bab ii tinjauan pustaka -...

7

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Narkotika

Menurut Undang-Undang Republik Indonesia Nomor 35 Tahun 2009,

narkotika adalah zat atau obat yang berasal dari tanaman atau bukan tanaman,

baik sintetis maupun semi sintesis, yang dapat menyebabkan penurunan atau

perubahan kesadaran, hilangnya rasa, mengurangi sampai menghilangkan rasa

nyeri, dan dapat menimbulkan ketergantungan, yang dibedakan ke dalam

golongan-golongan sebagaimana terlampir dalam undang-undang, yaitu :

a. Narkotika Golongan I

Narkotika Golongan I adalah narkotika yang paling berbahaya, daya adiktif

sangat tinggi menyebabkan ketergantungan. Jenis narkotika ini tidak dapat

digunakan untuk kepentingan apapun kecuali untuk penelitian atau ilmu

pengetahuan.

b. Narkotika Golongan II

Narkotika Golongan II adalah narkotika yang memiliki daya adiktif kuat, tetapi

bermanfaat untuk pengobatan dan penelitian.

c. Narkotika Golongan III

Narkotika Golongan III adalah narkotika yang memiliki daya adiktif ringan,

tetapi dapat bermanfaat untuk pengobatan dan penelitian.

Penyalahgunaan narkotika yang banyak digunakan oleh masyarakat di

Indonesia diantaranya ganja, sabu-sabu, heroin, dan ecstasy. Diantara sekian

banyak jenis narkotika, sabu-sabu merupakan jenis narkotika yang paling

populer. Sabu-sabu merupakan jenis narkotika yang termasuk ke dalam turunan

golongan amfetamina.

2.2 Amfetamina dan Turunannya

Amfetamina dan turunannya memiliki struktur dasar yang sama, yaitu

fenetilamina (Cole MD dan Codely B, 1995).

8

Isolasi Metamfetamina di dalam Urindengan Menggunakan Metode Solid Phase Extraction (SPE)

Gambar 2.1 Struktur Molekul Fenetilamina

Sumber : Cole MD dan Codely B, 1995

Substitusi gugus kimia tertentu pada struktur dasar tersebut akan

mempengaruhi mekanisme kerja dari senyawa turunan yang dihasilkan.

2.2.1 Amfetamina

a. Sejarah

Amfetamina disintesis pertama kali pada tahun 1887 di Jerman, tetapi pada

saat itu belum digunakan secara luas. Pada tahun 1932, amfetamina dipasarkan

dengan nama benzedrine dalam bentuk sediaan inhaler sebagai dekongestan. Pada

tahun 1935, amfetamina dipasarkan berupa tablet dexidrine yang merupakan

bentuk rasemat amfetamina yang diberi nama deksamfetamina yang mempunyai

potensi dua kali lipat dari amfetamina (M.S. Handajani, 2006).

Pada perang dunia II banyak tentara Inggris menggunakan tablet amfetamina

untuk menghilangkan kelelahan, memperbaiki keadaan jiwa, dan meningkatkan

rasa percaya diri. Hal ini juga dilakukan oleh tentara Amerika pada perang

Vietnam tahun 1960-1969. Setelah perang dunia II, di Jepang dilakukan

pengawasan produksi dan penggunaan amfetamina di lingkungan militer karena

banyak disalahgunakan. Sampai tahun 1960, amfetamina secara luas digunakan

sebagai anti depresi dan secara populer digunakan sebagai obat pelangsing tubuh.

Mulai tahun 1964, dilakukan pengawasan secara ketat dengan dikeluarkannya

peraturan tentang penggunaan dan pembuatan amfetamina (M.S. Handajani,

2006).

CH2 CH2 NH2

9


NH3

CH3

b. Struktur/ bentuk molekul:

Gambar 2.2 Struktur Molekul AmfetaminaSumber : M.S. Handajani, 2006

MR (Massa Molekul Relatif) = 135,21

c. Sifat-sifat fisik

Amfetamina (C9H13N) memiliki beberapa sifat fisik diantaranya berbentuk

cairan jernih, tidak menguap pada suhu kamar, mengeluarkan bau tajam amin,

larut dalam 50-100 mg/mL air (20 oC), larut dalam alkohol. Amfetamina

mempunyai titik leleh pada suhu 280 oC, titik didih pada suhu 201,5 oC, berat

jenis 0,946 gr/cm3 (liquid). Garam amfetamina sulfat/ fosfat berbentuk kristal

putih yang mudah larut dalam air.

d. Farmakologi Amfetamina

Pemberian amfetamina sebagai dosis tunggal sampai dengan 20 mg per hari.

Efek-efek psikologis dari amfetamina dapat berupa peningkatan kewaspadaan,

hilangnya rasa kantuk dan berkurangnya rasa lelah, perbaikan mood, bertambah

inisiatif, keyakinan diri dan daya konsentrasi, euphoria, serta peningkatan

aktivitas motorik dan aktivitas bicara (Setiawati A, 1995). Toleransi terjadi secara

cepat selama penggunaan intravena dengan dosis tinggi. Penggunaan kronik akan

mengakibatkan penurunan berat badan, halusinasi dan paranoid (Krainer JC,

1967).

e. Analisis

Amfetamina dapat dianalisis menggunakan GC-MS dengan kondisi

temperatur oven, detektor dan temperatur injektor sama dengan GC-FID. Gas

pembawa yang digunakan adalah helium (UHP) dengan kecepatan alir 0,5-1 mL/

menit. Pengamatan dilakukan pada TIC (Total Ion Chromatogram) terhadap

massa ion bermuatan satu dan kelimpahannya (m/z). Identifikasi dilakukan

10


menggunakan data pustaka yang tersedia pada software dari alat tersebut (M.S.

Handajani, 2006).

Isolasi amfetamina dari cairan biologis dapat dilakukan dengan ekstraksi cair-

cair pada suasana basa (pH≥10) menggunakan pelarut heksan/ kloroform atau

klorobutan. Selain itu dapat digunakan teknik mikro analisis dengan SPE (Solid

Phase Extraction) maupun SPME (Solid Phase Micro Extraction). Untuk

meningkatkan kepekaan analisis dapat dilakukan derivatisasi menggunakan 1-

trifluoroacetyl-1-propyl chloride (1TCP),TFAA (Triflouro Acetyl Anhydride) atau

PFPA (Penta Flouro Propionic Anhydride) (M.S. Handajani, 2006).

2.2.2 Turunan Amfetamina

a. Umum

Turunan amfetamina sering dipakai untuk menjadikan seseorang merasa

gembira yang berlebihan atau merasa nikmat. Turunan amfetamina yang banyak

beredar secara ilegal, terutama di tempat hiburan, diskotik, pubs, dan lain-lain,

adalah turunan amfetamina yang mengandung gugus metoksi dan metilendioksi.

Turunan amfetamina dengan gugus metoksi dan metilendioksi selain mempunyai

khasiat seperti amfetamina, juga mempunyai pengaruh farmakologi berupa

halusinasi yang mirip seperti yang diberikan oleh meskalin. Khasiat halusinasi ini

yang mendorong untuk disalahgunakan (drug abuse). Pengaruh halusinasi lebih

besar dan lebih berbahaya daripada khasiatnya sebagai stimulansia pada SSP

(susunan saraf pusat). Oleh karena itu turunan metoksi dan metilendioksi dilarang

digunakan dalam pengobatan (M.S. Handajani, 2006).

Beberapa turunan amfetamina dapat diproduksi secara alami dari suatu

tanaman kaktus Trichocerecus pachamomai (Brit et rose), yang tumbuh di daerah

subtropis Amerika Latin khususnya di daerah Andean. Turunan amfetamina juga

dapat diperoleh dari tanaman Cophophora wiliamsi yang mengandung mescaline.

Hal ini banyak diproduksi secara illegal di wilayah Swiss dan beberapa negara

Eropa (M.S. Handajani, 2006).

Banyak perdagangan gelap turunan amfetamina yang diproduksi secara

disintesis oleh laboratorium gelap (clandestin laboratories) yang berpotensi besar

11


CH3

CH3

HN

untuk disalahgunakan. Hasil sintesis itu, lebih populer sebagai bahan untuk

rekreasi (recreational substance) diantaranya MDMA (ecstacy “XTC”) (M.S.

Handajani, 2006).

b. Senyawa Derivat/ Turunan Amfetamina

Turunan amfetamina yang sering beredar di Indonesia antara lain

metamfetamina yang dikenal sebagai sabu-sabu; 3,4-methylene dioxyamphetamine

(MDA) dengan nama populer Harmoni, Love, Love drug, Speed love; dan 3,4-

methylene dioxymetamphetamine (MDMA) dengan nama popular Adane, Ecstasy,

XTC, Essence. Sabu-sabu biasanya ditemukan dalam bentuk sediaan tablet dan

kristal baik kristal putih maupun berwarna, sedangkan untuk MDA dan MDMA

banyak ditemukan dalam bentuk sediaan tablet.

2.2.3 Metamfetamina/ Metamphetamine

a. Sejarah

Metamfetamina pertama kali dikenal dari Hawai pada tahun 1980an dengan

nama “ICE” yang merupakan bentuk sangat murni dari MA. Proses pembuatan

metamfetamina tidak diketahui secara pasti, tetapi diketahui bahwa pusat produksi

metamfetamina berada di Asia Tenggara dan sangat populer di Jepang.

Penyalahgunaan MA awalnya diketahui dari Inggris (M.S. Handajani, 2006).

b. Struktur Molekul

Gambar 2.3 Struktur Molekul MetamfetaminaSumber: M.S. Handajani, 2006

MR (Massa Molekul Relatif): 149,23

c. Sifat Fisik

Metamfetamina (C10H15N) memiliki beberapa sifat fisik diantaranya berbentuk

kristal dan serbuk baik putih maupun berwarna. Titik leleh metamfetamina pada

suhu 134 oC, titik didih pada suhu 215,5 oC, dan berat jenis 78 g/cm3 (solid).

Metamfetamina larut dalam 100 mg/mL air (20 oC).

12


d. Farmakologi

Metamfetamina mudah hancur pada suhu tertentu sehingga cara

pemakaiannya sering diuapkan dengan pemanasan dalam waktu yang cukup lama

(10-12 jam) atau dihisap. Apabila masih terdapat sisa dapat dipanaskan beberapa

jam dan dihasilkan efek yang sama. Hal ini disebabkan karena metamfetamina

mempunyai titik leleh yang tinggi (170-175 oC) dan stabil terhadap panas (tidak

mudah terdekomposisi). Metamfetamina mempunyai pengaruh stimulasi pada

SSP lebih besar daripada amfetamina tetapi lebih kecil pengaruhnya pada perifer.

2.3 Urin

Narkoba yang telah masuk ke dalam jaringan tubuh akan mengalami proses

metabolisme di dalam hati, yang dikatalisis oleh suatu enzim. Metabolitnya akan

diekskresikan melalui urin.

Urin merupakan cairan essensial sebagai salah satu bentuk sisa dari hasil

metabolisme tubuh. Di dalam urin, obat-obat terdapat dalam bentuk metabolit

hasil biotransformasi ataupun dalam bentuk asalnya. Urin terdiri dari bermacam-

macam bahan organik maupun anorganik yang kompleks. Kandungan urin

terkandung pada bahan yang dimakan, keadaan metabolisme tubuh dan

kemampuan ginjal mengadakan seleksi. Oleh karena itu, urin dapat digunakan

sebagai bahan pemeriksaan seseorang yang dicurigai sebagai pengguna narkoba.

Narkoba dapat dianggap sebagai racun yang harus diekskresikan oleh tubuh

melalui ginjal dalam bentuk urin. Selain itu, urin dapat dikumpulkan lebih banyak

daripada hasil metabolisme yang lain. Jumlah urin yang dikeluarkan setiap hari

berkisar antara 500-3000 mL, dengan rata-rata 1500 mL.

Berikut ini adalah waktu dan jumlah pengambilan urin untuk pemeriksaan

narkoba:

Tabel 2.1 Pengambilan Urin untuk Pemeriksaan Narkoba

Golongan Narkoba dalam Urin Lama (hari) Jumlah (mL)Opiat (heroin, kodein, tebain) 1-4 25-50Ganja (cannabis) 2-7 25-50Amfetamina (metamfetamina, MDMA, MDA) 1-4 25-50Kokain (ecgonin) 1-3 25-50Benzodiazepin 2-7 25-50

Sumber: Jobsheet Pemeriksaan Barang Bukti Narkoba di Puslabfor Polri

13


2.4 Preparasi Sampel

Dalam bidang toksikologi forensik dan obat-obatan, sampel yang akan

dianalisis pada umumnya merupakan sampel/ sediaan hayati berupa plasma,

serum, urin, darah, keringat, feses, ludah, jaringan, dan isi perut. Sampel selain

mengandung analit juga mengandung sejumlah senyawa endogen (dalam tubuh),

sehingga diperlukan isolasi/ ekstraksi analit secara selektif. Permasalahan yang

perlu diatasi dalam isolasi analit sediaan hayati adalah bagaimana melepaskan

obat/ analit dari protein atau enzim.

Pengerjaan awal suatu sampel hayati bertujuan untuk mendapatkan larutan

yang bebas protein dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut organik dan

pengendapan protein. Reagen asam yang umum digunakan untuk pengendapan

protein adalah asam trikloroasetat, asam perklorat, dan asam tungstat. Penggunaan

asam kuat dapat menyebabkan penguraian obat/ analit, sehingga penggunaan

sejumlah reagen asam perlu pengujian terlebih dahulu untuk mendapatkan hasil

yang optimal.

Ketidakstabilan obat pada pH rendah dapat dicegah menggunakan pelarut

organik seperti dengan metanol atau etanol sebanyak dua kali volume untuk

pengendapan protein plasma (Chamberlain, 1985). Pemecahan ikatan obat-protein

selain menggunakan asam dapat juga digunakan enzim proteolitik, contohnya

enzim substilisin yang sangat baik untuk pemecahan obat-protein dalam plasma

(Chamberlain, 1985).

Metode ekstraksi sampel tersebut pada umumnya dilakukan dengan cara

mengekstraksi sejumlah volume sampel dengan pelarut organik yang sesuai

dengan menambahkan reagen asam/ enzim dan reagen pengendapan protein.

Filtrat yang didapat merupakan larutan yang mengandung analit.

Metode yang dijelaskan di atas merupakan ekstraksi cair-cair. Metode tersebut

memiliki kelemahan. Apabila sampel terbatas/ sangat sedikit dengan kadar

kandungan analitnya yang sangat kecil, maka perolehan kembali sejumlah

analitnya akan sangat sedikit sehingga sulit untuk ditentukan kandungannya. Oleh

14


karena itu, diperlukan metode analisis ekstraksi padat-cair secara Solid Phase

Extraction (SPE).

2.5 Ekstraksi Fase Padat (Solid Phase Extraction, SPE)

Jika dibandingkan dengan ekstraksi cair-cair, SPE merupakan teknik yang

relatif baru. SPE cepat berkembang sebagai alat yang utama untuk pra-perlakuan

sampel atau untuk clean-up sampel-sampel yang kotor, misalnya sampel-sampel

yang mempunyai kandungan matriks yang tinggi seperti garam-garam, protein,

polimer, resin, dan lain-lain. Keunggulan SPE dibandingkan dengan ekstraksi

cair-cair adalah:

a. Proses ekstraksi lebih sempurna

b. Pemisahan analit dari pengganggu yang mungkin ada menjadi lebih efisien

c. Mengurangi pelarut organik yang digunakan

d. Fraksi analit yang diperoleh lebih mudah dikumpulkan

e. Mampu menghilangkan partikulat

f. Lebih mudah diotomatisasi

Karena SPE merupakan proses pemisahan yang efisien. Untuk memperoleh

recovery yang tinggi (>99%), SPE lebih mudah dilakukan daripada ekstraksi cair-

cair karena pada ekstraksi cair-cair diperlukan beberapa kali ekstraksi agar

diperoleh recovery yang tinggi. Sedangkan pada SPE hanya dibutuhkan satu tahap

saja untuk memperoleh recovery yang tinggi (Ibnu Gholib G, 2010).

Adapun kerugian SPE adalah banyaknya jenis cartridge (berisi penjerap

tertentu) yang beredar di pasaran sehingga reprodusibilitas hasil bervariasi jika

digunakan cartridge yang berbeda. Selain itu, dapat terjadi adsorpsi yang bolak-

balik pada cartridge SPE (Ibnu Gholib G, 2010).

Gambar 2.4Jenis-jenis cartridge SPESumber: http://www.sigmaaldrich.com/Graphics/Supelco/objects/4600/4538.pdf.

14



Extraction (SPE).







cair-cair adalah:

















14



Extraction (SPE).







cair-cair adalah:

















15


Gambar 2.5 Proses Ekstraksi dengan SPESumber: http://www.sigmaaldrich.com/Graphics/Supelco/objects/4600/4538.pdf.

2.5.1 Kolom SPE

Metode SPE menggunakan kolom kecil berisi silika atau materi padatan

polimer dengan ukuran partikel kecil. Pemilihan partikel kecil (sorbent) yang

digunakan tergantung dari kepolaran analit yang dianalisis. Menurut Chamberlain

(1985), terdapat 4 jenis sorbent yang digunakan, yaitu:

1. Kelompok non polar, dapat berupa oktadesil (C18), oktil (C8), butyl (C4),

sikloheksil,fenil, dan stiren divinilbenzen.

2. Kelompok polar, dapat berupa cyanyl (CN), kieselguhr (SiOH), silica gel

(SiOH), diol (COH-COH), amina (NH2), florosil (SiOn), dan alumina (Al2O3).

3. Kelompok anion exchange (penukar anion), dapat berupa amina (NH2/ NH)

atau amin kuartener (N+).

4. Kelompok cation exchange (penukar kation), dapat berupa asam karboksilat

(COOH) atau asam sulfonat (SO3).

2.5.2 Prosedur SPE

Dalam penyiapan sampel menggunakan SPE, dapat dilakukan dengan dua

strategi. Strategi pertama adalah dengan memilih pelarut yang mampu menahan

secara total analit yang dituju pada penjerap yang digunakan, sementara senyawa-

senyawa pengganggu akan terelusi. Analit yang dituju yang tertahan pada

penjerap ini selanjutnya dielusi dengan sejumlah kecil pelarut organik yang akan

15



2.5.1 Kolom SPE













2.5.2 Prosedur SPE






15



2.5.1 Kolom SPE













2.5.2 Prosedur SPE






16


mengambil analit yang tertahan (gambar 2.6). Strategi ini bermanfaat jika analit

yang dituju berkadar rendah (secara kuantitatif) (Ibnu Gholib G, 2010).

Pengkondisian penjerap sebelum sampel Retensi

dimasukkan untuk menjamin reprodusibilitas Analit yang akan diadsorbsi

retensi analit Komponen matriks yang tidak diharapkan

Komponen matriks lain yang tidak

diharapkan

Pembilasan Elusi

Kolom dibilas untuk menghilangkan Komponen matriks yang tidak diharapkan

matriks yang tidak diinginkan tertahan

Analit yang terpekatkan dan termunikan

siap dielusi lebih lanjut

Strategi lain adalah dengan mengusahakan supaya analit yang tertuju keluar

(terelusi), sementara senyawa pengganggu tertahan pada penjerap (Ibnu Gholib G,

2010).

Tahap pertama penggunaan SPE adalah dengan mengkondisikan penjerap

dengan pelarut yang sesuai. Untuk penjerap non polar seperti C18 dan penjerap

penukar ion dikondisikan dengan mengalirinya menggunakan metanol diikuti

dengan aquadest. Pencucian yang berlebihan dengan air akan mengurangi

(3)(4)

(1)(2)

Gambar 2.6 Diagram skematik prosedur SPESumber : Kealey and Haines, 2002

17


recovery analit. Penjerap-penjerap polar seperti diol, siano, amino, dan silika

harus dibilas dengan pelarut nonpolar seperti metilen klorida.

Dari gambar 2.6 di atas dapat diketahui bahwa ada 4 tahap dalam prosedur

SPE, yaitu:

1. Pengkondisian

Kolom (cartridge) dialiri dengan pelarut sampel untuk membasahi permukaan

penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama, sehingga perubahan-

perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan dapat

dihindari.

2. Retensi (tertahannya) sampel

Larutan sampel dilewatkan ke dalam cartridge untuk menahan analit yang

diharapkan sementara komponen lain terelusi.

3. Pembilasan

Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak tertahan

oleh penjerap selama tahap retensi.

4. Elusi

Tahap ini merupakan tahap akhir untuk mengambil analit yang dikehendaki

jika analit tersebut tertahan pada penjerap.

2.5.3 Pengembangan Metode

Sebagaimana dalam metode kromatografi cair, retensi analit tergantung pada

konsentrasi sampel, kekuatan pelarut, dan karakteristik penjerap. Pendekatan

empirik untuk melakukan pengembangan metode SPE melibatkan screening

penjerap yang tersedia. Langkah pertama adalah menentukan penjerap yang

paling baik dalam hal kemampuan menahan analit yang dituju. Pertimbangan

kedua adalah pelarut yang dibutuhkan untuk mengelusi analit yang dituju.

Langkah ketiga adalah menguji matriks sampel blanko untuk mengevaluasi

adanya pengganggu yang mungkin ada. Akhirnya (langkah keempat) menentukan

recovery dengan menambahkan analit dalam jumlah tertentu harus dilakukan

(Ibnu Gholib G, 2010).

18


Polaritas pelarut yang meningkat dibutuhkan untuk mengelusi senyawa yang

tertahan dalam penjerap silika; sementara untuk senyawa yang tertahan dalam

penjerap non polar (seperti C18) digunakan pelarut non polar (Ibnu Gholib G,

2010).

2.6 Derivatisasi

Derivatisasi merupakan proses kimiawi untuk mengubah suatu senyawa

menjadi senyawa lain yang mempunyai sifat-sifat yang sesuai untuk dilakukan

analisis menggunakan kromatografi gas. Alasan dilakukannya derivatisasi yaitu:

1. Senyawa-senyawa tersebut tidak memungkinkan dilakukan analisis dengan GC

terkait dengan volatilitas dan stabilitasnya.

2. Untuk meningkatkan batas deteksi dan bentuk kromatogram. Beberapa

senyawa tidak menghasilkan bentuk kromatogram yang bagus (misal puncak

kromatogram saling tumpang tindih) atau sampel yang dituju tidak terdeteksi,

karenanya diperlukan derivatisasi sebelum dilakukan analisis dengan GC.

3. Meningkatkan volatilitas, misal senyawa gula. Tujuan utama derivatisasi

adalah untuk meningkatkan volatilitas senyawa-senyawa yang tidak mudah

menguap (non-volatil). Senyawa-senyawa dengan berat molekul rendah

biasanya tidak mudah menguap karena adanya gaya tarik-menarik inter

molekuler antara gugus-gugus polar, karenanya jika gugus-gugus polar ini

ditutup dengan cara derivatisasi, maka akan mampu meningkatkan volatilitas

senyawa tersebut secara dramatis.

4. Meningkatkan deteksi, misal untuk kolesterol dan senyawa-senyawa steroid.

5. Meningkatkan stabilitas. Beberapa senyawa volatil mengalami dekomposisi

parsial karena panas sehingga diperlukan derivatisasi untuk meningkatkan

stabilitasnya.

6. Meningkatkan batas deteksi pada penggunaan detektor tangkap (ECD).

Ada beberapa cara derivatisasi yang dilakukan pada kromatografi gas, serta

gugus-gugus fungsional yaitu esterifikasi, asilasi, alkilasi, sililasi, kondensasi, dan

siklisasi. Cara yang tepat untuk derivatisasi metamfetamina yaitu dengan asilasi

atau alkilasi.

19


2.6.1 Asilasi

Derivatisasi asilasi digunakan untuk sampel yang mengandung gugus fenol,

alkohol, atau amin primer maupun sekunder. Derivatisasi dengan cara ini

dilakukan dengan menggunakan asam asetat anhidrat dan katalis (misalkan asam

asetat, asam p-toluen sulfonat, piridin, dan N-metil amidazol) sebelum

penyuntikan ke kromatografi gas (pre column derivatization) atau dilakukan

penyuntikan di dalam kolom (on column derivatization). Asilasi pada umumnya

memberikan bentuk kromatogram yang baik. Trifluoro asetat (FFA),

pentafluoropropionat (PFP), atau heptafluorobutirat (HFB) digunakan untuk

meningkatkan sensitifitas analisis. Umumnya kepekaan relatif ester terfluoro yaitu

pentafluorobenzoil > HFB > PFP > TFA, dengan beberapa perkecualian. Jika

menganalisis ester katekolamin dan metabolitnya dengan TFA, PFP, dan HFB

maka urutan elusinya pada fase diam yang kurang polar (SE-30) yaitu TFA lebih

cepat daripada PFP dan yang paling akhir terelusi adalah HFB. Jika menggunakan

fase diam yang lebih polar (OV-1 atau XE-60) maka derivat PFP dan HFB akan

terelusi sebelum TFA.

Asilasi digunakan dengan menggunakan perfluoroanhirida yang murni atau

dalam pelarut, misalkan dalam asetonitril dan etil asetat. Penambahan amin tersier

seperti trimetil amin atau trietil amin akan meningkatkan reaktifitasnya dan

berfungsi sebagai penerima asam.

2.6.2 Alkilasi

Alkilasi digunakan untuk menderivatisasi alkohol, fenol, amina (primer dan

sekunder), imida, dan sulfhidril. Derivat dapat dibuat dengan sintesis Wiliamson,

yakni alkohol atau fenol ditambah alkil atau benzil halida dengan adanya basa.

Jenis agen penderivat yang saat ini digunakan hanya α-bromo-2,3,4,5,6-

pentafluorotoluen.

20


2.7 Gas Chromatography- Mass Spectrometry (GC-MS)

2.7.1 Pengertian

Kromatografi gas adalah suatu metode analisis fisiko-kimiawi yang

berdasarkan pada pemisahan fisik senyawa organik atau anorganik yang stabil

pada pemanasan dan mudah diatsirikan (Mulja dan Surahman, 1995). Sebagai

dasar pemisahan ini adalah pemisahan analit diantara dua fase yaitu fase diam

berupa cairan dan fase gerak berupa gas.

Spektrometri massa adalah suatu metode analisis instrumental yang

melibatkan ionisasi elektron dan fragmentasi molekul serta dapat menentukan

rasio massa relatif (m/z) dan kelimpahan ion-ion yang terdapat dalam sampel (A.

C. Moffat, 1986).

Kromatografi gas-spektrometri massa adalah salah satu teknik analisis terpadu

yang merupakan penggabungan dari teknik analisis pemisah selektif kromatografi

gas dan teknik penganalisis spesifik spektrometer massa. Sistem kromatografi

gas-spektrometri massa pertama kali dikembangkan oleh Holmes dan Morrell

pada tahun 1957. Penggabungan dari kedua metode analisis akan memberikan

keuntungan yang lebih baik karena senyawa yang telah terpisahkan oleh

kromatografi gas dapat langsung teridentifikasi oleh spektrometri massa (Jack

Cazes, 2001).

Prinsip kerja dari GC-MS yaitu sampel yang berupa cairan diinjeksikan ke

dalam injektor kemudian diuapkan. Sampel yang berbentuk uap akan dibawa oleh

gas pembawa melalui kolom dan komponennya akan terpisah di dalam kolom.

Setelah terpisah, masing-masing komponen akan keluar melalui kamar pengion

dan dibombardir oleh elektron sehingga terjadi ionisasi. Fragmen-fragmen ion

yang dihasilkan akan ditangkap oleh detektor dan dihasilkan spektrum massa.

Masalah yang dapat timbul pada penggunaan GC-MS diantaranya yaitu ion

molekul tidak tampak atau sangat lemah. Hal ini dapat terjadi jika senyawa yang

dianalisis kurang murni dan terdapat pengotor yang mengganggu proses analisis

secara spektrometri massa (Silverstein, et.al., 1986).

21


2.7.2 Komponen Gas Chromatography- Mass Spectrometry

Pada prinsipnya, GC-MS terdiri dari 3 komponen utama, yaitu kromatografi

gas, antarfasa, dan spektrometri massa. Selain itu, terdapat komponen penunjang

lainnya berupa sistem pengolah data.

2.7.2.1 Kromatografi Gas

Prinsip mekanisme kromatografi gas adalah sampel diinjeksikan ke dalam

injektor kemudian diuapkan. Sampel yang berbentuk gas dibawa oleh gas

pembawa dengan laju alir yang konstan masuk ke dalam kolom pemisah.

Komponen-komponen sampel akan terpisah pada saat melewati kolom karena

adanya partisi fasa diam terhadap komponen-komponen sampel. Komponen yang

sudah terpisahkan akan dibawa oleh fasa gerak untuk bergerak di sepanjang

kolom berupa pita-pita (band).

Setelah sampel dipisahkan menjadi komponen-komponennya, masing-masing

komponen tersebut akan keluar dari kolom bersama fasa gerak. Konsentrasi

komponen tersebut dapat diukur dengan suatu detektor yang menghasilkan sinyal

dan dikirim ke pencatat. Komponen-komponen dari sampel yang telah terpisahkan

akan menghasilkan kurva-kurva karena masing-masing komponen tersebut

ditahan pada kolom dalam waktu yang berbeda-beda. Lamanya waktu suatu

komponen ditahan oleh kolom merupakan ciri khas komponen tersebut yang

disebut dengan waku retensi atau waktu tambat.

Untuk analisis kualitatif secara kromatografi gas, parameter hasil pemisahan

yang digunakan adalah waktu retensi. Dengan menggunakan aliran yang tepat dan

pengendalian suhu, waktu retensi dapat terulang dalam batas 1% dan dapat

digunakan untuk mengidentifikasi setiap puncak. Beberapa senyawa mungkin

mempunyai waktu retensi yang sama atau berdekatan, tetapi setiap senyawa hanya

mempunyai satu waktu retensi saja.

Pada kromatografi gas, umumnya terdapat 5 komponen utama yaitu gas

pembawa, gerbang suntik, thermostat, kolom, dan detektor.

22


1. Gas Pembawa

Fungsi utama gas pembawa adalah untuk memindahkan analit dari injektor

menuju detektor. Syarat mutlak gas pembawa pada kromatografi gas adalah

lembam dari segi kimia (mencegah reaksi dengan sampel dan pelarut), sesuai

dengan detektor yang digunakan, dan mempunyai kemurnian yang tinggi. Gas

pembawa yang paling banyak digunakan adalah helium (He), argon (Ar), nitrogen

(N2), atau campuran argon dan metana (CH4). Selama operasional aliran gas

pembawa harus tetap dan laju aliran gas sebelum masuk ke dalam kolom bersama

uap analit diatur oleh sebuah pengatur tekanan. Pengaturan tekanan aliran gas

pembawa tergantung kondisi kebutuhan analisis, biasanya sekitar 10-50 psi

dengan laju aliran 25-150 ml/ menit (Mulja dan Suharman, 1995). Untuk

mencegah masuknya uap air atau pengotor dari gas pembawa ke dalam kolom

biasanya dilengkapi dengan penyaring (traps), sedangkan flow splitter berguna

untuk memecah aliran gas pembawa menuju kolom dan detektor.

2. Gerbang suntik

Sampel yang disuntikkan ke dalam gerbang suntik merupakan suatu larutan

yang mudah diatsirikan. Akan tetapi, sampel berbentuk padat dan gas juga dapat

dianalisis dengan memakai sistem pemasuk sampel yang khusus. Volume sampel

yang disuntikkan bervariasi antara 0,01-1,0 µl menggunakan kolom kapiler dan 1-

20 µl apabila menggunakan kolom terpaking (packed column), dengan jangkauan

kadar analit sampai batas ppb (part per billion) untuk High Resolution Gas

Chromatograph (HRGC).

Pengaturan temperatur pada gerbang suntik harus di atas suhu titik didih

komponen yang terkandung dalam sampel, biasanya diatur sampai 50 oC di atas

titik didih komponen (Mulja dan Suharman, 1995). Apabila temperatur terlalu

tinggi komponen cepat menguap, tetapi dapat menyebabkan terjadinya penguraian

komponen. Sedangkan apabila temperatur di bawah titik didih, komponen dalam

sampel dapat menyebabkan pengendapan/ penumpukan pada gerbang suntik.

Analisis senyawa yang mudah menguap atau yang mempunyai titik didih yang

rendah misalnya senyawa ester/ eter, maka gerbang suntik kromatografi gas dapat

dilengkapi dengan head space dan autosampler. Sistem gerbang suntik pada

23


kromatografi gas berkembang dengan dilengkapi electronic pressure control

(EPC) untuk mengatur tekanan aliran gas pembawa.

3. Thermostat oven

Thermostat oven berfungsi untuk mengatur temperatur kolom. Pengaturan

kolom pada kromarografi gas sangat penting, karena pemisahan fisik komponen

yang terjadi di dalam kolom sangat dipengaruhi oleh temperatur di dalam oven,

yaitu:

a. Isotermal, temperatur diatur tetap selama analisis.

b. Program temperatur, temperatur diatur naik secara teratur selama rentang

waktu analisis, misalnya 30-180 oC selama 35 menit.

4. Kolom

Pemisahan komponen di dalam sampel terjadi di dalam kolom yang berfungsi

sebagai fase diam. Pengaturan temperatur kolom tergantung pada komponen yang

ada pada sampel. Apabila sampel mengandung beberapa komponen analit yang

memiliki rentang titik didih lebar, sebaiknya menggunakan temperatur

terprogram. Sedangkan apabila sampel hanya mengandung satu komponen analit,

maka cukup dengan pengaturan stabilitas suhu yang cukup memisahkan analit

dari komponen lain dalam cuplikan dengan waktu yang tidak terlalu lama.

Pengaturan temperatur kolom tidak boleh melebihi temperatur maksimum yang

disyaratkan pada ketentuan jenis kolom yang digunakan, karena dapat

menyebabkan column bleeding dan kerusakan pada fase diam.

Secara umum, kolom pada kromatografi gas ada 2 jenis yaitu kolom terpaking

(packed column) dan kolom kapiler (capillary column). Kolom terpaking terbuat

dari logam tahan karat atau tembaga, aluminium, nikel dengan panjang 2-3 meter

dan diameter dalam 1,5-9,5 mm yang dibuat melingkar dengan diameter 15 cm

dengan padatan pendukung chromosorb. Kolom kapiler berupa pipa terbuka dari

logam tahan karat dengan diameter dalam sangat kecil sekitar 0,25-0,32 mm dan

panjang kolom sangat panjang sekitar 25-60 m, fase diamnya berupa cairan tipis

yang melapisi dinding bagian dalam pipa tersebut. Kolom kapiler lebih banyak

digunakan saat ini karena menghasilkan resolusi atau daya pisah yang baik.

24


Penentuan jenis fase diam yang berupa cairan tergantung pada aplikasi tingkat

kepolaran analit yang dianalisis.

Gambar 2.7 Gambar Jenis-jenis Kolom pada GCSumber : http://indonesiakimia.blogspot.com/2011/05/gas-chromatography-gc.html

5. Detektor

Detektor pada kromatografi gas merupakan suatu sensor elektronik yang

berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen-komponen di dalamnya

menjadi sinyal elektronik. Secara garis besar, detektor pada kromatografi gas

termasuk detektor diferensial yang mana respon yang keluar memberikan relasi

yang linier dengan kadar atau laju aliran massa komponen yang terelusi (Mulja

dan Suharman, 1995). Kromatogram yang dihasilkan merupakan hasil pemisahan

fisik komponen-komponen berupa puncak dengan waktu tambat tertentu sebagai

data analisis kualitatif dan luas puncak sebagai data kuantitatif yang dibandingkan

dengan pembanding standar.

Ciri detektor yang dikehendaki adalah kepekaannya tinggi, kelinieran

tanggapannya lebar terhadap perubahan aliran, suhu, dan harganya murah. Pada

GC-MS, spektrometer massa merupakan detektor dari kromatografi gas.

Secara sistematis, instrumen kromatografi gas-spektrometri massa dapat

ditunjukkan pada gambar 2.8 berikut:

25


Gambar 2.8 Instrumen Kromatografi Gas-Spektrometri MassaSumber: www.chemwiki.ucdavis.edu

2.7.2.2 Antarfasa

Antarfasa adalah bagian yang menghubungkan antara kromatografi gas

dengan spektrometri massa pada kondisi hampa udara yang tinggi. Tujuan utama

dari antarfasa adalah menghilangkan gas pembawa tanpa menghilangkan analit.

Antarfasa dapat memindahkan analit secara kuantitatif, mengurangi tekanan, dan

laju alir ke suatu tingkat yang dihasilkan oleh spektrum massa (Ewing, 2005).

2.7.2.3 Spektrometri Massa

Prinsip kerja spektrometri massa adalah analit diuapkan dalam keadaan vakum

kemudian dialirkan menuju ruang pengion. Pada ruang pengion, analit ditembak

dengan arus partikel berenergi tinggi menghasilkan ion dengan kelebihan energi

(radikal ion) yang bisa memecah dan tidak bisa memecah. Ion yang bisa memecah

disebut ion induk (parent ion), ion induk akan memecah menjadi ion positif,

negatif, dan pecahan yang netral. Ion negatif akan tertarik ke anoda untuk

dinetralkan dan terhisap oleh pompa vakum bersama-sama dengan fragmen netral,

sedangkan partikel bermuatan positif menuju ke tabung analisator dan dibelokkan

oleh medan magnet sehingga lintasannya melengkung (Fessenden dan Fessenden,

1989).

Pada spektrometri massa, hanya ion-ion positif yang terdeteksi dan

dipresentasikan sebagai tabel atau grafik yang memuat puncak m/z (massa/

26


muatan) ion-ion yang intensitasnya tergantung pada kelimpahan relatif ion

tersebut. Puncak spektrum tinggi disebut base peak yang intensitasnya dianggap

100%, sedangkan puncak-puncak dengan intensitas relatif di berbagai nlai m/z

dinamakan spektrum massa dan untuk setiap senyawa sifatnya sangat spesifik.

Pecahnya suatu ion-ion atau molekul menjadi fragmen-fragmen bergantung pada

kerangka karbon dan gugus fungsional yang ada. Oleh karena itu, struktur dan

massa fragmen memberikan petunjuk mengenai struktur molekul induknya

(Fessenden dan Fessenden, 1989). Berikut ini adalah urutan ion yang mudah

mengalami fragmentasi:

CH3+ < RCH2

+ < R2CH+ < R3C+ < CH2=CH-CH2

+ < C6H5 –CH2+

2.7.2.4 Pengolah Data

Teknologi komputer sangat diperlukan untuk harmonisasi bekerjanya

instrumen terpadu seperti kromatografi gas-spektrometri massa, dalam

pengolahan atau penyuguhan data analisis standar SRM (Standar Reference

Material) sebagai pembanding terhadap data analisis analit hasil penentuan.

Koleksi data analisis SRM yang ada pada perangkat lunak dikenal sebagai

Standar Library Spectra.

2.7.3 Teknik Analisis Analit

2.7.3.1 Teknik Multiple Ion Monitoring (MIM) atau SCAN

Dengan menggunakan teknik MIM, didapatkan hasil Total Ion Chromatogram

(TIC), dengan absis sebagai waktu tambat sedangkan ordinatnya merupakan

limpahan relatif (abundance) ion molekulnya. Masing-masing kromatogram

menghasilkan spektrum massa suatu senyawa yang dianalisis dan dapat

dibandingkan dengan data spektrum massa standar yang ada pada data pustaka.

Analisis dengan teknik MIM memerlukan senyawa yang memiliki kadar relatif

besar, karena molekul senyawa yang terfragmentasi memerlukan adanya sisa ion

molekul yang utuh. Hal ini diperlukan untuk mendapatkan kemiripan senyawa

yang lebih besar dari 90% dengan senyawa yang ada pada data pustaka. Teknik

MIM banyak digunakan untuk analisis kualitatif.

27


2.7.3.2 Teknik Selected Ion Monitoring (SIM)

GC-MS dengan teknik SIM didapatkan dari hasil TIC dengan spektrum massa

suatu komponen yang mempunyai puncak-puncak fragmen secara keseluruhan,

yang akan diseleksi puncak fragmen ion molekul (m/z) secara selektif berdasarkan

kelimpahannya. Hasilnya akan diperoleh 3 puncak fragmen ion molekul (m/z)

yang mempunyai kelimpahan tinggi. Teknik SIM akan menghasilkan data puncak

yang lebih tajam dan selektif sehingga akan meningkatkan kepekaan detektor.

Oleh karena itu, teknik SIM dapat digunakan untuk analisis dengan kadar yang

kecil dan sangat bermanfaat untuk pengukuran kuantitatif suatu komponen di

dalam sampel yang mengandung banyak campuran senyawa.

Teknik SIM hanya dapat dilakukan pada GC-MS dengan kelengkapan

analisator jenis quadrupol yaitu keempat batangnya mempunyai arus direct

current (DC) dengan pengaturan -300 sampai dengan +300 voltase dan potensi

frekuensi radio yang diatur pada -1500 sampai dengan +1500 Hz. DC mempunyai

tujuan arus searah menarik molekul ke dalam ruang bombardermen molekul oleh

elektron, sedangkan potensi frekuensi radio bertujuan menggetarkan molekul.

Antara DC dan potensi frekuensi radio dapat berkorelasi langsung dengan waktu

menghasilkan waktu tambat (tR) dan massa ion (m/z). Teknik SIM didapat dari

pengaturan DC dan potensi frekuensi radio tertentu, namun dalam dunia analisis

kimia yang terbaca bukan DC dan potensi frekuensi radio tetapi telah

teraktualisasi pada pengaturan massa ion (m/z). Oleh karena itu, teknik SIM

didapat dari pemilihan massa ion yang selektif untuk mencegah pengotor yang

mempunyai massa relatif yang sama ikut teranalisis.

2.8 Pengembangan Metode Analisis dan Validasi Metode

2.8.1 Pengembangan Metode, Optimasi, dan Pendekatan Validasi

1. Pengembangan Metode

Pengembangan metode analisis biasanya didasarkan pada literatur yang sudah

ada menggunakan instrumen yang sama atau hampir sama. Saat ini jarang ditemui

pengembangan suatu metode yang tidak menggunakan pendekatan dengan

28


menghubungkan atau membandingkan metode yang sedang eksis (Ibnu Gholib G,

2010).

Ada beberapa alasan valid untuk mengembangkan suatu metode analisis baru,

yaitu:

a. Tidak ada metode yang sesuai untuk analit tertentu dalam matriks sampel

tertentu.

b. Metode yang ada terlalu banyak menimbulkan kesalahan atau metode yang

sudah ada tidak reliabel (presisi dan akurasinya rendah).

c. Metode yang sudah ada terlalu mahal, membutuhkan waktu banyak,

membutuhkan banyak energi, atau tidak dapat diotomatisasikan.

d. Metode yang telah ada tidak memberikan sensitivitas atau spesifisitas yang

mencukupi pada sampel yang dituju.

e. Instrumentasi dan teknik yang lebih baru memberikan kesempatan untuk

meningkatkan kinerja metode tersebut, yang meliputi peningkatan identifikasi

analit, peningkatan batas deteksi, serta akurasi dan presisi yang lebih baik.

f. Ada suatu kebutuhan untuk mengembangkan metode alternatif, baik untuk

alasan legal atau alasan saintifik.

2. Optimasi

Optimasi metode dapat mengikuti dua pendekatan yang umum yaitu manual

dan dengan mendasarkan pada komputer. Pendekatan manual melibatkan variasi

satu variabel percobaan dalam satu waktu, sedangkan variabel yang lainnya dibuat

tetap lalu respon yang terjadi dicatat. Variabel-variabel tersebut dapat berupa

kecepatan alir, komposisi fase diam dan atau fase gerak, suhu, panjang gelombang

deteksi, dan pH. Pendekatan ini terhadap sistem optimasi bersifat lambat,

membutuhkan waktu yang lama, dan berpotensi membutuhkan biaya yang

banyak. Meskipun demikian, pendekatan ini dapat memberikan pemahaman

tentang prinsip-prinsip dan teori yang terlibat dan juga interaksi-interaksi berbagai

variabel (Ibnu Gholib G, 2010).

Pada pendekatan kedua (dengan komputer), efisiensi dioptimasi, akan tetapi

input eksperimental menjadi minimal. Pendekatan secara otomatis dengan

komputer ini secara signifikan akan mengurangi waktu, energi, dan biaya.

29


3. Pendekatan Validasi

Ada beberapa pendekatan untuk melakukan validasi metode yaitu metode

spiking buta nol (zero-blind spiking), spiking buta tunggal (single-blind spiking),

dan metode spiking buta ganda (double-blind spiking); pendekatan dengan analisis

bahan rujukan terstandar; pendekatan kolaboratif antar laboratorium

(interlaboratory collaborative studies); dan pendekatan dengan membandingkan

metode baru yang diterima.

a. Metode Spiking

1. Metode spiking buta nol (zero-blind spiking method)

Pendekatan metode spiking buta nol ini melibatkan analis tunggal

menggunakan suatu metode yang akan divalidasi untuk melakukan analisis

suatu sampel yang mengandung level analit tertentu yang sudah diketahui,

untuk dapat dianalisis perolehan kembali (recovery)-nya, presisinya, dan

akurasinya. Secara umum, pendekatan ini cepat, sederhana, dan berguna akan

tetapi rentan terjadi hasil yang subjektif.

2. Metode spiking buta tunggal (single-blind spiking method)

Pendekatan metode spiking buta tunggal melibatkan satu analis yang

menyiapkan sampel pada konsentrasi yang bervariasi yang tidak diketahui

konsentrasinya untuk diberikan kepada analis kedua yang juga melakukan

analisis sampel. Hasil analisis kedua analis ini selanjutnya dikumpulkan dan

dibandingkan. Meskipun pendekatan ini tidak bias diawalnya, akan tetapi

pendekatan ini dapat kehilangan kebutaannya pada tahap yang paling krusial

yakni ketika dua hasil analisis dibandingkan.

3. Metode spiking buta ganda (double-blind spiking method)

Pendekatan metode spiking buta ganda ini melibatkan tiga analis. Analis

pertama menyiapkan sampel pada konsentrasi yang diketahui, analis kedua

melakukan analisis sampel, dan analis ketiga membandingkan kedua data yang

dihasilkan oleh kedua analis. Baik analis pertama maupun analis kedua tidak

dapat mengakses data yang dihasilkan oleh masing-masing analis. Pendekatan

metode spiking buta ganda ini merupakan pendekatan yang paling objektif

30


dengan asumsi tidak ada bias yang disebabkan oleh analis ketiga

(administrator).

b. Metode Pendekatan dengan Analisis Bahan Rujukan Terstandar

Analisis dengan bahan referens baku atau sampel otentik pada umumnya

merupakan pendekatan validasi yang diterima. USP, NIST (National Institute of

Standards and Technology) dan organisasi lain telah menyiapkan, menjamin, dan

memasarkan berbagai macam spesies analit dalam berbagai matriks sampel yang

berbeda.

Ketika menggunakan SRM, analis harus menunjukkan bahwa metode yang

digunakan memberikan pengukuran analit yang akurat dan teliti dalam matriks

sampel tertentu. Dengan pendekatan ini, bias juga dapat terjadi, terutama jika

analis mengetahui banyaknya kandungan analit dalam SRM.

c. Pendekatan Kolaboratif antar Laboratorium

Uji banding antar laboratorium mungkin merupakan prosedur yang paling

diterima untuk melakukan validasi metode analisis baru. Pendekatan ini sangat

mahal dan membutuhkan waktu yang lama, bahkan bisa sampai tahunan mulai

dari permulaan validasi sampai akhir validasi (Ibnu Gholib G, 2010).

Selama melakukan validasi dengan pendekatan ini, analis harus mengeluarkan

segala usahanya untuk mengkoordinasikan proses validasi, membagi sampel,

menerima hasil, menganalisis hasil dengan cara statistik, menginterpretasi hasil,

dan akhirnya melakukan intepretasi dan verifikasi data.

d. Pendekatan dengan Membandingkan Metode Baru yang Diterima

Membandingkan metode analisis yang akan divalidasi dengan metode analisis

yang sudah ada yang telah diterima merupakan suatu pendekatan lain untuk

mengembangkan metode analisis. Pendekatan ini biasanya dilakukan oleh analis

tunggal, akan tetapi dapat juga dilakukan oleh dua orang analis yang mana sampel

yang akan dikerjakan dipecah menjadi dua. Pendekatan ini juga menggunakan

hasil-hasil yang diperoleh dari metode analisis yang telah ada sebagai verifikasi

untuk metode analisis baru yang akan divalidasi. Adanya kesesuaian hasil antara

metode baru dengan metode yang telah ada merupakan masalah serius untuk

menjadikan metode baru tersebut dapat diterima dan digunakan. Meskipun

31


demikian, adanya ketidaksesuaian ini juga dapat dimaknai adanya kemungkinan

bahwa metode yang telah ada tidak valid dan menimbulkan kesalahan. Jika

seorang analis dapat membuktikan bahwa metode yang telah ada tidak valid,

maka analis harus memulai suatu pendekatan lain untuk melakukan validasi

metode baru.

Secara umum, semakin banyak sampel maka semakin baik. Idealnya, suatu

metode harus divalidasi untuk suatu analit menggunakan berbagai macam jenis

sampel yang berbeda.

2.8.2 Validasi Metode Analisis

Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan

untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan

pada kisaran analit yang akan dianalisis.

Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa

parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis,

karenanya suatu metode analisis harus divalidasi, ketika:

1. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu.

2. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau

karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode baku

tersebut harus direvisi.

3. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah

seiring dengan berjalannya waktu.

4. Metode baku digunakan dilaboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh analis

yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda.

5. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara metode

baru dan metode baku.

Adapun beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam

validasi metode analisis adalah sebagai berikut:

1. Linieritas

Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil

uji secara langsung proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang

32


diberikan. Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva

kalibrasi yang menghubungkan respon (y) dengan konsentrasi (x). Linieritas dapat

diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-

beda. Data yang diperoleh selanjutnya dapat ditentukan kemiringan (slope),

intersep, dan koefisien korelasinya.

Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada

analisis regresi linier y = a + bx. Hubungan linier yang ideal dicapai jika b = 0 dan

r = +1 atau r = -1 tergantung pada arah garis. Sedangkan nilai a menunjukkan

kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan. Nilai koefisien korelasi

yang memenuhi persyaratan adalah lebih besar sama dengan dari 0,9970 (Chan,

2004).

2. Akurasi

Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai

terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau nilai

rujukan (Ibnu Gholib, 2010).

Ada 3 cara untuk pengujian akurasi, yaitu:

1. Uji Pungut Ulang (Recovery Test)

Uji pungut ulang dapat dilakukan dengan menganalisis sampel yang diperkaya

dengan sejumlah kuantitatif analit yang akan ditetapkan. Jumlah absolut analit

yang diperoleh dari pengujian yang sama untuk sampel (tanpa penambahan analit)

dapat digunakan untuk menentukan nilai pungut ulang analit itu. Apabila dalam

pengujian tidak terdapat kesalahan sistematik, maka nilai pungut ulang yang

diperoleh dalam uji ini tidak akan berbeda secara signifikan dari 100%.

Uji pungut ulang juga dapat dilakukan dengan teknik adisi standar

menggunakan suatu seri standar. Dalam hal ini evaluasi beberapa hal dapat

dilakukan sekaligus, seperti adanya kesalahan proporsional misalnya karena

adanya interaksi antara analit dengan matrik atau efisiensi ekstraksi akan terlihat

pada kemiringan garis regresi dengan slope kurva baku.

Kelemahan utama uji ini adalah adanya kemungkinan perbedaan antara

kondisi analit yang ditambahkan dan kondisi analit dalam matriks. Nilai uji

33


pungut ulang sebesar 100% tidak selalu dapat menjamin bahwa seluruh analit

dalam matriks telah benar-benar digambarkan oleh data hasil uji.

Jika kesalahan relatif pada suatu percobaan adalah 1% dari hasil yang benar,

maka metode analisis sangat akurat. Jika percobaan menghasilkan kesalahan

relatif antara 1-5%, maka metode yang digunakan cukup akurat. Sedangkan, jika

kesalahan relatif yang diperoleh dari percobaan lebih besar dari 5%, maka akurasi

suatu metode analisis sangat rendah (Harvey 2000).

Tabel 2.2 Rentang Perolehan Kembali Analit Dalam Beberapa Konsentrasi

No. Konsentrasi Analit pada Matrik Sampel % recovery yangdipersyaratkan

1. 100 % 98-101 %2. 10 % 95-102 %3. 1 % 92-105 %4. 0,1 % 90-108 %5. 0,01 % 85-110 %6. 10 ug/g (ppm) 80-115 %7. 1 ug/g 75-120 %8. 10 ug/kg (ppb) 70-125%

Sumber: AOAC, 2005

Semakin dekat hasil analisis yang diperoleh dengan nilai sebenarnya, maka

nilai akurasinya semakin tinggi. Perhitungan perolehan kembali dapat ditetapkan

dengan rumus sebagai berikut:

% Recovery =( )

∗ × 100

CF = konsentrasi total sampel yang ditambah analit

CA = konsentrasi sampel sebenarnya

C*A = konsentrasi analit yang ditambahkan

2. Uji Relatif terhadap Akurasi Metode Baku

Metode baku adalah metode standar yang diambil dari AOAC, USEPA,

APHA atau sumber serupa untuk memudahkan pelaksanaan suatu kegiatan guna

mencapai tujuan yang ditentukan. Pada prinsipnya, uji dilakukan dengan

mengerjakan pengujian paralel atas sampel uji yang sama menggunakan metode

ujiyang sedang dievaluasi dan metode uji lain yang telah diakui sebagai metode

baku. Apabila dalam pengujian tidak terdapat kesalahan sistematik, maka tidak

akan terdapat perbedaan data hasil uji yang signifikan dari kedua pengujian

34


tersebut. Dengan anggapan bahwa metode baku memiliki akurasi yang tinggi,

tidak adanya perbedaan data hasil uji yang signifikan dari kedua pengujian

tersebut menunjukkan bahwa akurasi metode uji yang sedang dievaluasi memiliki

akurasi yang setingkat dengan metode baku. Dibandingkan dengan metode uji

pungut, uji ini dapat memberikan reliabilitas evaluasi yang lebih baik.

3. Uji terhadap Standard Reference Material (SRM)

SRM adalah bahan referensi yang bersertifikat yang sifatnya homogen dan

stabil yang digunakan dalam proses pengukuran. Uji terhadap SRM untuk

mengevaluasi akurasi suatu metode uji dilakukan dengan menguji SRM dengan

metode uji yang sedang dievaluasi. Diasumsikan bahwa nilai yang sebenarnya

(true value) dari suatu bahan yang akan diuji adalah seperti yang dinyatakan pada

SRM tersebut. Bias (kekeliruan) hasil uji dari metode uji yang dievaluasi terhadap

true value menggambarkan seberapa tinggi akurasi dari metode uji tersebut.

3. Presisi

Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya

diekspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang berbeda

signifikan secara statistik.

Sesuai dengan ICH, presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yang berbeda

yaitu;

a. Keterulangan (repeability), yaitu ketepatan (precision) pada kondisi

percobaan yang sama (berulang) baik orangnya, peralatannya, tempatnya,

maupun waktunya.

b. Presisi antara (intermediate precision), yaitu ketepatan (precision) pada

kondisi percobaan yang berbeda baik orangnya, peralatannya, tempatnya,

maupun waktunya.

c. Ketertiruan (reproducibility) merujuk pada hasil-hasil dari laboratorium yang

lain.

Gambaran suatu data dapat dikategorikan presisi dan akurasinya ke dalam

beberapa kelompok berdasarkan sebarannya yang dapat dilihat pada gambar 2.9.

35


Gambar 2.9 a. Presisi dan akurasi tinggi b. Presisi rendah, akurasi tinggic. Presisi tinggi, akurasi rendah d. Presisi dan akurasi rendah

Sumber: http://repository.upi.edu/operator/upload/s_kim_0700710_chapter2.pdf

Presisi dapat dihitung dengan cara sebagai berikut :

a. Hasil analisis adalah x1,x2,x3,x4…….xn, maka simpangan bakunya adalah:

SD =∑ (xi- x)

2

n-1

Keterangan :

SD = simpangan baku (standar deviasi)

x = nilai analisis ke-i

x = rerata pengukuran

n = jumlah ulangan

b. Koefisien variasi (KV) adalah :

Koefisien variasi (KV) atau Persen Relatif Standar Deviasi (% RSD) dapat

dihitung dengan rumus (Harmita, 2004):

% RSD =SD

× 100%

Keterangan :

SD = simpangan baku (standar deviasi)

x = nilai analisis ke-i

x = rerata pengukuran

n = jumlah ulangan

Gunawan (1995) menyarankan analisis dilakukan 5-10 kali berulang dengan

harga RSD (Relative Standard Deviation) tidak boleh lebih besar dari 2 %. Nilai

RSD yang diperoleh dapat menunjukan ketelitian dari suatu metode uji :

RSD ≤ 1% : sangat teliti

1% < RSD ≤ 2% : teliti

36


2% < RSD ≤ 5% : ketelitian sedang

RSD > 5% : tidak teliti

(AOAC, 2005)

4. Limit deteksi (LOD/Limit of Detection) dan Limit Kuantitasi (LOQ/Limit of

Quantitation)

Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi

yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko. Batas

kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai

kuantitasi terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria

cermat dan seksama (Harmita, 2004)

Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode

analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak

menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit

dalam contoh pada pengenceran bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi

dapat dihitung dengan mengukur respon blanko beberapa kali lalu dihitung

simpangan baku respon blanko.

Nilai batas deteksi dapat dihitung menggunakan rumus di bawah ini:

= ( × )

Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (Batas Kuantitasi)

K = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantitasi

Sb = Simpangan baku respon analitik dari blanko

Sl = Arah garis linier (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap

konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y = a + bx)

Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis

regresi linier dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada

persamaan garis linier y = a + bx, sedangkan simpangan baku blanko sama dengan

simpangan baku residual (Sy/x) (Harmita, 2004).

5. Spesifisitas

Spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat

dan spesifik dengan adanya kemponen-komponen lain dalam matriks sampel

37


seperti ketidakmurnian, produk degradasi, dan komponen matriks. ICH membagi

spesifisitas dalam 2 kategori, yaitu:

a. Uji identifikasi, spesifisitas ditunjukkan dengan kemampuan suatu metode

analis untuk membedakan antar senyawa yang mempunyai struktur molekul

yang hampir sama.

b. Uji kemurnian atau pengukuran, spesifisitas ditunjukkan oleh daya pisah dua

senyawa yang berdekatan (sebagaimana dalam kromatografi). Senyawa-

senyawa tersebut biasanya adalah komponen utama atau komponen aktif dan

atau suatu pengotor. Jika dalam suatu uji terdapat pengotor maka metode uji

harus tidak berpengaruh dengan adanya pengotor ini.

6. Kisaran (range)

Kisaran suatu metode didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dan tertinggi

yang mana suatu metode menunjukkan akurasi, presisi, dan linieritas yang

mencukupi. Kisaran-kisaran konsentrasi yang diuji tergantung pada jenis metode

dan kegunaannya. Untuk pengujian komponen utama, maka konsentrasi baku

harus diukur di dekat atau sama dengan konsentrasi kandungan analit yang

diharapkan.

7. Ketahanan

Ketahanan merupakan kapasitas metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh

adanya variasi parameter metode yang kecil. Ketahanan dievaluasi dengan

melakukan variasi parameter-parameter metode seperti persentase pelarut organik,

kekuatan ionik, suhu dan sebagainya. Suatu praktik yang baik untuk mengevaluasi

ketahanan suatu metode adalah dengan memvariasi parameter-parameter penting

dalam suatu metode secara sistematis lalu mengukur pengaruhnya pada pemisahan

(Ibnu Gholib G, 2010).

8. Kesesuaian sistem

Sebelum melakukan analisis setiap hari, seorang analis harus memastikan

bahwa sistem dan prosedur yang digunakan harus mampu memberikan data yang

dapat diterima. Hal ini dapat dilakukan dengan percobaan kesesuaian sistem yang

didefinisikan sebagai serangkaian uji untuk menjamin bahwa metode tersebut

dapat menghasilkan akurasi dan presisi yang dapat diterima. Persyaratan-

38


persyaratan kesesuaian sistem biasanya dilakukan setelah dilakukan

pengembangan metode dan validasi metode (Ibnu Gholib G, 2010).

bab ii tinjauan pustaka -...

Documents