laprak pcr4
Post on 04-Jun-2018
222 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
8/13/2019 laprak PCR4
1/11
LAPORAN PRAKTIKUM
ISOLASI DNA GENOM, PCR, ELEKTROFORESIS
Disusun oleh :
Weda Kusuma
G0007025
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SEELAS MARET
2007
-
8/13/2019 laprak PCR4
2/11
ISOLASI DNA GENOM, PCR, DAN ELEKTROFORESIS
I! TU"UAN
A. Isolasi DNA genom
- Mahasiswa memahami dan mampu melakukan isolasi DNA genom
B. PCR
- Mahasiswa memahami dan mampu melakukan PCR
- Mahasiswa mampu mengamplifikasi intron III dan I dari hormon
pertum!uhan sapi
C. "lektroforesis
- Mahasiswa memahami dan mampu melakukan elektroforesis
- Mahasiswa menentukan !erat molekul sampel DNA
II! DASAR TEORI
Isolasi DNA #enom adalah $ara untuk mendapatkan strain murni dari
suatu sum!u seperti spesimen klinis %ang mungkin telah men&adi !agian dari
$ampuran kultur primer ' Dorland()**+ ,.
PCR 'Pol%merase Chain Rea$tion, merupakan suatu teknik %ang
didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik dimana ter&adi
penggandaan ¨ah molekul DNA pada setiap siklusn%a dalam waktu %ang
relatif singkat. eknik ini sangat ideal untuk mengidentifikasi patogen dengan
$epat dan akurat. Proses ini dapat dikelompokkan dalam tahap( %aitu
denaturasi 'pemisahan rantai,( annealing 'penempelan, primer dan e/tension
(peman&angan atau polimerisasi).'0atson et al( 122)3Retnoningrum 1224,.
"lektroforesis merupakan proses !ergerakn%a molekul !ermuatan pada
suatu medan listrik. "lektroforesis dapat digunakan untuk separasi
makromolekul 'seperti protein dan asam nukleat,. Posisi molekul %ang
terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau
autoradiografi( ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
"lektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks pen%angga untuk
-
8/13/2019 laprak PCR4
3/11
men$egah ter&adin%a difusi karena tim!uln%a panas dari arus listrik %ang
digunakan. #el poliakrilamid dan agarose merupakan matriks pen%angga
%ang !an%ak dipakai. Bila !erada dalam suatu medan listrik( molekul
!iologi %ang !ermuatan positif akan !ermigrasi ke elektroda negatif dan
se!alikn%a. Prinsip inilah %ang dipakai dalam elektroforesis untuk
memisahkan molekul-molekul !erdasarkan muatann%a.(www.unri.a$.id5&urnal5&urnal,
III! METODE
ALAT DAN A#AN
A. Isolasi DNA genom
Alat:
1. Mikropipet dan tip
). 6entrifuge
. Almari pendingin
7. orte/
Bahan:
1. Darah sapi
). Nuklei l%sis solution
. Protein pre$ipitation
solution
7. DNA reh%dration solution
8. Cell l%sis solution
+. Isopropanol
4. "tanol 4*9
B. PCR
Alat:
1. 6atu set perangkat PCR
). Mikropipet dan tip
Bahan:
1. DNA template 'hasil
isolasi DNA genom, 1 l
). Primer 1 *(8 l
. Primer ) *(8 l7. MgCl)1(8 l
8. a; Buffer )(8 l
+. dNP mi/ *(8 l
4. dd. a; Polimerase *() l
C. "lektroforesis
-
8/13/2019 laprak PCR4
4/11
Alat:
1. 6atu set perangkat
elektroforesis
). Mikropipet dan tip
. ?ampu @
7. Power suppl%
8. Parafilm
Bahan:
1. DNA marker
). DNA sampel
. "thidium Bromida
7. dd
-
8/13/2019 laprak PCR4
5/11
11. Mem!uang supernatan( menarik sisa etanol dengan pipet. Mengering-
udarakan pelet selama 1*-18 menit( sampai pelet !erwarna putih
12.Menam!ahkan 1** l DNA reh%dration solution( mem!iarkan semalam
pada suhu 7C hingga DNA mengalami rehidrasi se$ara sempurna
1. Men%impan hasil isolasi DNA untuk praktikum selan&utn%a
! PCR
1. Ran$ang primer sesuai ke!utuhan. entukan m dari masing-masing
primer untuk menentukan suhu annealing
). Ran$ang siklus %ang akan digunakan( program alat sesuai ran$angan
terse!ut. Ran$angan program untuk praktikum ini adalah
-
8/13/2019 laprak PCR4
6/11
d. Menuangkan ke dalam $etakan lalu mem!iarkan pada suhu kamar
sampai mengeras. #el %ang telah &adi dapat disimpan dalam !uffer
A" sampai digunakan
). Prosedur elektroforesis
a. Men%iapkan tanki elektroforesis( mengisi dengan !uffer A" %ang
telah mengandung "tBr
!. Memasukkan gel ke dalam larutan terse!ut( menarik $om! dari
sumur gel
$. Men$ampur sampel DNA %ang akan dielektroforesis dengan
loading !uffer dan DNA ladder lalu dimasukkan ke sumur-sumur
gel
d. Menutup tanki dan men%am!ungkan dengan power suppl%( pastikan
arah gel tidak ter!alik. Menentukan arus %ang digunakan sekitar
1)*
e. Melakukan proses elektroforesis sampai penanda la&u migrasi
samapi di !agian !awah gel.
f. Mematikan arus listrik( mengangkat gel lalu meletakkan pada
wadah plastik
g. Melihat hasil elektroforesis di !awah paparan sinar @ lalu di!uat
dokumentasin%a
h. Menentukan ukuran DNA sampel dan ¨ahn%a
IV! #ASIL DAN PEMA#ASAN
A! #as&%
-
8/13/2019 laprak PCR4
7/11
! Pem-a.asa(
Proses pertama %ang dilakukan adalah mengisolasi DNA genom dari
sapi. Pada mamalia( DNA !erada pada sel darah putih sehingga untuk
mengisolasin%a dapat dilakukan dengan sentrifugasi ke$epatan rendah( tanpa
harus melakukan penghan$uran fisik. ?angkah selan&utn%a ialah melisiskan sel
darah merah dengan penghan$uran dinding sel dan lapisan pem!ungkus DNA
%aitu dengan pem!erian cell lysis solutionke dalamn%a. emudian dilakukan
sentrifugasi untuk memisahkan DNA dengan de!ris sel. Prosedur sentrifugasi
harus dilakukan dalam keadaan seim!ang( &arak lu!ang antara tempat menaruh
eppendorf satu dengan lainn%a harus sama. 6etelah didapatkan pellet sel darah
putih dari sentrifugasi( langkah selan&utn%a ialah menam!ahkan nuclei lysis
solution untuk melisis inti sel darah putih. 6etelah itu ditam!ahkan protein
precipitation solution untuk mengendapkan protein serta sisa-sisa sel %ang
tidak terpakai. 6entrifugasi kem!ali dan tam!ahkan isopropanol hingga
ter!entuk !enang-!enang putih DNA dan tam!ahkan &uga etanol 4*9.
Isopropanol dan etanol 4*9 ini !erfungsi untuk menarik molekul air dari DNA
sehingga DNA dapat mengendap. ?angkah terakhir %aitu menam!ahkanDNA
rehydration solution pada ta!ung untuk proses rehidrasi pada DNA dan
inku!asikan semalam pada suhu 7C agar proses terse!ut !er&alan sempurna.
6elan&utn%a dilakukan PCR untuk mengamplifikasi DNA. Pada praktikum
ini( %ang diamplifikasi ialah intron III dan I dari hormon pertum!uhan sapi.
eknik PCR ini melalui tiga tahap %aitu denaturasi( annealing primer( dan
ekstensi.
eknik PCR ini diawali dengan penam!ahkan sepasang primer %ang
!erfungsi untuk memper!an%ak sekuens pada DNA template. edua primer
terse!ut ialah #
-
8/13/2019 laprak PCR4
8/11
dapat dilihat dengan proses elektroforesis. Pada praktikum kali ini( &enis
elektroforesis %ang digunakan ialah elektroforesis Gona %aitu menggunakan
media penun&ang %aitu agrose. "lektroforesis %ang dilakukan ialah sistem
horiGontal.
Proses elektroforesis diawali dengan pem!uatan gel se!agai median%a
%aitu agarose dilarutkan ke dalam %ang telah di!uat se!elumn%a %ang terdiri
dari ris Base( asam asetat gla$ial( dan "DA. "DA merupakan salah satu
komposisi pem!entukan gel dan !uffer %ang !erfungsi se!agai salah satu alat
!antu untuk mengalirkan DNA sampel pada !uffer. Pem!erian ethidium
!romida '"tBr, %aitu pewarna %ang dapat men%isip atau interkalasi diantara
!asa DNA pada dua utas DNA %ang !erlainan sehingga pada saat di!awah
paparan sinar @ dapat !erpendar.
6ampel DNA %ang akan dielektroforesis di$ampur dengan loading !uffer(
%ang terdiri dari sukrosa se!agai pem!erat agar sampel dapat tenggelam ke
dasar gel dan tidak mela%ang ke luar dan pewarna %ang menandai kema&uan
proses elektroforesis dan menentukan kapan saatn%a harus menghentikan
proses %aitu Bromophenol !lue '7 k!p,( %lene $%anol '1** !p,( dan =range #
'8* !p,( dan kemudian diletakkan pada parafilm se!elum ditaruh di sumur-
sumur gel. Proses ini &uga menggunakan DNA ladder se!agai marker DNA.
-
8/13/2019 laprak PCR4
9/11
inginkan dalam ¨ah !an%ak meskipun !erasal dari DNA %ang
¨ahn%a sedikit sekali
$. "lektroforesis merupakan teknik pemisahan sen%awa %ang !ermuatan
dengan meletakkan pada suatu medan listrik sehingga ter&adi separasi
material %ang di!edakan !erdasarkan muatan dan ukuran molekul.
DAFTAR PUSTAKA
Dais( ?eonard # et al. 1227.Basic method in Molecular Biology 2nd edition.
Conne$ti$ut: Appleton H ?ange
Al!erts( Bru$e et al. 1227. Biologi molecular Sel edisi ke-2. akarta: #ramedia
=ld( R.0. et al. )**.Prinsip-prinsip Manipulasi Gen. akarta: @I Press
-
8/13/2019 laprak PCR4
10/11
LAMPIRAN
Perhitungan
% a/ J !
log 1** 7(1a J !
log +** 1(>a J !
------------------------------- -
log 15+ )(a
- *(44> )(a
a - *(>
log 1** 7(1a J !
) 7(1 . F *(> J !
) 7(1 . F *(> J !
) F 1(>8> J !
! (>8>
% a/ J !
% ()a J !
-
8/13/2019 laprak PCR4
11/11
% () . F *(> J (>8>
% F 1(*>1+ J (>8>
% )(*7)
Antilog )(*7) )*1(7 !p
% a/ J !
% (88a J !
% (88 . F *(> J (>8>
% F 1(1222 J (>8>
% )(1>82
Antilog )(1>82 18(7 !p
top related