidak memiliki satu tabung positif Pilih semua pengenceran diantaranya. Kalikan setiap seri tabung yang dipilih dengan pengenceran yang diambil.

Misalnya : dari inokulum 1, 0,1, 0,01, 0,001 dan 0,0001 menghasilkan kombinasi tabung positif 5-4-3-1-0 maka dipilih 5-4-3-1-0 bukan 5-4-3-1-0 atau 5-4-3-1-0 sehingga didapat nilai MPN 33/ml.

Namun tidak semua keadaan menggambarkan kondisi ideal seperti diatas. Untuk kasus semua seri tabung menghasilkan tabung positif dan tidak semua pengenceran menghasilkan tabung positif dapat dilihat pada contoh berikut

Contoh a) 5-5-1-0-0 dan b) 4-5-1-0-0 ; pilih pengenceran tertinggi yang menghasilkan seluruh tabung positif dan dua pengenceran berikutnya.Contoh c) 5-4-4-1-0 ; jika pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi masih menghasilkan tabung positif (103

menghasilkan 1 tabung positif) maka pada tingkat pengenceran tersebut tingkat pengenceran tertinggi yang dipilih.Contoh d) 5-4-4-0-1 ; Jika pada tingkat pengenceran tertentu semua menghasilkan tabung negatif tetapi pengenceran selanjutnya masih terdapat tabung positif, maka yang dinyatakan tabung positif adalah tingkat pengenceran sebelumnya.Contoh e) 5-5-5-5-2 ; Jika pada tingkat pengenceran tertinggi masih terdapat tabung positif, maka pilih tingkat pengenceran sebelumnya. Contoh f) 0-0-1-0-0 ; jika tingkat pengenceran tertentu menghasilkan tabung positif maka pilih dua tingkat pengenceran sebelumnyaContoh g) 4-4-1-1-0 dipilih menjadi 4-4-2 ; jika pada pengenceran yang lebih tinggi masih menghasilkan tabung positif maka tambahkan tabung positif tersebut ke tingkat pengenceran sebelumnya.Catatan : pada contoh e hasil untuk 5-5-2 dengan inokulum 1,0, 0,01 dan 0,001 ml adalah 540 tetapi karena diambil pengenceran dari (inokulum) 0,01, 0,001 dan 0,0001 maka nilai harus dikalikan 10. Begitu pula sebaliknya untuk contoh g yang diambil dari pengenceran (inokulum) 1, 0,1 dan 0,01 maka nilai 47 harus dibagi 10.

Menghitung angka MPN tanpa tabel

Nilai MPN ternyata dapat dicari dengan rumus berikut (Thomas formula) :

 Contoh 1 :Untuk hasil (10/10, 10/10, 4/10, 2/10, 0/10) jika digunakan tabel maka dipilih (10/10, 10/10, 4/10, 2/10, 0/10) yaitu kombinasi 10-4-2 = 70/g tetapi dalam perhitungan hanya gunakan (10/10, 10/10, 4/10, 2/10, 0/10).

 

Contoh 2 :

Untuk hasil (5/5, 3/5, 1/5, 0/5) pemilihan dipilih (5/5, 3/5, 1/5, 0/5) yaitu kombinasi 5-3-1 = 110/ml tetapi dalam perhitungan hanya gunakan (5/5, 3/5, 1/5, 0/5) Dengan cara yang sama maka MPN/g =  4/(0,024x0,055)1/2

=  4/0,0363=  110/ml , (sama dengan hasil yang didapatkan dari tabel)

Jumlah seri tabung dan pengenceran yang disarankan

Menurut USDA dan FSIS untuk mengantisipasi jika jumlah mikroorganisme dalam sampel >10 CFU/g atau ml maka disarankan menanam sampel 10 ml pada 3 seri tabung, 1 ml pada 3 seri tabung lalu selanjutnya dilakukan pengenceran sampai 104 dan tiap pengenceran ditanam 1 ml pada 3 seri tabung seperti skema di bawah ini.

Tabel 1. Tabel MPN untuk 3 seri tabung dengan 0,1, 0,01 dan 0,001 g inokulum

Tabel MPN untuk 3 seri tabung dengan 0,1, 0,01 dan 0,001 g inokulum(95 % confidence intervals)

Tabung positif

MPN/g

Conf. lim. Tabung positif

MPN/g

Conf. lim.

0.10

0.01

0.001

bwah

atas

0.10

0.01

0.001

bwah

atas

0 0 0<3.0

--9.5

2 2 0 214.5

42

0 0 1 3.00.15

9.6

2 2 1 288.7

94

0 1 0 3.00.15

11

2 2 2 358.7

94

0 1 1 6.11.2

18

2 3 0 298.7

94

0 2 0 6.21.2

18

2 3 1 368.7

94

0 3 0 9.43.6

38

3 0 0 234.6

94

1 0 0 3.60.17

18

3 0 1 388.7

110

1 0 1 7.21.3

18

3 0 2 64 17180

1 0 2 113.6

38

3 1 0 43 9180

1 1 0 7.41.3

20

3 1 1 75 17200

1 1 1 113.6

38

3 1 2 120 37420

1 2 0 113.6

42

3 1 3 160 40420

1 2 1 154.5

42

3 2 0 93 18420

1 3 0 164.5

42

3 2 1 150 37420

2 0 0 9.21.4

38

3 2 2 210 40430

2 0 1 143.6

42

3 2 3 290 901,000

2 0 2 204.5

42

3 3 0 240 421,000

2 1 0 15 3. 4 3 3 1 460 90 2,

7 2000

2 1 1 204.5

42

3 3 21100

180

4,100

2 1 2 278.7

94

3 3 3>1100

420

--

Tabel MPN untuk 5 seri tabung dengan 0,1, 0,01 dan 0,001 g inokulum. ( 95 % confidence intervals ).

Tabung positifMPN/g

Conf. lim. Tabung positifMPN/g

Conf.lim.

0.1

0.01

0.001

bwah

atas

0.1

0.01

0.001

bwah

atas

0 0 0 <1.8 -- 6.8

4 0 2 21 6.8 40

0 0 1 1.8 0.09

6.8

4 0 3 25 9.8 70

0 1 0 1.8 0.09

6.9

4 1 0 17 6 40

0 1 1 3.6 0.7 10

4 1 1 21 6.8 42

0 2 0 3.7 0.7 10

4 1 2 26 9.8 70

0 2 1 5.5 1.8 15

4 1 3 31 10 70

0 3 0 5.6 1.8 15

4 2 0 22 6.8 50

1 0 0 2 0.1 10

4 2 1 26 9.8 70

1 0 1 4 0.7 10

4 2 2 32 10 70

1 0 2 6 1.8 15

4 2 3 38 14 100

1 1 0 4 0.7 12

4 3 0 27 9.9 70

1 1 1 6.1 1.8 15

4 3 1 33 10 70

1 1 2 8.1 3.4 22

4 3 2 39 14 100

1 2 0 6.1 1.8 15

4 4 0 34 14 100

1 2 1 8.2 3.4 22

4 4 1 40 14 100

1 3 0 8.3 3.4 22

4 4 2 47 15 120

1 3 1 10 3.5 22

4 5 0 41 14 100

1 4 0 11 3.5 22

4 5 1 48 15 120

2 0 0 4.5 0.7 1 5 0 0 23 6.8 70

9 5

2 0 1 6.8 1.8 15

5 0 1 31 10 70

2 0 2 9.1 3.4 22

5 0 2 43 14 100

2 1 0 6.8 1.8 17

5 0 3 58 22 150

2 1 1 9.2 3.4 22

5 1 0 33 10 100

2 1 2 12 4.1 26

5 1 1 46 14 120

2 2 0 9.3 3.4 22

5 1 2 63 22 150

2 2 1 12 4.1 26

5 1 3 84 34 220

2 2 2 14 5.9 36

5 2 0 49 15 150

2 3 0 12 4.1 26

5 2 1 70 22 170

2 3 1 14 5.9 36

5 2 2 94 34 230

2 4 0 15 5.9 36

5 2 3 120 36 250

3 0 0 7.8 2.1 22

5 2 4 150 58 400

3 0 1 11 3.5 23

5 3 0 79 22 220

3 0 2 13 5.6 35

5 3 1 110 34 250

3 1 0 11 3.5 26

5 3 2 140 52 400

3 1 1 14 5.6 36

5 3 3 180 70 400

3 1 2 17 6 36

5 3 4 210 70 400

3 2 0 14 5.7 36

5 4 0 130 36 400

3 2 1 17 6.8 40

5 4 1 170 58 400

3 2 2 20 6.8 40

5 4 2 220 70 440

3 3 0 17 6.8 40

5 4 3 280 100

710

3 3 1 21 6.8 40

5 4 4 350 100

710

3 3 2 24 9.8 70

5 4 5 430 150

1,100

3 4 0 21 6.8 40

5 5 0 240 70 710

3 4 1 24 9.8 70

5 5 1 350 100

1100

3 5 0 25 9.8 70

5 5 2 540 150

1700

4 0 0 13 4.1 35

5 5 3 920 220

2600

4 0 1 17 5.9 36

5 5 4 1600 400

4600

5 5 5 >1600

700

--

Tabel 3. Tabel MPN untuk 10 seri tabung dengan 0,1, 0,01 dan 0,001 g inokulum

Tabel MPN untuk 10 seri tabung dengan 0,1, 0,01 dan 0,001 g inokulum, ( 95 % confidence intervals ).

Tabung positif

MPN/g

Conf. lim.

Tabung positif

MPN/g

Conf. lim.

0.1

0.01

0.001

bawh

atas

0.1

0.01

0.001

bawah

atas

0 0 0 <90

-- 3.1

8 2 0 17 7.7 34

0 0 1 0.9 0.04

3.1

8 2 1 19 9 34

0 0 2 1.8 0.33

5.1

8 2 2 21 10 39

0 1 0 0.9 0.04

3.6

8 2 3 23 11 44

0 1 1 1.8 0.33

5.1

8 3 0 19 9 34

0 2 0 1.8 0.33

5.1

8 3 1 21 10 39

0 2 1 2.7 0.8

7.2

8 3 2 24 11 44

0 3 0 2.7 0.8

7.2

8 3 3 26 12 50

1 0 0 0.94

0.05

5.1

8 4 0 22 10 39

1 0 1 1.9 0.33

5.1

8 4 1 24 11 44

1 0 2 2.8 0.8

7.2

8 4 2 26 12 50

1 1 0 1.9 0.33

5.7

8 4 3 29 14 58

1 1 1 2.9 0.8

7.2

8 5 0 24 11 44

1 1 2 3.8 1.4

9 8 5 1 27 12 50

1 2 0 2.9 0.8

7.2

8 5 2 29 14 58

1 2 1 3.8 1.4

9 8 5 3 32 15 62

1 3 0 3.8 1.4

9 8 6 0 27 12 50

1 3 1 4.8 2.1

11

8 6 1 30 14 58

1 4 0 4.8 2.1

11

8 6 2 33 15 62

2 0 0 2 0.37

7.2

8 7 0 30 14 58

2 0 1 3 0.81

7.3

8 7 1 33 17 73

2 0 2 4 1.4

9 8 7 2 36 17 74

2 1 0 3 0.82

7.8

8 8 0 34 17 73

2 1 1 4 1.4

9 8 8 1 37 17 74

2 1 2 5 2.1

11

9 0 0 17 7.5 31

2 2 0 4 1.4

9.1

9 0 1 19 9 34

2 2 1 5 2.1

11

9 0 2 22 10 39

2 2 2 6.1 3 14

9 0 3 24 11 44

2 3 0 5.1 2.1

11

9 1 0 19 9 39

2 3 1 6.1 3 14

9 1 1 22 10 40

2 4 0 6.1 3 14

9 1 2 25 11 44

2 4 1 7.2 3.1

15

9 1 3 28 14 58

2 5 0 7.2 3.1

15

9 1 4 31 14 58

3 0 0 3.2 0.9

9 9 2 0 22 10 44

3 0 1 4.2 1.4

9.1

9 2 1 25 11 46

3 0 2 5.3 2.1

11

9 2 2 28 14 58

3 1 0 4.2 1.4

10

9 2 3 32 14 58

3 1 1 5.3 2.1

11

9 2 4 35 17 73

3 1 2 6.4 3 14

9 3 0 25 12 50

3 2 0 5.3 2.1

12

9 3 1 29 14 58

3 2 1 6.4 3 14

9 3 2 32 15 62

3 2 2 7.5 3.1

15

9 3 3 36 17 74

3 3 0 6.5 3 14

9 3 4 40 20 91

3 3 1 7.6 3.1

15

9 4 0 29 14 58

3 3 2 8.7 3.6

17

9 4 1 33 15 62

3 4 0 7.6 3.1

15

9 4 2 37 17 74

3 4 1 8.7 3.6

17

9 4 3 41 20 91

3 5 0 8.8 3.6

17

9 4 4 45 20 91

4 0 0 4.5 1.6

11

9 5 0 33 17 73

4 0 1 5.6 2.2

12

9 5 1 37 17 74

4 0 2 6.8 3 14

9 5 2 42 20 91

4 1 0 5.6 2.2

12

9 5 3 46 20 91

4 1 1 6.8 3 14

9 5 4 51 25 120

4 1 2 8 3.6

17

9 6 0 38 17 74

4 2 0 6.8 3 15

9 6 1 43 20 91

4 2 1 8 3.6

17

9 6 2 47 21 100

4 2 2 9.2 3.7

17

9 6 3 53 25 120

4 3 0 8.1 3.6

17

9 7 0 44 20 91

4 3 1 9.3 4.5

18

9 7 1 49 21 100

4 3 2 10 5 20

9 7 2 54 25 120

4 4 0 9.3 4.5

18

9 7 3 60 26 120

4 4 1 11 5 20

9 8 0 50 25 120

4 5 0 11 5 2 9 8 1 55 25 1

0 20

4 5 1 12 5.6

22

9 8 2 61 26 120

4 6 0 12 5.6

22

9 8 3 68 30 140

5 0 0 6 2.5

14

9 9 0 57 25 120

5 0 1 7.2 3.1

15

9 9 1 63 30 140

5 0 2 8.5 3.6

17

9 9 2 70 30 140

5 0 3 9.8 4.5

18

10

0 0 23 11 44

5 1 0 7.3 3.1

15

10

0 1 27 12 50

5 1 1 8.5 3.6

17

10

0 2 31 14 58

5 1 2 9.8 4.5

18

10

0 3 37 17 73

5 1 3 11 5 21

10

1 0 27 12 57

5 2 0 8.6 3.6

17

10

1 1 32 14 61

5 2 1 9.9 4.5

18

10

1 2 38 17 74

5 2 2 11 5 21

10

1 3 44 20 91

5 3 0 10 4.5

18

10

1 4 52 25 120

5 3 1 11 5 21

10

2 0 33 15 73

5 3 2 13 5.6

23

10

2 1 39 17 79

5 4 0 11 5 21

10

2 2 46 20 91

5 4 1 13 5.6

23

10

2 3 54 25 120

5 4 2 14 7 26

10

2 4 63 30 140

5 5 0 13 6.3

25

10

3 0 40 17 91

5 5 1 14 7 26

10

3 1 47 20 100

5 6 0 14 7 2 1 3 2 56 25 1

6 0 20

6 0 0 7.8 3.1

17

10

3 3 66 30 140

6 0 1 9.2 3.6

17

10

3 4 77 34 150

6 0 2 11 5 20

10

3 5 89 39 180

6 0 3 12 5.6

22

10

4 0 49 21 120

6 1 0 9.2 3.7

18

10

4 1 59 25 120

6 1 1 11 5 21

10

4 2 70 30 150

6 1 2 12 5.6

22

10

4 3 82 38 180

6 1 3 14 7 26

10

4 4 94 44 180

6 2 0 11 5 21

10

4 5 110 50 210

6 2 1 12 5.6

22

10

5 0 62 26 140

6 2 2 14 7 26

10

5 1 74 30 150

6 2 3 15 7.4

30

10

5 2 87 38 180

6 3 0 12 5.6

23

10

5 3 100 44 180

6 3 1 14 7 26

10

5 4 110 50 210

6 3 2 15 7.4

30

10

5 5 130 57 220

6 4 0 14 7 26

10

5 6 140 70 280

6 4 1 15 7.4

30

10

6 0 79 34 180

6 4 2 17 9 34

10

6 1 94 39 180

6 5 0 16 7.4

30

10

6 2 110 50 210

6 5 1 17 9 34

10

6 3 120 57 220

6 5 2 19 9 34

10

6 4 140 70 280

6 6 0 17 9 34

10

6 5 160 74 280

6 6 1 19 9 34

10

6 6 180 91 350

6 7 0 19 9 34

10

7 0 100 44 210

7 0 0 10 4.5

20

10

7 1 120 50 220

7 0 1 12 5 21

10

7 2 140 61 280

7 0 2 13 6.3

25

10

7 3 150 73 280

7 0 3 15 7.2

28

10

7 4 170 91 350

7 1 0 12 5 22

10

7 5 190 91 350

7 1 1 13 6.3

25

10

7 6 220 100

380

7 1 2 15 7.2

28

10

7 7 240 110

480

7 1 3 17 7.7

31

10

8 0 130 60 250

7 2 0 13 6.4

26

10

8 1 150 70 280

7 2 1 15 7.2

28

10

8 2 170 80 350

7 2 2 17 7.7

31

10

8 3 200 90 350

7 2 3 19 9 34

10

8 4 220 100

380

7 3 0 15 7.2

30

10

8 5 250 120

48

0

7 3 1 17 9 34

10

8 6 280 120

480

7 3 2 19 9 34

10

8 7 310 150

620

7 3 3 21 10 39

10

8 8 350 150

620

7 4 0 17 9 34

10

9 0 170 74 310

7 4 1 19 9 34

10

9 1 200 91 380

7 4 2 21 10 39

10

9 2 230 100

480

7 4 3 23 11 44

10

9 3 260 120

480

7 5 0 19 9 34

10

9 4 300 140

620

7 5 1 21 10 39

10

9 5 350 150

630

7 5 2 23 11 44

10

9 6 400 180

820

7 6 0 21 10 39

10

9 7 460 210

970

7 6 1 23 11 44

10

9 8 530 210

970

7 6 2 25 12 46

10

9 9 610 280

1300

7 7 0 23 11 44

10

10

0 240 110

480

7 7 1 26 12 50

10

10

1 290 120

620

8 0 0 13 5.6

25

10

10

2 350 150

820

8 0 1 15 7 26

10

10

3 430 180

970

8 0 2 17 7.5

30

10

10

4 540 210

130

0

8 0 3 19 9 34

10

10

5 700 280

1500

8 1 0 15 7.1

28

10

10

6 920 350

1900

8 1 1 17 7.7

31

10

10

7 1200

480

2400

8 1 2 19 9 34

10

10

8 1600

620

3400

8 1 3 21 10 39

10

10

9 2300

810

5300

10

10

10 >;2300

1300

--

PRINSIP DASAR TEORI MENGHITUNG MIKROORGANISME PADA CAWAN

Banyak tersedia metode untuk menganalisa jumlah mikroorganisme dalam suatu sampel, diantaranya adalah plate count (spread plate, pour plate, spiral plate), membrane filtration, MPN, menghitung langsung dengan Petroff Hausser ataupun cara lainnya (misalnya aktivitas metabolik, turbidimetri, berat kering dll.). Namun dalam ulasan ini lebih ditekankan pada metode yang memerlukan penghitungan koloni pada cawan petri, seperti membrane filtration, spread plate, pour plate dll.Pemahaman tentang satuan dalam menghitung sel mikroba khususnya bakteri adalah sangat penting. Pada hasil akhir penghitungan bakteri pada cawan digunakan satuan CFU’s/volume atau berat. CFU’s adalah singkatan dari Coloni Forming Unit’s yang artinya unit-unit / satuan pembentuk koloni. Yang dimaksud satuan pembentuk koloni adalah sel tunggal atau sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan dalam cawan akan membentuk satu koloni tunggal. Pada dasarnya sel tersebar homogen pada sampel, tetapi ada jenis bakteri yang memang pembelahan selnya dapat terpisah baik sehingga tersebar merata tiap sel dan ada pula bakteri yang setelah membelah sel anakan masih menempel pada induknya, seperti halnya yang terjadi pada streptococcus, diplococcus, sarcina dll. sehingga penyebarannya berkelompok-kelompok. Pada jenis yang seperti ini jika tersebar merata dalam kelompok-kelompok sel maka pertumbuhan menjadi koloni tunggal bukan berasal dari satu sel saja melainkan dari beberapa sel.

Hal-hal penting yang harus dipikirkan matang sebelum menganalisa sampel untuk diketahui jumlah mikroorganismenya adalah:

Memperkirakan jumlah mikroorganisme yang ada dalam sampel per satuan volum. Memilih metode yang cocok sehingga dihasilkan data yang akurat. Mengetahui jenis/golongan mikroorganisme yang akan dihitung, misalnya bermaksud akan menghitung yeast, bakteri,

atau bakteri genus tertentu saja. Menentukan media pertumbuhan yang cocok.

Benar-benar mengetahui perbedaan morfologi koloni antara bakteri, yeast dan molds. Mencari tahu standar/ batas ambang/ jumlah maksimum aman jika sample yang dianalisa memerlukan referensi

tersebut. Memperkirakan jumlah sampel (volum/berat) yang perlu ditampung pada saat pengambilan sampel yang disesuaikan

dengan sample size dari metode teretentu.Seorang mikrobiologiwan sebaiknya mampu memprediksi jumlah sel mikroba dalam suatu sampel tertentu atau yang disebut dengan cell density sebelum menganalisanya. Densitas sel sangat tergantung dari jenis sample. Kemampuan mengira-ira ini dapat diperoleh dari pengalaman, membaca atau bahkan bagi yang “expert” didapat dari perasaan. Fungsi utama memperkirakan densitas sel ini adalah untuk menentukan perlu atau tidaknya dilakukan pengenceran atau untuk menentukan jumlah sampel yang akan dianalisa. Keputusan ini adalah sangat penting. Sebagai pijakan awal, harus diketahui bahwa hasil yang paling baik adalah antara 30-300 koloni per cawan , ada juga yang menyebutkan 25-250 koloni per cawan. Mengapa dipilih range jumlah koloni seperti itu ?... Hal ini ditujukan untuk meminimalisir kemungkinan-kemungkinan kesalahan dalam proses analisa, terutama statistical error.Untuk lebih jelasnya: Jika didapat jumlah koloni kurang dari 30 maka:

Kesalahan statistik tinggi. Sangat sensitif terhadap kontaminan (jumlah bakteri kontaminan yang tidak sengaja masuk, besar

pengaruhnya terhadap jumlah akhir koloni per cawan). Membutuhkan kerja aseptis yang lebih teliti.

solusi : memperbesar ukuran sampel. Jika didapat jumlah koloni lebih besar dari 300 maka :

Dimungkinkan ada sifat antagonisme antar spesies, misalnya bakteri A menghambat bakteri B dengan mengeluarkan metabolit tertentu (antibiotik) sehingga bakteri B tidak tumbuh sedangkan keduanya berada diposisi yang berdekatan.

Perebutan nutrisi/ kompetisi sangat tinggi yang lama-kelamaan menimbulkan keterbatasan nutrisi. Kemungkinan dua koloni bergabung menjadi satu lebih besar sehingga mengaburkan jumlah sebenarnya

karena dua koloni yang bergabung tetap dihitung satu koloni.

Memperbesar kemungkinan kesalahan (human error) dalam menghitung koloniSolusi : memperkecil ukuran sampel atau diencerkan.

Kisaran 30-300 koloni ini dijadikan titik tumpu dalam menentukan semua faktor yang mempengaruhi hasil akhir ini, seperti berapa ukuran sampel yang harus dianalisa dan metode apakah yang cocok untuk sampel tersebut.Disarankan sebelum menghitung atau menganalisa yang sebenarnya, dilakukan perkiraan (analisa pendahuluan) terlebih dahulu dengan mencoba memplatingnya pada ukuran sampel atau pengenceran yang berbeda-beda.Misalnya: Sampel X tidak dapat diperkirakan jumlah densitas selnya, tetapi sepertinya jumlah ml/cawan adalah lebih dari 300. Perlu dilakukan pemplatingan awal dahulu supaya diperoleh tingkat pengenceran yang cocok sehingga menghasilkan 30-300 koloni per cawan. Contohnya, didapatkan 10-4 yang menghasilkan koloni dengan kisaran tersebut, maka selanjutnya dengan sampel yang sama kita dapat mengulanginya dengan tingkat pengenceran yang sama (tanpa sampai pengenceran yang lebih tinggi).

Sample X diperkirakan memiliki jumlah mikroba yang sangat sedikit +/-30 koloni/100ml. Perlu dilakukan penentuan sample size yang tepat terlebih dahulu supaya dihasilkan 30-300 koloni per cawan atau paling tidak mendekati. Misal, jika dengan ukuran sampel: 100 ml dihasilkan 10 koloni, 200 ml dihasilkan 22 koloni, 500 ml dihasilkan 49 koloni,

maka sample size yang paling sesuai adalah 500 ml atau lebih. Penentuan sample size ini juga dipengaruhi sifat sampel itu sendiri dan keterbatasan metode yang dipakai. Selanjutnya dengan sampel yang sama kita dapat menganalisa dengan sample size 500 ml atau lebih. Yang dimaksud ‘mendekati’ disini adalah jika misalnya ditemukan data analisa pendahuluan seperti berikut:50 ml dihasilkan 0 koloni/cawan,100 ml dihasilkan 1 koloni/cawan,200 ml dihasilkan 5 koloni/cawan,400 ml dihasilkan 11 koloni/cawan,500 ml dihasilkan 16 koloni/cawan,

Sedangkan dengan keterbatasan metode (misalnya metode filtrasi membran tidak sanggup untuk menyedot sampel seperti air teh hasil pasteurisasi sampai lebih dari 500 ml karena akan menghambat pori pada membran tersebut sehingga membran macet) maka digunakan ukuran sampel yang paling mendekati batas bawah kisaran yaitu 30 koloni per cawan.Pemilihan metode dengan benar.Berbagai metode umum untuk uji enumerasi bakteri yang ditanamkan dalam cawan petri antara lain:

Plate count –dengan teknik penanaman spread plate dan pour plate Membrane filtration

Pemilihan metode yang benar tergantung kepada : Jenis sampel Densitas sel (perkiraan dari analisa pendahuluan) Spesifikasi standar baku / standar lolos uji

Telah diuraikan didepan bahwa sebagai patokan sebaiknya didapatkan 30-300 koloni per cawan dengan alasan utama adalah kesalahan statistik. Kita tidak perlu mengetahui secara dalam mengenai mengapa harus dalam kisaran itu, atau mengapa tidak 100-500 koloni per cawan, dan alasan-alasan berbau statistik lainnya. Namun sebagai microbiologist yang baik, seharusnya mampu memilih metode yang tepat berdasarkan acuan kisaran itu, karena kisaran 30-300 koloni ini digunakan secara internasional.Berikut adalah penjelasan singkat metode-metode beserta ukuran sampel yang disarankan:Spread plate: teknik penanaman ini didasarkan pada penyebaran sel pada permukaan agar. Volume sampel yang ditanamkan umumnya 0,1 ml pada cawan dengan diameter +/-9 cm.Jika digunakan volume:<0,1: kemungkinan kesalahannya adalah sel tidak tersebar merata (tidak tersapu oleh batang L) karena volume pelarut kurang walaupun dengan pengenceran yang tepat. Semakin kecil volume berarti semakin sedikit yang terambil oleh pipet, yang menunjukkan bahwa kesalahan teknis pemipetan semakin tinggi dan kesempatan sel yang tersebar secara acak dalam pelarut untuk terambil oleh pipet semakin tidak seragam. Selain itu juga adanya sedikit volume yang masih menempel dan tersisa (tidak ikut tertekan keluar) sangat besar pengaruhnya pada hasil yang diperoleh

0,1 ml : volume yang tepat untuk disebarkan diatas permukaan agar dan cukup mudah mengering sehingga tidak menggenangi permukaan agar. Secara peluang, sel bakteri dapat terambil dengan acak dan seragam dari tabung.

>0,1 ml : volume yang lebih besar otomatis air di permukaan agar lebih banyak sehingga sulit mengering dan dapat menyebabkan pertumbuhannya memenuhi seluruh permukaan agar karena sel dapat disebarkan oleh air (inilah kekurangan dari metode spread plate).

Penggunaan teknik penanaman ini sebaiknya dari jenis sampel yang memiliki densitas sel yang tinggi dan dengan pengenceran tertentu yang sesuai. Lebih baik tidak menganalisa jenis sampel seperti air mineral dalam kemasan dengan teknik ini karena dikhawatirkan jika terdapat pertumbuhan maka pertumbuhan tersebut kemungkinan besar adalah

kontaminan. Hal ini disebabkan oleh sedikitnya jumlah sel per satuan volum dalam air mineral tersebut, dan jika dari sekian ratus ml sampel hanya diambil 0,1 ml-nya maka secara nalar peluang untuk terambil sangat kecil. Permasalahan ini dapat dijelaskan dalam kasus berikut:

Hasil perhitungan koloni dari ilustrasi di atas adalah sangat tidak representatif dan jika tetap diambil 0,1 ml dan diplating maka kemungkinan besar adalah tidak ada pertumbuhan. Misalnya saja didapati ada pertumbuhan hanya satu koloni, maka dapat timbul pertanyaan apakah koloni ini berasal dari sampel atau kontaminan.Pour Plate : teknik pour plate adalah teknik penanaman dengan cara mencampurkan sampel yang mengandung sel mikroba dengan media pertumbuhan (agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan agar atau di dalam agar. Konsekuensinya adalah tidak semua jenis mikroorganisme dapat tumbuh di dalam agar (bersifat mikroaerofilik). Volume yang dipakai pada umumnya adalah 1-2 ml pada cawan dengan diameter 9 cm dan dengan penambahan media 5-10 ml. Sebaiknya sampel yang dipakai untuk teknik ini memiliki densitas sel > 30 sel/ml sehingga didapatkan kisaran 30-300 koloni/cawan.Jika digunakan volume:<1ml style="">spread plate semakin kecil volume berarti semakin sedikit yang terambil oleh pipet, yang menunjukkan bahwa kesalahan teknis pemipetan semakin tinggi dan kesempatan sel yang tersebar secara acak dalam pelarut untuk terambil oleh pipet semakin tidak seragam. Selain itu juga adanya sedikit volume yang masih menempel dan tersisa (tidak ikut tertekan keluar) dapat berpengaruh terhadap hasil yang diperoleh.1-2 ml : volume sampel yang cocok tentunya dengan densitas sel >30sel/ml.2 ml : semakin besar ukuran sampel maka kekuatan agar semakin berkurang dan lama memadat sehingga dapat mempertinggi resiko kesalahan teknis seperti agar jatuh ke tutup cawan. Semakin besar ukuran sampel berarti semakin kecil konsentrasi komposisi media semakin encer) dengan penambahan media yang semakin berkurang jika digunakan ukuran cawan yang sama. Selain itu, semakin besar ukuran sampel dan jika ditambah dengan volume media yang sama maka pada saat pencampuran (swirl) dapat beresiko tumpah dan membasahi celah antara tutup dan dasar cawan petri yang akhirnya mempertinggi kontaminasi karena bakteri kontaminan yang menempel pada tempat itu dapat tumbuh. Ketiga alasan inilah yang menjadi keterbatasan metode pour plate.

Teknik penanaman ini lebih tepat untuk jenis sampel yang tidak dapat untuk difiltrasi dan sulit sulit untuk diratakan di permukaan agar seperti jus buah.Lalu jika timbul pertanyaan bagaimana cara yang tepat untuk menganalisa jenis sampel jus jeruk atau jus apel hasil pasteurisasi yang diperkirakan memiliki densitas sel <10 style="">pour plate. Hal ini akan dibahas pada bagian selanjutnya.

Membrane filtration : Prinsip teknik ini adalah dengan melewatkan sejumlah volume sampel pada saringan dengan diameter pori lebih kecil dari pada sel mikroba. Hal inilah yang menjadi keterbatasan teknik filtrasi membran, dan dapat berpengaruh kepada jenis sampel dan ukuran sampel yang akan dianalisa.Beberapa pengaruh tersebut adalah:

Viskositas / kekentalan sampel : semakin kental cairan maka semakin sulit difiltrasi sehingga volume yang dibutuhkan tidak terlalu besar. Misalnya sirup, kecap, madu dll.Bahan-bahan yang terlarut dalam sampel : suatu bahan-bahan mikroskopis yang dapat menghambat pori-pori sehingga semakin sedikit jumlah pori yang dapat melewatkan larutan tersebut. Misalnya air teh, kopi dll.

Ciri-ciri dari jenis sampel yang seperti ini adalah terdapat bekas pada membran filter setelah dilakukan penyaringan.Ukuran sampel yang dipakai dalam teknik membran filtrasi tergantung kepada jenis sampel, standar lolos uji / jumlah maksimum aman, ukuran pori-pori membran filter dan acuan 30-300 koloni.-Jika akan menghitung bakteri pada sampel yang mengandung jumlah bakteri sangat tinggi: maka dapat diambil sampel dengan ukuran sampel yang kecil (misalnya 1 ml). Setelah difiltrasi maka ditambahkan air steril secukupnya (20 ml) supaya sel tersebar merata pada membran filter. Jika tidak ditambahkan air steril maka pertumbuhannya akan mengelompok di pinggir yang disebabkan oleh adanya pengumpulan air sampel pada pangkal filter funnel (corong) dan juga kemungkinan masih ada sel yang menempel pada dinding filter funnel (fungsi membilas). Selain cara tersebut sampel dapat terlebih dulu diencerkan sampai tingkat yang sesuai.

-Jika akan menghitung bakteri pada sampel yang mengandung jumlah bakteri sangat sedikit maka ukuran sampel sebaiknya diperbesar.-Jika akan menghitung bakteri pada sampel yang memiliki kekentalan yang tinggi, maka sampel dapat ditambah dengan air steril. Tujuannya yaitu menurunkan kekentalan sampel tersebut sehingga lebih mudah difiltrasi. Perhitungannya

tetap mengacu pada volume sampel yang dianalisa bukan volume total setelah ditambah air steril karena air steril ini bukan bagian dari sampel.. Studi kasus :Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air sungai / kali tercemar?Permasalahannya: air sungai memiliki perkiraan densitas sel yang sangat tinggi misalnya dapat mencapai 108sel/ml. Sampel air sungai dapat diencerkan secara bertingkat (1:9) atau yang disebut teknik gradual dilution. Dari tingkat pengenceran yang tepat dapat ditanam dengan metode spread plate, pour plate ataupun dengan teknik membrane filtrasi. Perlu diingat bahwa tetap mengacu pada kisaran 30-300 koloni per cawan sehingga misalnya pada tabung (10ml) pengenceran yang menghasilkan kira-kira 103 sel/ml, maka penanaman sebaiknya dilakukan dengan spread plate yaitu diambil 0,1 ml (didapatkan +/- 100 koloni) lalu pada tingkat pengenceran 102 sel/ml, maka penanaman sebaiknya dilakukan dengan pour plate yaitu diambil 1 ml (+/- 100 koloni), sedangkan dari tingkat pengenceran yang diperkirakan menghasilkan 10 sel/ml maka seluruh volume dalam tabung dapat difiltrasi sehingga didapatkan +/- 100 koloni. Tiap pengenceran yang tepat beserta teknik penanamannya tersebut hanyalah opsi yang dapat disesuaikan dengan tujuan dan alat yang tersedia.

Jika akan dianalisa dengan filtrasi membran dan transfer cairannya hanya 1 ml atau lebih maka sebaiknya setelah disaring, ditambahkan air steril secukupnya (+/- 20 ml) untuk menyebarkan sel-sel pada kertas membran (dapat dilihat pada gambar).

Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air mineral?Permasalahannya adalah bahwa sampel ini memiliki jumlah bakteri yang sangat sedikit yang terlarut dalam air dengan volume yang banyak.Lalu bagaimana cara menghitungnya? Air mineral dalam kemasan merk tertentu dibuat sedemikian rupa sehingga sebisa mungkin bebas dari bakteri. Perkiraan jumlah per 500 ml air adalah <10cfu, style=""> memperbanyak sel (koloni) untuk dihitung. Perhatikan ilustrasi berikut:

Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air teh dalam botol hasil pasteurisasi?Permasalahnnya hamper sama dengan menghitung mikroba pada air minum dalam kemasan yaitu jumlah bakteri yang sedikit, tapi yang menjadi titik kelemahan disini yaitu sifat dari sampel itu sendiri yang tidak dapat disaring dengan teknik filtrasi membran dalam volume yang besar. Hal ini disebabkan adanya zat-zat yang terkandung dalam teh yang dapat menghambat pori membran sehingga jika lebih dari 100ml (pada umumnya) proses filtrasi akan macet.Volumesampel yang disarankan sebaiknya dengan volumeyang besar (misalnya 500ml).

Namun dalam volume 500 ml itu disaring pada beberapa membran filter sehingga membran tidak terlalu mampat oleh zat-zat di dalam teh. Kemudian penjumlahannya tetap dijumlahkan total dari beberapa membran filter tersebut. Tidak dapat satu-satu.

Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel jus buah yang mengandung ampas buah hasil pasteurisasi?Permasalahan disini yaitu jumlah bakteri yang sangat sedikit dalam volume yang banyak dan juga adanya ampas buah yang dapat menghambat pori membran filter ataupun ujung pipet ukur.Jika dianalisa dengan teknik penanaman spread plate, maka ukuran sampel yang diambil terlalu sedikit (0,1ml) sehingga kesalahan statistiknya sangat tinggi.Jika dianalisa dengan teknik filtrasi membran, maka ampas buah dapat menghambat membran filter.Cara analisa yang tepat adalah dengan teknik pour plate, tetapi kekurangannya adalah ukuran sampel yang kecil (1 ml). Namun hal ini dapat disiasati dengan memperbesar ukuran sampel (misalnya menjadi 5 ml) dan ditambah dengan media pertumbuhan yang konsentrasinya lebih besar (misalnya 2 kali resep) sehingga saat dicampur dengan sampel maka konsentrasi media dapat menjadi 1X. Misal dalam botol 350 ml jus stroberi hasil pasteurisasi merk tertentu diperkirakan terdapat <10cfu style="">pour plate masing-masing 5 ml pada tiap cawan (d: 9 cm) dengan konsentrasi media 2X (penambahan media +/-5 ml) . Hal ini jelas membutuhkan cawan minimal 70 buah dan dengan konsumsi media yang lebih boros. Mengapa media yang ditambahkan konsentrasinya lebih besar? Karena dalam teknik yang tidak biasa ini membutuhkan sampel 5 ml, sedangkan perbandingan antara sampel dan media adalah 1:1. Jadi hal ini ditujukan untuk mengimbangi ukuran sampel yang besar sehingga konsentrasi media setelah dicampur menjadi 1X. Jika hal ini dilakukan maka akan membutuhkan teknik aseptis yang sangat teliti.

Kisaran hitung

Seperti yang sampai saat ini diketahui (dan telah dijelaskan di depan) bahwa kisaran yang paling tepat dalam menghitung koloni pada cawan adalah 30-300 koloni/cawan atau 25-250 koloni/cawan. Permulaan penentuan kisaran ini berawal dari seorang mikrobiologiwan bernama Nersser (1895) yang menyimpulkan bahwa hitungan cawan yang paling baik adalah cawan yang memiliki 10.000 koloni/cawan yang perhitungannya dilakukan dengan mikroskop pada perbesaran rendah. Tiga tahun kemudian muncul pernyataan bahwa cawan yang mempunyai koloni lebih dari 100 koloni/cawan sebaiknya diabaikan. Selanjutnya pada tahun 1897, Hill menyarankan untuk tidak menghitung cawan yang terlalu banyak jumlah koloninya (overcrowded) karena tidak memberikan hasil yang sesuai dengan kenyataan. Kemudian tahun 1908, orang yang sama menyimpulkan tentang kisaran hitung 40-200 koloni/cawan yang digunakan sebagai landasan pelaporan. Kisaran ini diterima pada Comitee Standard Method of Bacteriology Water Analysis (1915) dan diubah menjadi 30-200 koloni/cawan. Pencetus kisaran hitung 25-250 koloni/cawan dikemukakan oleh Breed dan Dotterrer pada tahun 1916 yang mempublikasikan dalam seminarnya mengenai topik ini. Mereka menentukan kisaran ini berdasarkan alasan supaya hasil perhitungannya tidak menimbulkan kesalahan statistik yang serius. Mereka juga mencatat bahwa jenis bakteri dapat mempengaruhi ukuran koloni dan jumlah koloni yang tumbuh pada cawan. Selain itu komposisi nutrisi dan jarak antar koloni juga mempengaruhi jumlah koloni per cawan karena koloni tetangga mungkin dapat menghambat pertumbuhan atau menstimulus koloni didekatnya (seperti B. bulgaricus yang distimulus oleh adanya molds). Breed dan Dotterrer memakai tiga kali plating tiap pengenceran (triplicate plating) dalam percobaanya dan memilih cawan yang masuk kisaran dari tiap pengenceran. Pada analisa ini cawan yang memiliki jumlah koloni <30 dan >400 dianggap

tidak memenuhi syarat, sedangkan cawan yang memenuhi syarat itu sendiri berjumlah antara 50 dan 200 koloni/cawan. Pencetus lainnya adalah Tomasiewicz (1980) yang menyimpulkan bahwa kisaran hitung untuk plate count dengan ulangan 3 kali (triplicate) yaitu 25-250 koloni/cawan. Kesimpulan ini didapat dari data analisa susu (raw milk) pada tiga eksperimen yang berbeda. USP (United States Pharmacopoeial) merekomendasikan untuk menggunakan kisaran hitung antara 25 dan 250 koloni/cawan untuk bakteri pada umumnya dan Candida albicans. Sedangkan kisaran yang disarankan jika menganalisa jumlah Aspergillus niger adalah 8-80 koloni/cawan. ASTM (American Standard Testing and Methods) menyarankan untuk menggunakan ksiaran hitung 20-80 koloni/membran jika menggunakan teknik filtrasi membran, 20-200 koloni/cawan untuk spread plate dan 30-300 koloni/cawan untuk pour plate. FDA BAM (Food and Drug Administration, Bacteriological Analytical Manual) merekomendasikan 25-250 koloni/cawan sebagai kisaran hitung secara keseluruhan.

Batas atas kisaran hitung. Istilah untuk menggambarkan jumlah koloni yang melebihi batas atas kisaran hitung adalah TNTC (Too Numerous To Count). ASTM menyarankan untuk melaporkan TNTC sebagai lebih besar dari batas atas, misalnya >200 CFU pada cawan dari pengenceran 1/10, maka pelaporannya adalah >2000 CFU/ml(g). Penjelasan logika mengenai alasan adanya batas atas kisaran hitung dapat diperhatikan pada gambar berikut.

Kenapa pada pengenceran 1/10 jumlah koloni yang diamati lebih kecil dari pada jumlah koloni yang sebenarnya dalam satuan volum yang sama?. Hal ini karena pertumbuhan koloni yang terlalu penuh/banyak dalam cawan dengan diameter yang sama. Seperti yang telah dikemukakan bahwa semakin banyak koloni yang tumbuh pada permukaan agar, maka antar koloni dapat saling mempengaruhi baik menekan atau menstimulus pertumbuhan koloni tetangganya dan juga perebutan nutrisi dan tempat yang semakin ketat. Oleh karena itulah banyak koloni yang “hilang” sehingga menampakkan pengurangan koloni yang muncul pada cawan. Alasan inilah yang membatasi kisaran hitung pada 250 atau 300 koloni

 Batas bawah kisaran hitung

Titik konsentrasi pada batas bawah kisaran hitung ini berada pada pelaporan Limit of detection / LOD (1 CFU) dan Limit of Quantification / LOQ (<25CFU atau <30CFU). LOD adalah jumlah minimum koloni yang dapat dibedakan dari ketidakadaan. Sedangkan LOQ adalah suatu batas jumlah koloni yang cukup/pantas untuk dapat dihitung dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima. Di dalam teknik plate count secara sederhana dapat dijelaskan sebagai berikut: LOD menggambarkan ada atau tidak adanya sel mikroorganisme dalam suatu sampel, tapi pada konsentrasi ini, sampel sangat mungkin mengandung kontaminan (ketidakmurnian) dan terdapat separuh kemungkinan untuk bernilai nol dan separuh kemungkinan untuk bernilai 1. sedangkan LOQ menggambarkan batas yang memberikan kemungkinan minimal untuk salah memperkirakan jumlah sel yang sebenarnya dalam suatu sampel. Jika jumlah koloni >LOD dan LOQ dan >LOD.  

Hal ini sangat penting jika kita menganalisa sampel dengan spesifikasi pada kisaran yang kurang dari batas bawah kisaran hitung. ASTM menyarankan supaya analis melaporkan <1 CFU/ml jika tidak ada pertumbuhan pada cawan dalam suatu pengenceran. Misalnya <10 CFU/ml untuk pengenceran 1/10. angka <1 didapatkan dari LOD yaitu 1 CFU.

FDA BAM menyarankan jika menghitung di bawah batas bawah kisaran hitung maka dilaporkan sebagai  

Jika kita melaporkan perhitungan cawan yang memiliki jumlah koloni <25, maka analisa ini mempunyai tingkat akurasi yang rendah. Secara teoretis jika jumlah koloni /cawan dibawah 25 maka kesalahan statistik yang digambarkan dalam persentase mean akan meningkat pesat karena estimasi kesalahan (error) adalah akar kuadrat dari mean sehingga nilai persentase mean akan seperti pada grafik diatas (grafik derajat kesalahan pada jumlah koloni yang rendah).

Cara menghitung Khusus untuk spread plate (aerobic plate count).

1.Dipilih cawan yang mempunyai koloni 25-250 koloni atau 30-300 koloni. Lalu dihitung dengan rumus : 

Pada contoh 2 ini tidak dapat dimasukkan ke dalam rumus karena terdapat kesalahan dalam tekniki menganalisanya. Pada rumus terdapat n1 dan n2. kenapa tidak ada n3? Karena setiap pengenceran diencerkan 1/10-nya sedangkan kisarannya adalah 25-250 koloni. Pada kasus diatas pada pengenceran 1/100 (250) diencerkan 1/10-nya didapat 181. seharusnya sekitar 25 koloni, sehingga tidak mungkin ada n3. 2. Jika dijumpai cawan yang memiliki koloni diluar kisaran 25-250 maka dipilih cawan yang mempunyai jumlah koloni yang paling mendekati.  

Jika dijumpai cawan dengan jumlah koloni <250 maka dipilih cawan yang berjumlah paling mendekati batas atas kisaran tersebut.

*EAPC (Estimated Aerobic Plate Count) atau jumlah yang diperkirakan. 3. semua cawan yang memiliki pertumbuhan koloni yang menyebar di permukaan agar dilaporkan sebagai koloni menyebar (spreader/ SPR) atau kecelakaan laboratorium (Lab Accident/ LA).

Semua cawan yang memiliki koloni rata-rata 100CFU/cm2 dilaporkan dengan perkiraan lebih besar dari 100 kali dari tingkat pengenceran tertinggi

Tata cara diatas digunakan khusus untuk plate count dengan teknik spread plate atau yang disebut Aerobic Plate Count. Untuk teknik plating dengan pour plate atau filtrasi membran pada dasarnya prinsip-prinsip mengenai perhitungannya adalah sama, hanya disesuaikan dengan kisaran hitung yang telah dipersyaratkan.

Pembulatan dan merata-ratakan.

Pembulatan diperlukan jika dijumpai hasil perhitungan dengan tiga digit angka signifikan. Menurut USP dan ASTM, pembulatan dibulatkan keatas jika digit ketiga adalah ≥5 dan pembulatan dibulatkan ke bawah jika digit ketiga adalah <5. Sedangkan menurut BAM dibulatkan ke atas jika digit ketiga ≥6 (6,7,8,9) dan dibulatkan ke bawah jika ≤4 (4,3,2,1). Bila digit ketiga adalah 5 maka dibulatkan ke atas jika digit kedua adalah ganjil dan dibulatkan ke bawah jika digit kedua adalah genap.

TEKNIK MEMBRAN FILTER UNTUK MENGHITUNG MIKROBA

PendahuluanTelah banyak ulasan populer mengenai teknik filtrasi membran yang dikemukakan di berbagai sumber, tetapi masih jarang dijumpai pembahasan secara menyeluruh yang berbahasa indonesia. Oleh karena itu, posting ini hadir untuk melengkapi kekurangan tersebut. Pada tulisan kali ini, penulis lebih menitikberatkan pembahasan pada teori dan teknik yang sebagian besar diperoleh berdasarkan pengalaman tanpa banyak didukung sumber bacaan. Ulasan yang bukan karya tulis ini berpegang pada nalar analitis proses dan sedikit kepada pengalaman orang lain yang lebih dulu (referensi) sehingga masih sangat banyak membutuhkan penambalan di berbagai bagian dari para ahli. Masukan yang bersifat membangun atau mengkritisi akan dijadikan bahan pertimbangan yang sangat berharga. Tulisan ini lebih bertujuan untuk membantu mikrobiologiwan yang baru mengenal atau belum berpengalaman mengenai teknik filtrasi membran. Semoga dapat membantu.

Dasar teoriBanyak metode yang tersedia untuk menghitung mikroba, salah satu metode yang praktis adalah teknik filtrasi membran. Teknik filtrasi membran banyak dipakai di berbagai perusahaan makanan, minuman, farmasi dan kosmetik untuk mengontrol jumlah mikroba pada produk atau tahap potensial lainnya.

Teknik filtrasi membran yang juga dikenal sebagai molekular filter adalah metode yang mampu memisahkan antara partikel ukuran tertentu (ukuran sel bakteri) dengan sejumlah besar cairan. Sejarah metode ini dikembangkan oleh Geotz dan Tsuneishi pada tahun 1951. Filtrasi membran diperkenalkan sebagai metode alternatif pengganti MPN yang mampu mengisolasi koloni yang berbeda, sedangkan MPN hanya memperkirakan jumlah yang diindikasikan dengan adanya perubahan pada media

Prinsip teknik filtrasi membran ini adalah dengan menyaring cairan sampel melewati saringan yang sangat tipis dan yang terbuat dari bahan sejenis selulosa. Membran ini memiliki pori-pori berukuran mikroskopis dengan diameter lebih kecil daripada ukuran sel mikroba pada umumnya. Jadi selama proses penyaringan berlangsung, sel-sel yang terdapat pada sampel akan terjebak pada permukaan membran yang relatif luas. Selanjutnya membran dipindahkan secara aseptis dari peralatan filtrasi ke dalam cawan petri berisi media. Kertas membran ini bersifat solid sehingga dapat menahan sel yang terjebak tetap pada posisinya dan kemudian dapat berkembang tanpa bercampur dengan sel lain yang ikut terjebak juga. Nutrisi yang terdapat pada media akan berdifusi dan terserap kedalam kertas membran sehingga sel-sel yang tersebar acak dan kasat mata itu dapat tumbuh menjadi koloni yang dapat dihitung dengan mata telanjang setelah melewati masa waktu inkubasi tertentu. Bentuk, warna dan sifat lain dari masing-masing koloni tergantung kepada jenis mikroba yang berada pada kertas membran.

Kelebihan teknik filtrasi membran dibanding metode lain adalah.Dapat menganalisa sampel dengan volume yang besar dalam waktu yang singkat yang dibatasi oleh kekentalan dan kekeruhan cairan sampel.Dapat menganalisa sampel dengan jumlah mikroba yang sedikit (peningkatan keakuratan pendeteksian mikroba).Inhibitor pada sampel yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba seperti antibiotik, klorin atau zat pengawet dapat terbilas. Pada umumnya cawan yang digunakan berukuran kecil (50mm) sehingga dapat menghemat penggunaan media dan tempat pada inkubator.Praktis dalam preparasinya, dapat dilakukan berulang kali penyaringan (melipatgandakan cabang corong) dan reprodusibel.Sangat cocok untuk mikroba aerob (jika dibandingkan dengan pour plate) yang sebagian besar menjadi faktor pengontaminasi yang penting pada produk industri.Melalui proses pengeringan tertentu, kertas membran yang telah ditumbuhi koloni dapat dijadikan dokumen atau data permanen demi kepentingan perekaman data.Sedangkan kekurangan teknik ini adalah.Kurang cocok untuk menghitung sampel dengan jumlah mikroba yang terlalu pekat walaupun pengenceran dapat dilakukan dengan pengenceran bertingkat.Beberapa jenis mikroba yang berdiameter lebih kecil dari pori seperti Rickettsia dan Mycoplasma mampu lolos dari pori kertas membran. Kurang praktis untuk menghitung mikroba mikroaerofilik atau anaerob (kecuali dengan perlakuan tertentu).Sulit untuk menghitung mikroba pada sampel yang berampas atau memiliki banyak partikel (kekeruhan tinggi) karena partikel tersebut akan menyumbat pori-pori kertas membran.Sulit untuk menghitung mikroba pada sampel dengan kekentalan yang tinggi karena membutuhkan waktu penyaringan yang lama.

Selain digunakan untuk menghitung bakteri, teknik filtrasi membran dalam mikrobiologi digunakan juga untuk proses sterilisasi secara mekanis (dengan penyaringan). Prinsipnya sama, yaitu menyaring suatu cairan non steril dengan kertas membran sehingga cairan yang melewatinya akan terbebas mikroba (steril). Pada umumnya bahan yang disterilkan melalui cara ini adalah bahan yang mengandung senyawa tidak tahan suhu tinggi atau tekanan tinggi seperti serum darah, antibiotik, glukosa dll. Perbedaannya adalah terletak pada kepentingannya. Jika untuk tujuan sterilisasi maka cairan hasil filtrasi harus dijaga kesterilannya dengan menyediakan tempat dan tutup yang steril dan kertas membran tidak ditanam ke dalam media melainkan dibuang. Berikut adalah gambar peralatan filtrasi yang dapat digunakan untuk sterilisasi ataupun menghitung mikroba.

Jika dibandingkan dengan metode penghitungan lain seperti spread plate, pour plate, spiral plate, atau MPN, metode ini memiliki perbedaan yang mencolok yaitu kemampuannya menganalisa sampel dengan volume besar dan keakuratan pada jumlah mikroba yang sedikit. Spread plate memiliki batas volume sampel 0,5 ml sedangkan pour plate 2 ml. Keunggulan inilah yang melatarbelakangi pemilihan metode ini untuk jenis sampel yang cocok. Pada tahun 1978 U.S. EPA merekomendasikan bahwa teknik membran filtrasi digunakan untuk monitoring air karena keunggulannya tersebut. Untuk perbandingan lebih detail antar metode penanaman dapat dilihat pada PRINSIP DASAR TEORI MENGHITUNG MIKROORGANISME PADA CAWAN .

Terdapat beberapa variasi penyiapan media yang digunakan pada teknik ini tetapi pada prinsipnya sama saja. Perbedaannya yaitu (1). Media agar yang dituang ke cawan petri kosong dan dibiarkan memadat. (2). Media broth yang dituang ke absorbent pad (semacam kertas isap). (3). Air steril yang ditambahkan ke absorbent pad yang mengandung media yang dikeringkan (dehydrated) yang produknya disebut Nutrient Pad Set (NPS). (4). Media yang ditambahkan dari atas setelah filtrasi yang disedot dengan pompa vakum yang disebut dengan metode filtrasi membran monitor. Metode yang terakhir ini lebih tidak time-consuming karena hanya perlu ditambahkan sampel dan media tanpa merakit peralatan filtrasi.

Banyak tersedia jenis media pertumbuhan untuk metode filtrasi membran dengan tujuan menghitung bakteri heterotrof (total count) seperti MTGE, m-HPC Agar, Standard Methods Agar dll. Selain itu untuk menghitung bakteri kelompok tertentu atau mikroba jenis tertentu membutuhkan media pertumbuhan yang spesifik seperti endo, chromocult, untuk coliform. Berikut beberapa jenis media pertumbuhan berdasarkan tujuannya beserta waktu dan suhu inkubasinya.

Total Count:R2A (48-72 jam pada 35 + 0.5°C atau 5-7 hari pada 20-28 C), Yeast extract (44 ±4 jam pada 36 ±2°C atau 68 ±4 jam pada 22 ±2°C)Standard TTC (48 jam pada 30 °C).Standard methods agar (48-72 + 2 jam pada 35°C)m-HPC agar (48-72 + 2 jam pada 35°C)Soybean-Casein Digest Medium (24–72 jam pada 30°C–37°C)

Coliform dan E. coli:Chromocult (24 jam pada 36 ±1°C)Endo (24 jam pada 37°C)Teepol (18–24 jam pada 37°C)MacConkey (18–24 jam pada 37°C)Tergitol TTC (20 ±4 jam pada 37°C)

Yeast and molds:Schaufus-Pottinger (2–3 hari pada 28–30°C)Sabouraud (2–5 hari pada 25–30°C)Wort (2–3 hari pada 25°C)Malt extract (2–3 hari pada 25–30°C)

Bakteri fekal :Azide (24–48 jam pada 37°C)Bismuth-Sulfite (18–48 jam pada 37°C)

Bakteri non fekal:Chapman(48 jam pada 37°C)Cetrimide (48 jam pada 37°C)

Ketepatan pemilihan kertas membran juga perlu dipertimbangkan demi kenyamanan mata dalam menghitung. Mikroba yang dimungkinkan tumbuh sebaiknya mempunyai kekontrasan dengan warna kertas membran sebagai latar belakang. Beberapa warna umum kertas membran yang tersedia adalah hijau, putih, abu-abu, hitam dengan warna garis-garis (grid) kontras dengan warna kertas membran. Setiap warna memiliki tujuannya masing-masing. Warna hijau cocok untuk menghitung mikroba yang memiliki koloni putih, transparan, atau berwarna. Lagipula sangat jarang terdapat bakteri yang memiliki warna koloni hijau, karena sebagian besar bakteri yang menyebabkan pembusukan adalah heterotrof, bukan autotrof (yang memiliki klorofil) kecuali koloni yang tumbuh pada media yang diberi zat warna atau indikator hijau seperti schauffus pottinger m-green yeast and mold media. Jadi warna hijau adalah warna yang cocok untuk total count dan dengan media tanpa zat warna. Kertas membran warna gelap (hitam) cocok untuk menghitung koloni yeast dan mold yang sebagian besar berwarna terang. Kertas membran warna putih digunakan untuk menghitung koloni yang tumbuh pada media yang ditambah pewarna (dye), misalnya kertas membran putih diletakkan pada media endo berwarna merah muda, maka E.coli (green metalic sheen) yang terdeteksi akan terlihat nyata.

Kunci keunggulan dari teknik filtrasi membran terletak pada keistimewaan kertas membran yang memiliki pori-pori lebih kecil dari benda yang disaring dan hanya mempunyai tebal 0,1mm ini. Ukuran pori-pori kertas membran yang tersedia adalah 0,2um, 0,45um, 0,65um, 0,8um, dan 1,2um. Jika tujuan analisa untuk menyaring sel bakteri, maka digunakan kertas membran dengan pori 0,45um, tapi jika bertujuan untuk menyaring spora jamur dan sel ragi maka cukup dengan pori 0,65um. Pemilihan pori kertas membran yang cocok berkorelasi dengan rata-rata diameter sel mikroba yang diinginkan. Umumnya kertas membran terbuat dari senyawa selulosa, misalnya selulosa nitrat, selulosa asetat, campuran ester selulosa nitrat dan selulosa asetat, selulosa murni, atau polimer lain seperti polikarbonat (polimer plastik), poliamida dll. Setiap bahan memiliki kelebihan tersendiri dan fungsi yang lebih khusus. Bahan yang paling umum diapakai dalam mikrobiologi adalah selulosa nitrat. Bahan kertas membran dari selulosa bersifat hidrofilik, rusak jika terkena zat volatil seperti alkohol dan tidak tahan suhu tinggi.

Berikut adalah hubungan antara ukuran pori kertas membran dengan ukuran sel berbagai macam jenis mikroba.

Pengenalan peralatan pada teknik filtrasi membranPada dasarnya alat dan bahan utama yang dibutuhkan untuk teknik filtrasi membran adalah:Corong – untuk menampung cairan sampelTutup corong – untuk mencegah kontaminasi sekunder atau kontaminasi dari udaraDasar corong – sebagai dasar penyangga corong dan tempat peletakan kertas membranCawan petri dan media – sebagai sumber nutrisi Labu penghisap / penampung – tempat untuk menampung cairan hasil penyaringanPompa vakum – alat untuk menurunkan tekanan Selang / pipa – sebagai penyalur cairan atau udara antar bagianKertas membran – alat penyaringPinset – menjepit kertas membranDan alat lain untuk mendukung proses kerja aseptik

Misal produk dari Sartorius dapat terdiri dari: -Stainless steel funnel (corong).-Single base / filter base (dasar corong).-Lid dan gasket (tutup dan karet).-Manifold (filtrasi bercabang).-Suction flask (labu pengumpul).-Gridded membrane filters (kertas membran berskala).-Water trap (alat pencegah masuknya air ke dalam pompa vakum).

4. Cara kerja Sterilisasi alat Membuat media atau menambahkan air pada NPS Merakit peralatan Melepas kertas membran dan memasangnya Menuang sampel Penyedotan pompa vakum Pembilasan corong Peletakan kertas membran pada cawan Inkubasi cawan Sanitasi peralatan Hasil inkubasi

5. Permasalahan yang umum terjadi Pertumbuhan spreader atau koloni yang melebar TNTC (Too Numerous To Count) Koloni terkumpul di pinggir atau suatu tempat Terdapat gelembung pada kertas membran Membran terangkat dan terlipat Terdapat pertumbuhan di luar bekas corong dan pinset Inkubasi terlalu lama Cairan sampel yang kental sulit tersedot Tetesan air yang jatuh

Cara kerjaGambar tahap-tahap prosedur teknik filtrasi membran adalah

1. Sterilisasi dasar corong dan corong menggunakan bunsen 2. Mengeluarkan kertas membran dari pembungkus. 3. Meletakkan kertas membran pada dasar corong. 4. merakit peralatan dengan memasang corong pada dasar corong. 5. Membuka 6. Menuang sampel dan menyalakan pompa vakum. 7. Melepaskan corong 8. Mengangkat kertas membran ke dalam cawan. 9. Menginkubasi cawan pada suhu dan waktu yang tepat.

Sterilisasi alat

Setelah prosedur permulaan kerja aseptik dilaksanakan, alat-alat filtrasi seperti manifold, funnel, single base, dan lid (semuanya terbuat dari stainless steel) sebaiknya disterilisasi terlebih dahulu. Cara sterilisasi yang utama dapat menggunakan autoklaf, tetapi jika dipakai berulang kali maka dapat disterilisasi dengan dibakar. Caranya yaitu dapat dibakar langsung dengan pembakar bunsen atau disemprot alkohol terlebih dahulu lalu dibakar. Diharap sangat hati-hati jika melakukan sterilisasi dengan cara ini. Terdapat alternatif lain yang lebih aman yaitu hanya disemprot alkohol saja atau direndam dalam air panas, tapi cara ini lebih rendah tingkat sterilitasnya dibanding dengan dibakar. Bagian-bagian yang lebih diutamakan kesterilannya adalah muka single base/filter base yang akan ditempeli kertas membran dan bagian dalam funnel yang akan kontak dengan sampel. Membuat media atau menambahkan air pada NPSSeperti yang telah diuraikan diatas, preparasi media yang sesuai dapat dipilih sesuai dengan kebutuhan dan keadaan. Hasil penuangan media agar seharusnya memiliki permukaan yang rata supaya kertas membran dapat merekat sempurna di permukaan agar. Penambahan air steril atau media cair pada absorbent pad atau Nutrient Pad Set (NPS) mengikuti petunjuk produk. Volume media yang cukup dicirikan dengan adanya sedikit lingkaran air atau media yang lebih disekeliling pad yang mendukung suplai air selama masa inkubasi. Selain itu hal ini dapat mempermudah menempelnya kertas membran di permukaan pad yang basah. Jumlah media cair yang berlebih dikhawatirkan dapat mengalir ke permukaan kertas membran dan menghasilkan koloni spreader.Merakit peralatan

Saat merakit peralatan filtrasi sebaiknya menggunakan penjepit atau semacamnya untuk mengurangi resiko kontaminasi dan panas setelah sterilisasi. Jika dengan tangan pastikan kebersihan tangan dengan alkohol. Terlalu ketat penjepitan kertas membran dapat mengakibatkan sobeknya kertas membran saat diangkat dan menimbulkan bekas cekungan yang dalam. Pastikan semua peralatan (corong dan dasar corong) benar-benar bebas dari alkohol karena sedikit alkohol dapat mengubah integritas struktur kertas membran sehingga menjadi mengkerut atau melengkung.

Melepas kertas membran dan memasangnyaMengingat kertas membran yang digunakan bersifat hidrofilik maka dasar corong yang kering (setelah sterilisasi panas) sebaiknya dibasahi dengan air steril supaya kertas membran lebih mudah ditempelkan. Hal ini seperti menempelkan kertas buram pada meja yang berair. Menuang atau menambahkan sampel

Cairan sampel dapat dituang langsung dari botol atau wadah jika volumenya cukup besar, tetapi jika dibutuhkan misalnya sampel 1-10ml disarankan menggunakan mikropipet non-fix (1-10ml) supaya volume yang terambil benar-benar presisi. Biasanya pada corong telah tertera skala volume. Lebih baik tidak menggunakan spoon (fix volume; 5ml, 10ml, 20ml) dalam penuangan sampel karena lebih beresiko untuk bertambah atau berkurangnya volume sampel. Semakin kecil pengambilan sampel dengan spoon maka semakin tidak akurat volume yang terambil. Sebaiknya menghindari pengambilan sampel dibawah 1ml karena dapat mempertinggi tingkat kesalahan penuangan (penyebaran acak atau kehomogenan sel dalam sampel kurang seragam). Biasanya jarang dijumpai persyaratan yang memerintahkan pengambilan sampel dibawah 1ml karena lebih dipilih diencerkan terlebih dahulu lalu diambil volume sampel yang cukup besar atau menggunakan penanaman pour plate atau spread plate. Jika sampel yang ditambahkan sedikit dan direncanakan tidak akan dibilas maka penuangan harus langsung mengenai kertas membran, jangan dialirkan melewati corong. Jika sampel yang ditambahkan terlalu banyak (misalnya 500ml) dan bila tersaring semua dimungkinkan dapat menyebabkan tersumbatnya ppori kertas membran, maka penuangan sampel dapat dibagi menjadi dua atau tiga pada corong yang berbeda sehingga perhitungannya tetap dijumlahkan dari seluruh cawan yang ada.

Penyedotan pompa vakumPompa vakum bekerja mengurangi tekanan udara dalam selang dan bagian dalam peralatan filtrasi sehingga air sampel pada corong tersedot dan ditampung pada labu pengumpul. Perlu diperhatikan bahwa saat saklar pompa dimatikan, tekanan dalam ruang tertutup itu masih lebih rendah dari pada ruangan sehingga udara masih tetap tersedot walaupun semua sampel telah berada pada labu pengumpul. Selain itu biasanya tekanan di dalam masih tetap rendah saat semuanya selesai dan mengakibatkan tersedotnya udara yang menimbulkan bunyi (proses menyamakan tekanan) saat kertas membran diangkat dari dasar corong. Jika pada manifold dilengkapi dengan tuas (semacam kran) untuk membuka dan menutup udara, maka lebih baik udara ditutup terlebih dahulu kemudian dibuka setelah kertas membran diletakkan pada cawan supaya tekanan menjadi sama. Pembilasan corongPembilasan corong dengan air steril dilakukan untuk memastikan tidak ada mikroba yang tidak tersaring terutama untuk analisa dengan kisaran jumlah mikroba yang sedikit walaupun hal ini meningkatkan resiko kontaminasi dari air

steril tersebut. Pembilasan lebih disarankan pada penuangan volume sampel yang sedikit, misalnya 5ml. Selain itu penambahan air steril dapat bertujuan untuk mengencerkan kekentalan sampel. Volume air steril yang ditambahkan tidak mempengaruhi hitungan atau pengenceran apapun yang dilakukan dan jumlahnya hanya berhubungan dengan seberapa efisien untuk membilas sel-sel yang masih menempel pada permukaan corong. Biasanya ditambahkan 20 ml air steril atau larutan fisiologis. Peletakan kertas membran pada cawanSupaya udara tidak terjebak diantara kertas membran dan pad maka penempelan atau peletakan kertas membran dilakukan dengan hati-hati dari ujung. Jika gelembung udara terbentuk maka sebaiknya dihilangkan dengan pinset.Inkubasi cawan

Cawan dengan absorbent pad sebaiknya diinkubasi dengan posisi absorbent pad dibawah (jangan dibalik). Hal ini bertujuan supaya kelebihan air (media) tidak turun ke tutup cawan yang dapat mengurangi pasokan media ke absorbent pad atau mengakibatkan kontaminasi, tujuan yang kedua agar kertas membran tidak jatuh saat media sudah mulai mengering terutama untuk inkubasi yang membutuhkan waktu berhari-hari.

Sanitasi peralatan

Sanitasi perlu dilakukan terutama setelah menganalisa dengan sampel yang mengandung gula atau nutrisi lain. Biofilm yang dapat terbentuk pada peralatan filtrasi, selang dan labu pengumpul dapat meninggikan resiko kontaminan saat dipakai. Pembilasan dengan air atau agen pembersih bisa dilakukan dengan melewatkannya ke dalam jalur yang dilewati sampel atau dapat juga dicuci secara manual.

Hasil inkubasi

Hasil pertumbuhan yang baik dicirikan dengan pertumbuhan koloni yang acak tersebar merata, tidak ditemukan kontaminan, dan memenuhi kisaran hitung per cawan. Jumlah maksimal koloni per cawan yang diizinkan meurut ASTM (American Standard Testing and Methods) pada metode filtrasi membran adalah 20-80 koloni. Hal ini menyesuaikan dengan ukuran kertas membran yang kecil (47mm) lain halnya bila mengingat batas atas kisaran hitung (300 koloni) karena kisaran ini untuk cawan berdiameter 9 cm. Sedangkan menurut HPA (Health Protection Agency) dengan volume sampel 100ml, jika tidak ada pertumbuhan maka dilaporkan sebagai 0 CFU/100ml dan jika terdapat lebih dari 100 koloni maka dilaporkan >100CFU/100ml. Jadi batas tertinggi perhitungan adalah 100 koloni dan batas terendah adalah <1 (0). Cara menghitung koloni adalah dengan memanfaatkan transek yang terdapat pada kertas membran dengan pola zig-zag (seperti gambar) dengan Colony Counter dengan perbesaran 4x. Permasalahan yang umum terjadi Pertumbuhan spreader atau koloni yang melebar

Seharusnya setelah filtrasi selesai semua cairan sampel telah tersedot dari kertas membran tetapi beberapa faktor dapat menyebabkan air sedikit tertinggal di permukaan kertas membran. Lapisan air yang tipis saja dapat meyebarkan sel yang sedang memperbanyak diri dan saat air tersebut kering selama proses inkubasi, sel-sel (dari satu CFU) telah tersebar dan menghasilkan koloni yang spreader. Koloni yang melebar karena lapisan air ini dapat menutupi sebagian atau seluruh permukaan kertas membran tergantung banyak sedikitnya air dan seberapa cepatnya menguap. Pola lain yang sering dijumpai adalah adanya lapisan tipis air yang berkumpul pada cekungan (bagian yang tidak rata dari kertas membran) akibat perlakuan tertentu atau sebab lain. Misalnya, ditemui koloni yang tumbuh pada bekas penjepitan corong atau koloni yang mengikuti pola garis-garis/grid (bentuk ini bukan karena sifat tepi koloni yang seperti itu). Hasil pertumbuhan spreader dapat dihindari dengan memastikan cairan benar-benar kering dari kertas membran setelah difiltrasi atau jangan menambahkan media cair terlalu banyak,TNTC (Too Numerous To Count)

Kondisi terlalu banyak untuk dihitung menggambarkan bahwa semakin besar kesalahan saat menghitung jika tetap dipaksakan untuk menghitung. Hal ini mungkin bukan suatu kesalahan jika suatu requirement memerintahkan penuangan sampel sebanyak 50ml lalu dihasilkan koloni TNTC. Namun lebih baik dihasilkan cawan yang memenuhi kisaran hitung sehingga dapat diketahui jumlah mikroba secara pasti dan terpercaya berdasarkan statistik. Semakin banyak koloni yang tumbuh maka kompetisi mendapatkan nutrisi dan ruang juga semakin terbatas. TNTC dapat dihindari dengan mengencerkan sampel atau menyedikitkan volume sampel.

Terdapat gelembung pada kertas membran

Gelembung yang terperangkap saat meletakkan kertas membran dapat membiaskan jumlah koloni yang sebenarnya. Kontak kertas membran dengan media sangat berpengaruh kepada distribusi nutrisi sehingga pertumbuhan koloni akan lebih lambat atau tidak ada sama sekali. Hasil ini jelas tidak diinginkan dan dapat diatasi dengan menghilangkan udara yang terperangkap saat penempelan kertas membran pada cawan.Membran terangkat dan terlipat

Kertas membran yang terlipat terjadi karena kesalahan saat meletakkan pada cawan dengan pinset. Proses penggeseran kertas membran dapat dilakukan dengan menariknya bukan mendorongnya. Lain halnya dengan kertas membran yang terangkat, kejadian ini dimungkinkan karena sedikitnya cairan media sehingga saat kertas membran diletakkan tidak semua permukaan terbasahi kemudian selama waktu inkubasi, kertas membran mudah kering pada bagian yang

mengandung air lebih sedikit. Sebab lain adalah karena terdapat sedikit alkohol pada dasar corong sehingga dapat menggulungkan kertas membran.Koloni tersebar tidak merata (terkumpul di pinggir atau disuatu tempat)

Koloni yang terkumpul di pinggir kertas membran mengikuti alur bekas corong dikarenakan sampel yang ditambahkan sedikit. Pada saat penambahan sampel (misalnya 1ml), air yang memiliki daya adhesi akan cenderung untuk menempel di sudut corong dan membawa sebagian besar sel-sel mendekati corong. Bila tidak dibilas dengan air steril maka hasil pertumbuhan koloninya menjadi demikian. Jika menjumpai pola pertumbuhan koloni yang terkumpul disuatu tempat dan tidak tersebar merata maka dikarenakan sampel kurang homogen. Semua permasalahan ini dapat diatasi dengan membilasnya setelah difiltrasi.

Terdapat pertumbuhan di luar bekas corong dan bekas pinset

Kontaminasi yang dapat terdeteksi pada metode ini umumnya berada diluar bekas corong atau bekas pinset. Jika koloni kontaminan tumbuh pada kertas membran dalam area corong maka tidak dapat dibedakan dengan sel yang berasal dari sampel. Tidak sempurnanya sterilisasi pinset dan bagian bawah corong yang kontak dengan kertas membran dapat menyebabkan kontaminasi ini.

Inkubasi terlalu lama

Penentuan waktu inkubasi umumnya telah disesuaikan berdasarkan jenis media dan mikroba yang dimungkinkan tumbuh. Namun bila terjadi proses inkubasi yang terlalu lama maka pertumbuhan koloni menjadi terlalu besar dan bersinggungan sehingga mempersulit perhitungan. Inkubasi yang sesuai menghasilkan koloni-koloni yang diameternya cukup terlihat dan tersebar merata. Jangan menghitung sebelum waktunya (saat koloni masih terlalu kecil) karena dikhawatirkan terdapat beberapa koloni yang belum terlihat tumbuh.

Cairan sampel yang kental sulit tersedot

Sering kali sampel yang kekentalannya atau kekeruhannya tinggi menyebabkan macet (sampel tidak dapat tersedot lagi) dan memperberat kerja pompa vakum karena tekanan didalam ruang terlalu kecil. Cairan yang kental seperti sirup akan sulit mengalir melewati pori membran karena zat terlarutnya lebih besar dari pada pelarutnya. Salah satu cara menanggulanginya adalah dengan memperhitungkan jumlah maksimal sampel yang ditambahkan atau ditambah air steril. Penambahan berapapun air steril tidak mempengaruhi perhitungan koloni atau pengenceran yang dilakukan karena diasumsikan air steril tidak mengandung bakteri. Jika sampel sudah benar-benar tidak dapat lagi tersedot maka proses filtrasi gagal dan sebaiknya diulang dengan menyesuaikan sampel. Cairan yang kental sering sulit tersedot sampai habis dan masih meninggalkan sedikit lapisan dan dikhawatirkan menghasilkan koloni spreader.

Tetesan air yang jatuh

Bagi mata yang kurang terlatih tetesan air yang mirip koloni dapat menipu, apalagi jika jumlah mikroba yang tumbuh diperkirakan sedikit. Biasanya pengembunan yang terjadi pada tutup cawan dapat mengalir kesamping saat cawan dalam posisi miring, tetapi (entah bagaimana) adakalanya tetesan jatuh pada kertas membran. Namun terdapat jenis bakteri yang mempunyai bentuk koloni seperti tetesan air, untuk memastikannya dapat disentuh dengan pinset.

3. Sebutkan sifat – sifat umum suatu koloni dan sebutkan sifat – sifat khusus koloni pada medium padat, medium cair ?

BakteriA. Mengamati Morfologi Koloni BakteriKegiatan ini merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis bakteri lebih lanjut, khususnya untuk tujuan identifikasi. Setelah mendapatkan kultur murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk dikenali ciri koloninya.Cara Kerja :· Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran· Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang tegak lurus· Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stab inoculation· Tumbuhkan biakan pada media NBA.1. Pertumbuhan pada Cawan PetriCiri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :· Ukuran; pinpoint/punctiform (titik)Small (kecil)Moderate (sedang)Large (besar)· Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler, beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media· Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni.Opaque (tidak dapat ditembus cahaya), Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian), Transparant (bening)

· Bentuk : Circular Irregular Spindle FilamentousRhizoid- Elevasi :FlatRaisedConvexUmbonate

· Permukaan : Halus mengkilapKasarBerkerutKering seperti bubuk· Margins :

EntireLobateUndulateSerrateFelamentousCurled

A.2. Pertumbuhan pada Agar MiringCiri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurusCiri koloni berdasarkan bentuk:

A.3 Pertumbuhan pada Agar TegakCara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam media agar tegak.Ciri-ciri koloni berdasar bentuk :

Ciri koloni berdasar kebutuhan O2 :

A.4 Pertumbuhan pada Media CairPola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2

Berikut merupakan beberapa contoh hasil koloni tunggal.

5. Apa beda gelatin dengan agar, jelaskan dengan menumbuhkan bakteri ?

Pertumbuhan pada Agar MiringCiri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurusCiri koloni berdasarkan bentuk:

Pertumbuhan pada Agar TegakCara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam media agar tegak.Ciri-ciri koloni berdasar bentuk :

Ciri koloni berdasar kebutuhan O2 :

Pertumbuhan pada Media CairPola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2