BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Salah satu bagian yang penting dalam mikrobiologi adalah pengetahuan tentang cara-

cara mematikan, menyingkirkan, dan menghambat pertumbuhan mikroorganisme.

Selain itu lingkungan dan tempat mikroba ini pun berbeda-beda misalnya dalam darah,

makanan, air, sampah, roil, dan tanah. Hal tersebut juga dapat dijadikan sebagai bahan

pertimbangan untuk menentukan cara untuk menghancurkan mikroorganisme yang

digunakan tergantung pada pengetahuan, keterampilan dan tujuan dari yang

melaksanakannya, sebab tiap situasi yang dihadapi merupakan kenyataan-kenyataan

dasar yang dapat menuntun pada cara atau prosedur yang harus dilakukan

Tindakan untuk membebaskan alat atau media dari mikroba adalah dengan sterilisasi.

Secara umum, sterilisasi dapat dilakukan dengan cara mekanik, fisik dan kimia. Teknik

aseptis dibutuhkan untuk mencegah ataupun mengurangi kontaminasi yang tidak

diinginkan. Mikroba memiliki karakteristik serta ciri yang berbeda dalam persyaratan

pertumbuhannya. Karakteristik persyaratan pertumbuhan mikroba inilah yang

menyebabkan bermacam-macamnya media penunjang pertumbuhan mikroba. Dalam

melakukan kegiatan tersebut diperlukan keahlian dan keterampilan khusus. Hal inilah

yang melatar belakangi dilaksanakannya praktikum ini.

Oleh karena itu percobaan ini dilakukan untuk mengetahui perkembangan mikroba di

suatu media yang di sebut PDA dan NA, dan mengaplikasikannya di kehidupan sehari-

hari. Dalam praktikum ini diharapkan ketelitian dan kestrerilan praktikan, karena semua

berpengaruh pada individu praktikan

1.2 Tujuan

1. Mengetahui teknik dasar isolasi bakteri dengan menggunakan medium PDA dan

NA

2. Mengetahui cara identifikasi dasar mikroba

3. Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi proses pertumbuhan bakteri

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-

zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya.

Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang

dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan

isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media

pertumbuhannya (Dwijeoseputro, 2005).

Bahan-bahan media pertumbuhan

1. Bahan dasar

air (H2O) sebagai pelarut

Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi

oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45 oC.

Gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer asam

amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis

mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar (Dwijeoseputro, 2005).

Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai

pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi

mikroorganisme autotrof obligat.

2. Nutrisi atau zat makanan (Dwijeoseputro, 2005):

Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu

berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur

pelikan/trace element.

Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik

sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik

antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organic.

Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain.

Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.

3. Bahan tambahan

Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan

tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator

perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan

untuk menghambat pertumbuhan mikroba non-target/kontaminan (Irianto, 2006).

4. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media (Irianto, 2006):

Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan terbuat dari

beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling) yang

pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. Jika

dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus diasuk

dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama

dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang asam.

Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver,

darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung pada

bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.

Meat extract. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa, plasenta

dan daging sapi.

Yeast extract. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol.

Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex).

Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino

dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam amilum,

glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, dan manitol. Konsentrasi yang ditambahkan

untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.

Macam-Macam Media Pertumbuhan (Machmud, 2008):

1. Medium berdasarkan sifat fisik

Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media

menjadi padat

Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3 - 0,4% sehingga

menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan

tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak

mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada

media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau

kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan

mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen,

misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan

metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media

(Hadioetomo, 1993).

Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient

Broth), LB (Lactose Broth) (Hadioetomo, 1993).

2. Medium berdasarkan komposisi

Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan

takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar (Hadioetomo,

1993).

Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti,

misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak

kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang

komposisi senyawa penyusunnya (Hadioetomo, 1993).

Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat

diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya

Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract (Hadioetomo,

1993).

3. Medium berdasarkan tujuan

Media untuk isolasi

Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya

Nutrient Broth, Blood Agar (Irianto, 2006).

Media selektif/penghambat

Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media

tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan

mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah

Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan

yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh

Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam (Irianto, 2006).

Media diperkaya (enrichment)

Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan

mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media

diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan

dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak,

tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar,

Serum Agar. (Irianto, 2006).

Media untuk peremajaan kultur

Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur (Waluyo, 2007).

Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.

Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu

mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji

kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon (Waluyo, 2007).

Media untuk karakterisasi bakteri

Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-

kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya

adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar (Waluyo, 2007).

Media diferensial

Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar

karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar

Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran

koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni (Waluyo, 2007).

Salah satu teknik dasar dalam analisa mikrobiologi adalah teknik transfer aseptis (suatu

metode atau teknik di dalam memindahkan atau mentransfer kultur bakteria dari satu

tempat ke tempat lain secara aseptis agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke

dalam kultur). Teknik ini sangat esensial dan kunci keberhasilan prosedur mikrobial

yang harus diketahui oleh seorang yang hendak melakukan analisis mikrobiologi.

Pengambilan sampel harus dilakukan secara statistik agar tidak bias, jadi secara acak

(random sampling). Selain itu, digunakan teknik aseptis selama pengambilan sampel

agar tidak terjadi pencemaran. Alat-alat yang digunakan harus steril. Bahan makanan

cair diambil dengan pipet steril, makanan padat menggunakan pisau, garpu, sendok atau

penjepit yang steril (Waluyo, 2007).

Teknik transfer aseptis adalah suatu metode atau teknik di dalam memindahkan atau

mentransfer kultur bakteria dari satu tempat ke tempat lain secara aseptis agar tidak

terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur. Teknik transfer aseptis ini sangat

esensial dan kunci keberhasilan prosedur mikrobial yang harus diketahui oleh seorang

yang hendak melakukan analisis mikrobiologi (Hadioetomo, 1993).

A. Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut

harus memenuhi syarat-syarat antara lain :

a. Harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba

b. Harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan pH yang sesuai

dengan kebutuhan mikroba yang ditumbuhkan

c. Harus mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba

d. Harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang

diinginkan dapat tumbuh baik (Waluyo, 2007).

B. Macam-macam media

Media dapat digolongkan berdasarkan atas susunan  kimianya, sifat wujudnya dan

fungsinya. Penggolongan media berdasarkan susunan kimia :

1. Media anorganik. Yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan anorganik

2. Media organik. Yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan organik

3. Media sintetik (media buatan). Yaitu media yang susunan kimianya diketahui

dengan pasti. Media ini umumnya digunakan untuk mempelajari kebutuhan

makanan suatu mikroba

4. Media non sintetik. Yaitu media yang susunan kimianya tidak dapat ditentukan

dengan pasti. Media ini umumnya digunakan untuk menumbuhkan dan

mempelajari taksonomi mikroba (Waluyo, 2007).

C. Penggolongan media berdasarkan sifat wujud

a. Media cair yaitu media yang berbentuk cair

b. Media padat. Yaitu media yang berbentuk padat. Media ini dapat berupa bahan

organik alamiah, misalnya yang dibuat dari kentang, wortel, dan lain-lain, atau

dapat juga berupa bahan anorganik misalnya silica gel

c. Media padat yang dapat dicairkan, (semi solid), yaitu yang apabila dalam keadaan

panas berbentuk cair, sedangkan dalam keadaan dingin berbentuk padat, misalnya

media agar (Waluyo, 2007).

D. Penggolongan media berdasarkan fungsinya

a) Media diperkaya yaitu media yang ditambahi zat-zat tertentu misalnya serum darah

ekstrak tanaman dan lain sebagainya, sehinggan dapat digunakan untuk

menumbuhkan mikroba yang bersifat heterotrof.

b) Media selektif yaitu media yang ditambahi zat kimia tertentu untuk mencegah

pertumbuhan mikroba lain (bersifat selektif). Misalnya media yang mengandung

Kristal violet pada kadar tertentu dapat mencegah pertumbuhan bakteri gram positif

tanpa mempengaruhi pertumbuhan bakteri gram negative.

c) Media diferensial yaitu media yang ditambahi zat kimia (bahan) tertentu yang

menyebabkan suatu mikroba membentuk pertumbuhan atau mengadakan perubahan

tertentu sehingga dapat dibedakan tipe-tipenya. Misalnya media daerah agar dapat

digunakan untuk membedakan bakteri homolitik (pemecah darah) dan bakteri non

hemolitik.

d) Media penguji yaitu media dengan susunan tertentu yang digunakan untuk

pengujian vitamin. Vitamin asam-asam amino, antibiotik dan lain sebagainya.

e) Media untuk perhitungan jumlah mikroba yaitu media spesifik yang digunakan

untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan.

f) Media khusus yaitu media untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan

kemampuannya untuk mengadakan perubahan-perubahan kimia tertentu (Waluyo,

2007).

E. Cara pembuatan media

Garis besar pembuatan media yang tersusun atas beberapa bahan adalah sebagai berikut:

1. Mencampur bahan-bahan: bahan-bahan yang dilarutkan dalam air suling.

Kemudian dipanaskan dalam pemanas air supaya larutannya homogen.

2. Menyaring: beberapa jenis media kadang-kadang perlu disaring, dan sebagai

penyaringan dapat digunakan kertas saring, kapas atau kain. Untuk media agar atau

gelatin penyaringan harus dilakukan dalam keadaan panas.

3. Menentukan dan mengatur pH: penentuan pH media dapat dilakukan dengan

menggunakan kertas pH, pH meter atau dengan komparator blok. Pengaturan pH

media dapat dilakukan dengan penambahan asam atau basa (organik atau

anorganik).

4. Memasukkan media ke dalam tempat tertentu: sebelum disterilakan, media

dimasukkan ke dalam tabung reaksi, erlenmeyer atau wadah lain yang bersih,

kemudian dibungkus kertas sampul (kertas perkamen) supaya tidak basah sewaktu

disterilkan.

5. Steril: pada umumnya merupakan sterilisasi media dilakukan dengan uap panas di

dalam autoclave, pada suhu 121°C selama 15 - 30 menit (Dwidjoseputro, 2005).

F. Media biak dan persyaratan bagi pertumbuhan

Media biak kompleks untuk banyak mikroorganisme bertuntutan tinggi belum dikenal

benar bahan-bahan makanan yang diperlukan. Orang membiakkannya dalam larutan

biak yang mengandung ekstrak ragi, otolisat ragi, pepton, atau ekstak daging. Untuk

beberapa kelompok organisme lazim juga digunakan: rempah-rempah, dekok rumput

kering, sari buah prem, sari buah wortel, santan dan untuk cendawan kupofil juga sari

perasan tahi kuda. Mengingat biaya, larutan-larutan baik tidak dibentuk dari senyawa-

senyawa murni tetapi lebih disukai untuk menggunakan zat-zat kompleks, seperti air

didih, melaso, air rendaman jagung atau ekstrak kedelai, yang sebagai produk sisa

tersedia dengan harga murah. Media bak seperti ini disebut media bak kompleks.

(Dwidjoseputro, 2005).

Mikroorganisme yang ingin kita tumbuhkan, yang pertama harus dilakukan adalah

memahami kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan

yang akan digunakan. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagai

komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel.

Pembuatan medium sebaiknya menggunakan air suling. Air sadah umumnya

mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi. Pada medium yang mengandung

pepton dan ektrak daging, air dengan kualitas air sadah sudah dapat menyebabkan

terbentuknya endapan fosfat dan magnesium fosfat (Hadioetomo, 1993).

Alat yang akan digunakan dalam suatu penelitian atau praktikum harus disterilisasi

terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan peralatan tersebut dari semua

bentuk kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua

organisme yang teradapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi

3 macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas), penyaringan,

penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan

glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo, 1993).

Memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan untuk menumbuhkan

mikroorganisme di dalamnya harus memperhatikan berbagi macam ketentuan seperti

jika yang ingin kita membuat medium untuk organisme bersel tunggal, biasanya air

sangat penting sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien

ke dalam sel. Pembuatan medium agar padat, digunakan agar-agar, gelatin atau gel

silika. Bahan agar yang utama adalah galaktan (komplek karbohidrat yang diekstrak

dari alga genus Gelidium). Agar akan larut atau cair pada suhu hampir 100oC dan akan

cair apabila kurang lebih 43oC (Hadioetomo, 1993).

Organisme hidup memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya. Subtansi kimia organik

dan anorganik diperoleh dari lingkungan dalam berbagai macam bentuk. Nutrien

diambil dari likungan kemudian ditransformasikan melalui membran plasma menuju

sel. Di sel beberapa nutrisi diolah menghasilkan energi yang digunakan dalam proses

seluler (Hadioetomo, 1993).

Bakteri dalam medium juga memerlukan makanan untuk pertumbuhannya. Bakteri yang

tidak punya akar harus berada pada permukaan larutan makanan yang cair.

Pertumbuhan bakteri berarti meningkatnya jumlah sel yang konstituen (yang

menyusun). Apabila disusun 10 bakteri dalam 1 ml medium yang cocok dan 24 jam

kemudian ditemukan 10 juta bakteri tiap milimeternya, maka terjadilah pertumbuhan

bakteri. Meningkatnya jumlah bakteri terjadi dengan proses yang disebut dengan

pembelahan biner, dimana setiap bakteri membentuk dinding sel baru (Hadioetomo,

1993).

Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga memerlukan pH yang tepat.

Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang terlalu basa, kecuali Vibrio

cholerae yang dapat hidup pada pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang

perlu dikendalikan. Kelompok terbesar yaitu mesofil, suhu optimum untuk

pertumbuhannya 20 - 40oC (Dwidjoseputro, 2005).

pH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam pembuatan

medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok untuk

dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut.

Medium didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa

medium masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan

medium yang steril juga menentukan (Dwidjoseputro, 2005).

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang

berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan mempergunakan bermacam-macam

media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan

perhitungan jumlah mikroba (Hadioetomo, 1993).

Macam-Macam Media Pertumbuhan yaitu:

a. Medium berdasarkan sifat fisik

Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin

media menjadi padat.

Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga

menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat

dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media

tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri

yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan

membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair

maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk

mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi

anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga

diharuskan tumbuh merata diseluruh media.

Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB

(Nutrient Broth), LB (Lactose Broth). (Hadioetomo, 1993).

b. Medium berdasarkan komposisi

Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan

takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.

Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara

pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan

ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara

detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.

Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat

diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya,

misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.

(Hadioetomo, 1993).

c. Medium berdasarkan tujuan

Media untuk isolasi, media ini mengandung semua senyawa esensial untuk

pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.

Media selektif/penghambat, media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah

suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain

dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria

Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten

antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang

ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran

terhadap garam.

Media diperkaya (enrichment), media diperkaya adalah media yang mengandung

komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks

seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk

mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya

membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan

komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar.

Media untuk peremajaan kultur, media umum atau spesifik yang digunakan untuk

peremajaan kultur.

Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik. Media ini digunakan unutk

mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah

Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan

asam sitrat sebagai sumber karbon.

Media untuk karakterisasi bakteri, media yang digunakan untuk mengetahui

kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk

menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose

Broth, Arginine Agar.

Media diferensial, media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari

campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial,

misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobakteria

berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling

koloni. (Hadioetomo, 1993).

Biakan murni bakteri adalah biakan yang terdiri atas satu spesies bakteri yang

ditumbuhkan dalam medium buatan. Medium buatan tersebut berfungsi sebagai

medium pertumbuhan. Pada medium ini bakteri dapat tumbuh dan berkembangbiak.

Bahan dasar yang digunakan untuk medium pertumbuhan ini adalah agar-agar. Untuk

bakteri heterotrof, medium dilengkapi dengan air, molekul makanan (misal gula)

sumber nitrogen dan mineral (Hadioetomo, 1993).

BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Media Peertumbuhan Mikroba dilaksanakan pada hari Kamis, tanggal 01

November 2012, pukul 15.30-17.30 WITA dan Pengamatan dilakukan pada hari Sabtu,

03 November 2012, pukul 11.00-12.00 WITA di Laboratorium Rekayasa Lingkungan

Fakultas Teknik Universitas Mulawarman Samarinda.

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

1. Labu Erlenmeyer

2. Tabung Reaksi

3. Cawan Petri

4. Spatula

5. Stirrer

6. Batang Pengaduk

7. Hot Plate

8. Korek api

9. Neraca Digital

10. Lampu Bunsen

11. Alat Tulis

12. Inkubator

13. Yellow Tip

14. Mikro Pipet

15. Bulp

16. Rak Tabung Reaksi

17. Pipet Ukur

18. Medical Stirilizer

3.1.2 Bahan

1. Akuades

2. Kue Binka

3. Kertas Label

4. Tisu

5. Serbet ( Lap kain )

6. Alumunium Foil

7. NA (Nutrient Agar)

8. PDA (Potato Dextrose Agar)

9. Sabun Cuci

10. Alcohol 70%

11. Sarung Tangan

12. Sampel Kulit Kepala

13. NaCl 0,9%

3.2 Cara Kerja

3.2.1 Pertumbuhan Mikroba dalam Media NA (Nutrient Agar)

1. Disterilkan tangan terlebih dahulu dengan menggunakan sabun cuci, setelah itu

dibersihkan dengan akuades, setelah kering disemprot dengan alkohol

2. Dimasukkan larutan NaCl 9 ml ke dalam tabung reaksi, setelah itu beri kertas label

dan diberi keterangan pada tabung reaksi pertama di tulis angka 1, tabung reaksi

kedua di tulis10-1, dan tabung reaksi ketiga 10-2

3. Ditimbang sampel kue binka sebanyak 1 gr, kemudian dicacah agar lebih halus dan

mudah larut

4. Dinyalakan lampu bunsen, dekatkan ujung tabung reaksi dengan lampu bunsen,

lalu dibuka alumunium foil yang menutupi ujung tabung reaksi, setelah terbuka

alumunium foilnya

5. Diputar-putar ujung tabung reaksi dekat lampu bunsen agar tidak ada mikroba yang

masuk, lalu masukkan sampel kue binka yang telah dihaluskan ke dalam tabung

reaksi, kemudian ditutup kembali dengan alumunium foil dan dihomogenkan agar

tercampur

6. Dipasang yellow tip pada ujung mikro pipet

7. Diputar-putar terlebih dahulu ujung tabung reaksi sama seperti tabung reaksi

sebelumnya dekat lampu bunsen agar tidak ada mikroba yang masuk dalam tabung

tersebut.

8. Diambil larutan sampel yang telah dihomogenkan sebanyak 0,1 ml, lalu

dimasukkan ke dalam tabung reaksi 10-1, lalu ditutup kembali dan dihomogenkan

agar tercampur

9. Dilakukan hal yang sama pada tabung reaksi 10-2 , setelah dibuka alumunium foil

10. Dimasukkan sampel dari tabung reaksi 10-1 ke dalam tabung reaksi 10-2 dan ditutup

kembali ujung tabung reaksi

11. Diambil dua buah cawan petri yang sudah disterilkan didalam oven

12. Diambil sampel kue binka yang ada ditabung reaksi 10-1, dimasukkan ke dalam

cawan petri yang dibuka perlahan dekat lampu bunsen agar tidak ada mikroba yang

masuk ke dalamnya setelah itu ditutup kembali

13. Diambil sampel kue binka yang ada ditabung reaksi 10-2, dimasukkan ke dalam

cawan petri yang dibuka perlahan dekat lampu bunsen agar tidak ada mikroba yang

masuk ke dalamnya setelah itu ditutup kembali

14. Dimasukkan media NA ke dalam dua cawan petri yang diberi kertas label dengan

NA1 10-1 dan NA2 10-2 sebanyak 15 ml, cara memasukkannya tidak boleh dengan

membuka cawan tersebut terlalu terbuka, karena akan ada mikroba yang masuk,

sehingga memasukkannya dengan membuka tutupnya sedikit lalu dimasukkan NA

tersebut pada cawan petri. Setelah itu dimasukkan ke dalam inkubator. Pada NA

inkubasi selama 24 jam pada suhu 37,5°C

3.2.2 Pertumbuhan Mikroba dalam Media PDA ( Potato Dextrose Agar )

1. Disiapkan cawan petri yang berisi PDA

2. Dibimbing oleh asisten cara untuk memegang cawan petri dengan benar, salah satu

dari praktikan dapat menggesekkan atau menyentuh kulit kepala dengan ujung jari

tangan kanan

3. Diletakkan ujung jari tangan tersebut ke dalam cawan petri yang telah berisi PDA,

4. Dibuka penutupnya sedikit lalu tutup, jika terlalu lama dapat membuat mikroba

yang ada dilingkungan dapat masuk ke dalam cawan petri

5. Dimasukkan ke dalam inkubator. Pada PDA untuk proses inokulasi selama 48 jam

pada suhu 37,5°C

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

4.1.1 Tabel Hasil Pengamatan

No

.

Identifikasi Gambar

1. 1. Spesies 1

Bentuk : Irregular

Margin : Entire

Elevasi : Umbonate

2. Kontaminan

2. 1. Spesies 1

Bentuk : Circular

Margin : Entire

Elevasi : Conveks

2. Tanpa kontaminan

3. 1. Spesies 1

Bentuk : Circular

Margin : Entire

Elevasi : Convex

2. Tanpa kontaminan

4.2 Pembahasan

Fungsi dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba

yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran

tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan

1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran

berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya.

Normal saline atau bisa disebut juga NaCl 0,9 %. Cairan merupakan cairan yang

bersifat fisiologis, non toksik dan tidak mahal. NaCl dalam setiap liternya mempunyai

komposisi Natrium Klorida 9,0 gram dengan osmolalitas 308 mOsm/l setara dengan

ion-ion Na+154 mEq/l dan Cl 154 mEq/l. Natrium Klorida 0,9% adalah larutan

fisiologis yang ada diseluruh tubuh, karena alasan ini, tidak ada reaksi hipersensitivitas

dari Natrium Klorida. Normal saline aman digunakan untuk kondisi apapun. Natrium

Klorida mempunyai Na dan Cl yang sama seperti plasma. Larutan ini tidak

mempengaruhi sel darah merah. Natrium Klorida tersedia dalam beberapa konsentrasi,

yang paling sering digunakan Natrium Klorida 0,9%. Ini adalah konsentrasi normal dari

Natrium Klorida dan untuk alasan ini Natrium Klorida disebut juga normal saline.

Natrium Klorida 0,9% merupakan larutan isotonis aman untuk tubuh, tidak iritan

melindungi granulasi jaringan dari kondisi kering, menjaga kelembaban sekitar luka dan

membantu luka menjalani proes penyembuhan.

Faktor kesalahan pada praktikum kali ini adalah saat memasang yellow tip, pada saat

mengambil cairan pada tabung reaksi menggunakan pipet mikro yang ujungnya diberi

yellow tip, yellow tipe tidak terpasang dengan benar sehingga yellow tip jatuh didalam

tabung reaksi. Kesalahan kedua yaitu saat menyentuh PDA terlalu bertenaga yang di

khawatirkan akan merusak PDA tersebut. Maka dari itu kita harus berhati-hati dalam

menyentuh PDA

Fungsi pengadukan angka “8” pada praktikum kali ini adalah untuk menghomogenkan.

Menghomogenkan antara larutan NaCl, sampel (air kelapa) dan NA. dan juga

pengadukan angka “8” tersebut membuat larutan homogeny secara sempurna

Metode yang digunakan pada praktikum kali ini adalah metode aseptik dan metode

cawan tuang. Metode aseptik adalah suatu sistem cara bekerja atau praktek yang

menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah

kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Dasar digunakannya

metode aseptik adalah adanya banyak partikel debu yang mengandung mikroorganisme

(bakteri atau spora) yang mungkin dapat masuk ke dalam cawan, mulut erlenmeyer,

atau mengendap di area kerja. Pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan ini dapat

mempengaruhi atau mengganggu hasil dari suatu percobaan. Mikroorganisme dapat

juga ”jatuh” dari tangan operator, sarung tangan atau jas laboratorium karena

pergerakan lengan yang relatif cepat. Penggunaan metode aseptik meminimalisir

material yang digunakan terhadap agen pengontaminasi. Pada kenyataanya metode

aspetik tidak dapat melindungi secara sempurna dari bahaya kontaminan. Namun

semakin banyak belajar dari pengalaman maka semakin mengurangi resiko yang

ditimbulkan. Metode aseptik seharusnya digunakan saat kita bekerja dengan

mikroorganisme hidup dan dengan segala media pertumbuhannya, digunakan ketika

kita tidak ingin larutan dari suatu botol tidak berubah sifat akibat aktivitas

mikroorganisme, seperti saat membuat buffer meskipun buffer dengan konsentrasi

garam tinggi atau mengandung deterjen. Selain itu,teknik aseptik juga digunakan pada saat kita

bekerja menggunakan agen atau senyawa yang berbahaya seperti bahan kimia beracun atau

bahan radioaktif. Tentu saja perlindungan dirisendiri dari bahaya senyawa ini lebih

penting. Metode aseptik ini dilakukan guna melindungidari dari kontaminan. Sumber

kontaminan sendiri ada beberapa macam, yaitu eksplan, mikroba, alat kultur ,

lingkungan kerja dan kecerobohan pelaksanaan. Sedangkan metode cawan tuang dapat

disebut juga sebagai metode pour plate adalah suatu metode dalam menumbuhkan

mikroorganisme dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar cair dengan

stok kultur. Teknik ini umumnya digunakan pada metode Total Plate Count (TPC).

Metode ini dilakukan pada saat praktikum yaitu, sampel sebanyak 0.1 ml dipipet dari

masing-masing larutan dengan faktor pengenceran 10-1 dan 10-2. Sampel dari masing-

masing tabung dimasukkan ke dalam cawan petri. Media NA cair bersuhu sebanyak 15

ml dimasukkan ke dalam masing-maing cawan petri. Kemudian campuran sampel dan

media digoyangkan secara pelan-pelan membentuk angka “8” sampai tercampur merata.

Campuran dibiarkan hingga padat kemudian diletakkan secara terbalik untuk diinkubasi

pada suhu kamar selama 48 jam.

Jenis bakteri menurut hasil pengamatan pada praktikum dapat diidentifikasi yaitu, pada

cawan petri PDA yang diamati berbentuk irregular, bagian margin berbentuk entire,

dan elevasi berbentuk umbonate serta pada cawan tersebut terdapat kontaminan. Pada

cawan petri NA 1 terdapat 1 spesies, berbentuk circular, margin berbentuk entire, dan

elevasi berbentuk convex serta pada cawan tidak terdapat kontaminan. Sedangkan pada

cawan NA 2 terdapat 1 spesies, berbentuk circular, margin berbentuk entire, dan elevasi

berbentuk convex serta pada cawan tidak terdapat kontaminan.

Media PDA pada praktikum kali ini hanya digunakan untuk menguji kulit kepala

sebagai sampel. Pertama-tama disiapkan dua buah cawan petri dan dibuka kedua cawan

petri tersebut kemudian tempelkan tangan pada kulit kepala lalu masukkan sampel kulit

kepala tersebut kedalam cawan petri dan ditutup kembali cawan petri. Pengamatan yang

telah dilakukan menunjukkan bahwa terdapat beberapa kesalahan yang terjadi,

diantaranya tumbuhnya koloni bakteri pada media PDA. Hal ini disebabkan karena

PDA mengandung nutrisi yang mencukupi untuk pertumbuhan bakteri, sehingga bakteri

juga mampu tumbuh pada media PDA. Selain itu, tidak diberikannya antiseptic pada

media PDA yang digunakan, sehingga bakteri akan mengkontaminasi pada media PDA

tersebut.

Posisi cawan petri diletakkan terbalik karena selama inkubasi terbentuk air yang

mengembun di dalam cawan petri. Air akan menetes dari tutup cawan ke permukaan.

Hal ini akan menghasilkan suatu masa pertumbuhan yang menganak sungai dan

menghancurkan pembentukan koloni secara individu. Untuk menghindari hal ini, maka

ketika diinkubasi, bagian bawah cawan petri diletakkan di atas atau terbalik.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

a. Teknik dasar isolasi yang paling sederhana adalah dengan cara pengenceran. Pada

media NA mikroba yang tumbuh adalah bakteri, sedangkan pada mikroba PDA

yang tumbuh adalah jamur.

b. Cara identifikasi dasar mikroba meliputi 5 hal, yaitu warna, form, margin,

permukaan, dan elevation.

c. Faktor-faktor yang mempengaruhi isolasi mikroba meliputi kesterilan alat, nutrisi

PDA dan NA, pH, suhu, oksigen, tekanan osmotik, dan lingkungan.

5.2 Saran

Diharapkan pada percobaan media pertumbuhan mikroba selanjutnya memakai sampel

lain seperti makanan fast food agar kita tahu pertumbuhan mikroba di dalamnya

DAFTAR PUSTAKA

1. Dwijoseputro, D. 2005 . Dasar–Dasar Mikrobiologi . Penerbit Djambatan : Jakarta

2. Irianto . 2006 . Mikrobiologi . Gramedia : Jakarta

3. Waluyo . 2007 . Mikrobiologi Umum . UMN : Malang

4. Hadioetomo, R. S . 1993 . Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek . Gramedia : Jakarta