15

BAB 3

PERCOBAAN

Pada bab ini dibahas mengenai percobaan yang dilakukan meliputi bahan dan alat serta

prosedur yang dilakukan.

3.1 Bahan

Buah jeruk nipis, belimbing, jeruk lemon, vitamin C baku (PPOMN), sukrosa, metilen

biru, asam sulfat 2N, asam klorida 1N, kanji, iodium, kalium iodida, jingga metil, ferri

amonium sulfat, kupri sulfat, glukosa, EDTA, aquadestilata, gas nitrogen, karbon aktif,

diarsen trioksida, asam fosfat, natrium dihidrogen fosfat.

3.2 Alat

Alat gelas yang digunakan di laboratorium analisis, blender, pisau, spektrofluorometer

Shimadzu RF-540, kain batis, kertas saring, alat sentrifuga.

3.3 Penentuan kadar Vitamin C baku (FI IV,1995)

Penentuan kadar vitamin C dilakukan secara titrimetri menggunakan iodium 0,1N sebagai

peniter dan larutan kanji sebagai indikator.

3.3.1 Pembakuan Peniter

Iodium 0,1 N digunakan sebagai peniter. Pembakuan dilakukan menggunakan 100 mg

As2O3 yang dikeringkan dalam oven 1050C selama 1jam, dilarutkan dengan 5 ml natrium

hidroksida 1N, ditambah 25 ml air, 1 tetes jingga metil dan asam klorida 1N tetes demi

tetes hingga warna berubah menjadi merah muda. Kemudian ditambahkan 1 g natrium

bikarbonat, 25 ml air. Selanjutnya dititrasi menggunakan larutan iodium 0,1 N dengan

indikator kanji sampai berwarna biru.

3.3.2 Pembakuan Vitamin C

Vitamin C sebanyak 50 mg dilarutkan dalam 12,5 ml air ditambah 25 ml asam sulfat 2N

lalu dititrasi dengan larutan iodium 0,1 N menggunakan indikator kanji.

16

3.4 Penyiapan Larutan

Penyiapan larutan meliputi pembuatan larutan metilen biru, pembuatan larutan dapar,

antikelat, dan pembuatan larutan baku induk vitamin C

3.4.1 Pembuatan Larutan Standar Metilen Biru

Larutan standar Metilen Biru disiapkan dengan konsentrasi 10-2 mol/L dengan melarutkan

Metilen biru dihidrat sebanyak 35,58 mg dalam 10 ml air suling bebas oksigen.

3.4.2 Pembuatan Pereaksi Metilen Biru

Pembuatan larutan metilen biru dilakukan dengan pengenceran dari larutan baku induk

sehingga diperoleh larutan uji metilen biru dengan kadar yang diinginkan dengan cara

memipet sejumlah larutan induk kemudian digenapkan dengan air suling bebas oksigen.

3.4.3 Pembuatan Larutan Induk Vitamin C

Larutan baku induk dibuat dengan melarutkan 44,79 mg asam askorbat baku dalam 25 ml

larutan dapar. Larutan disimpan dalam botol berwarna gelap. Jika akan digunakan, maka

dilakukan pengenceran terhadap larutan induk menggunakan dapar sampai diperoleh

konsentrasi yang diinginkan. Pembuatan larutan induk dibuat segar setiap hari.

3.4.3 Pembuatan Larutan Uji Vitamin C

Pembuatan larutan vitamin C dilakukan dengan pengenceran dari larutan baku induk

sehingga diperoleh larutan uji vitamin C dengan kadar yang diinginkan dengan cara

memipet sejumlah larutan induk kemudian digenapkan dengan menggunakan dapar.

3.5 Pengaturan Kondisi Pengukuran

Sebelum dilakukan pengukuran dilakukan pemilihan kondisi yang optimum.

3.5.1 Penentuan panjang gelombang emisi dan panjang gelombang eksitasi

Pembuatan spektrum emisi dan eksitasi metilen biru dilakukan dengan pengukuran pada

berbagai panjang gelombang eksitasi dan emisi metilen biru 5.10-6 mol/L Ditentukan juga

panjang gelombang eksitasi dan emisi yang memberikan Intensitas fluoresensi untuk

blanko.

17

3.5.2 Pengaruh pH Terhadap Intensitas Fluoresensi

Dibuat larutan satu seri larutan baku vitamin C, kemudian ditambahkan dapar masing-

masing pada pH 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 6 dan ditambahkan pereaksi metilen biru. Intensitas

fluoresensi larutan diukur pada tiap pH yang berbeda.

3.5.3 Pengaruh Waktu Reaksi Terhadap Intensitas Fluoresensi

Dibuat satu seri larutan baku vitamin C kemudian ditambahkan metilen biru. Selanjutnya

dilakukan pengukuran intensitas fluoresensi menggunakan spektrofluorometer untuk

melihat kestabilan reaksi setiap 15 detik mulai 0 detik hingga 300 detik, ditentukan juga

pengukuran blanko.

3.6 Penentuan Pengaruh Matriks Terhadap Pengukuran

Penentuan pengaruh matriks dimaksudkan untuk mencegah terjadinya gangguan oleh

matriks yang terdapat dalam jus buah-buahan.

3.6.1 Pengaruh Glukosa dalam Berbagai Konsentrasi

Ke dalam 6 wadah yang berbeda dimasukkan sejumlah 0,1,2,5,8,10 ml larutan glukosa

2.10-5mol/L. Kemudian ke dalam masing-masing wadah ditambahkan 5 ml larutan vitamin

C baku 2.10-7mol/L, dan ditambahkan larutan dapar hingga 20ml. Larutan dari masing-

masing wadah direaksikan dengan metilen biru 5.10-6mol/L kemudian diukur intensitas

fluoresensi dari metilen biru. Diukur juga intensitas fluoresensi larutan blanko.

3.6.3 Pengaruh logam Cu2+

Ke dalam 5 wadah yang berbeda dimasukkan sejumlah 0,2,4,6,8,10 ml larutan tembaga

sulfat 10µg/ml kemudian ditambahkan larutan vitamin C baku ke dalam masing-masing

wadah. Larutan dari masing-masing wadah direaksikan dengan metilen biru 5.10-6mol/L

kemudian diukur intensitas fluoresensi dari metilen biru.

3.6.4 Pengaruh logam Fe3+

Ke dalam 5 wadah yang berbeda dimasukkan sejumlah 0,2,4,6,8,10 ml larutan besi(III)

amonium sulfat 10µg/ml kemudian ditambahkan larutan vitamin C baku ke dalam masing-

masing wadah. Larutan dari masing-masing wadah direaksikan dengan metilen biru

5.10-6mol/L kemudian diukur intensitas fluoresensi dari metilen biru.

18

3.6.5 Pengaruh Penambahan EDTA

Ke dalam 5 wadah yang berbeda dimasukkan sejumlah 0,1,2,3,4 ml larutan EDTA

0,4mg/ml masing-masing ditambahkan 10ml larutan vitamin C baku, 1ml larutan tembaga

sulfat 3µg/ml, 1ml larutan besi amonium sulfat 2µg/ml dan ditambahkan larutan dapar

hingga 20ml. Larutan dari masing-masing wadah direaksikan dengan metilen biru

5.10-6mol/L kemudian diukur intensitas fluoresensi dari metilen biru. Diukur juga

intensitas fluoresensi larutan blanko.

3.7 Validasi Metode

Penentuan validasi metode meliputi penentuan kelinearan, kepekaan, kecermatan (akurasi),

batas deteksi, batas kuantisasi, dan keseksamaan (presisi).

3.7.1 Kelinieran

Penentuan kelinieran dibuat dengan menggunakan beberapa larutan baku vitamin C

dengan konsentrasi pada rentang 1.10-7mol/L sampai 8.10-7mol/L yang direaksikan dengan

metilen biru pada konsentrasi 5.10-6mol/L. Respon intensitas fluoresensi terhadap

konsentrasi ditetapkan pada panjang gelombang eksitasi 664nm dan emisi 670nm.

Selanjutnya dihitung keliniearannya.

3.7.2 Kepekaan

Kepekaan ditentukan dengan penghitungan batas deteksi dan batas kuantisasi yang

dihitung dari kurva kalibrasi (metode Miller-Miller).

3.7.3 Kecermatan

Kecermatan ditentukan dengan penghitungan persen perolehan kembali dari sampel

simulasi. Metilen biru direaksikan dengan simulasi larutan vitamin C (dalam air, sukrosa,

sukrosa dan glukosa) dengan konsentrasi 2.10-7, 6.10-7 dan 8.10-7mol/L. Pengukuran

dilakukan sebanyak tiga kali pengukuran untuk setiap sampel. Pengukuran dilakukan

dengan menggunakan metode spektrofluorometri dan titrasi iodometri.

3.7.4 Keseksamaan

Penentuan keseksamaan dilakukan terhadap larutan baku dan larutan sampel. Pengukuran

keseksamaan untuk larutan baku dilakukan dengan mengukur intensitas fluoresensi dengan

konsentrasi larutan baku vitamin C pada rentang konsentrasi 10-7 sampai 8.10-7mol/L

19

sebanyak 3 kali setiap hari selama 3 hari. Pengukuran keseksamaan sampel dilakukan pada

salah satu larutan sampel jus buah yang diukur sebanyak 10 kali kemudian dihitung

Koefisien Variasi (KV) intensitas fluoresensi.

3.8 Penentuan kurva kalibrasi

Larutan Metilen Biru 5.10-6 mol/L masing-masing direaksikan dengan satu seri larutan

stok Asam askorbat pada konsentrasi yang berbeda, dengan panjang gelombang eksitasi

sesuai dengan panjang gelombang eksitasi yang telah ditentukan. Selanjutnya dibuat kurva

kalibrasi antara intensitas fluoresensi metilen biru terhadap kadar vitamin C dengan

rentang 1.10-7 – 8.10-7mol/L.

3.9 Pembuatan jus buah-buahan

Buah-buahan dicuci dan dikupas kulitnya bila perlu. Buah ditimbang lalu dipotong kecil-

kecil kemudian dihaluskan dengan blender selama beberapa menit sampai diperoleh hasil

yang homogen. Jus yang dihasilkan kemudian disaring menggunakan kain batis. Filtrat

hasil penyaringan disentrifuga kemudian larutan supernatan diambil.

3.10 Penetapan kadar Vitamin C dalam jus buah-buahan.

Sebelum dilakukan penetapan kadar, larutan supernatan dari sampel jus buah-buahan

ditambahkan larutan EDTA kemudian ditambahkan dapar fosfat pH 3,88 hingga 100 ml

dalam labu ukur. Penetapan kadar dilakukan menggunakan metode spektrofluorometri dan

metode titrasi iodometri. Penetapan kadar menggunakan metode spektrofluorometri

dengan cara sampel jus buah-buahan direaksikan dengan metilen biru. Kemudian dihitung

penurunan intensitas fluoresensi dari larutan dan diukur pada panjang gelombang eksitasi

664nm dan emisi 670 nm. Penetapan kadar menggunakan metode titrasi iodometri dengan

mengunakan peniter iodium 0,1N dan larutan kanji sebagai indikator. Hasil penetapan

dengan metode spektrofluorometri dan metode titrimetri dibandingkan dengan

menggunakan uji t berpasangan.