laprak pcr4

8/13/2019 laprak PCR4

1/11

LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI DNA GENOM, PCR, ELEKTROFORESIS

Disusun oleh :

Weda Kusuma

G0007025

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SEELAS MARET

2007


2/11

ISOLASI DNA GENOM, PCR, DAN ELEKTROFORESIS

I! TU"UAN

A. Isolasi DNA genom

- Mahasiswa memahami dan mampu melakukan isolasi DNA genom

B. PCR

- Mahasiswa memahami dan mampu melakukan PCR

- Mahasiswa mampu mengamplifikasi intron III dan I dari hormon

pertum!uhan sapi

C. "lektroforesis

- Mahasiswa memahami dan mampu melakukan elektroforesis

- Mahasiswa menentukan !erat molekul sampel DNA

II! DASAR TEORI

Isolasi DNA #enom adalah $ara untuk mendapatkan strain murni dari

suatu sum!u seperti spesimen klinis %ang mungkin telah men&adi !agian dari

$ampuran kultur primer ' Dorland()**+ ,.

PCR 'Pol%merase Chain Rea$tion, merupakan suatu teknik %ang

didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik dimana ter&adi

penggandaan &umlah molekul DNA pada setiap siklusn%a dalam waktu %ang

relatif singkat. eknik ini sangat ideal untuk mengidentifikasi patogen dengan

$epat dan akurat. Proses ini dapat dikelompokkan dalam tahap( %aitu

denaturasi 'pemisahan rantai,( annealing 'penempelan, primer dan e/tension

(peman&angan atau polimerisasi).'0atson et al( 122)3Retnoningrum 1224,.

"lektroforesis merupakan proses !ergerakn%a molekul !ermuatan pada

suatu medan listrik. "lektroforesis dapat digunakan untuk separasi

makromolekul 'seperti protein dan asam nukleat,. Posisi molekul %ang

terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau

autoradiografi( ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

"lektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks pen%angga untuk


3/11

men$egah ter&adin%a difusi karena tim!uln%a panas dari arus listrik %ang

digunakan. #el poliakrilamid dan agarose merupakan matriks pen%angga

%ang !an%ak dipakai. Bila !erada dalam suatu medan listrik( molekul

!iologi %ang !ermuatan positif akan !ermigrasi ke elektroda negatif dan

se!alikn%a. Prinsip inilah %ang dipakai dalam elektroforesis untuk

memisahkan molekul-molekul !erdasarkan muatann%a.(www.unri.a$.id5&urnal5&urnal,

III! METODE

ALAT DAN A#AN

A. Isolasi DNA genom

Alat:

1. Mikropipet dan tip

). 6entrifuge

. Almari pendingin

7. orte/

Bahan:

1. Darah sapi

). Nuklei l%sis solution

. Protein pre$ipitation

solution

7. DNA reh%dration solution

8. Cell l%sis solution

+. Isopropanol

4. "tanol 4*9

B. PCR

Alat:

1. 6atu set perangkat PCR

). Mikropipet dan tip

Bahan:

1. DNA template 'hasil

isolasi DNA genom, 1 l

). Primer 1 *(8 l

. Primer ) *(8 l7. MgCl)1(8 l

8. a; Buffer )(8 l

+. dNP mi/ *(8 l

4. dd. a; Polimerase *() l

C. "lektroforesis


4/11

Alat:

1. 6atu set perangkat

elektroforesis

). Mikropipet dan tip

. ?ampu @

7. Power suppl%

8. Parafilm

Bahan:

1. DNA marker

). DNA sampel

. "thidium Bromida

7. dd


5/11

11. Mem!uang supernatan( menarik sisa etanol dengan pipet. Mengering-

udarakan pelet selama 1*-18 menit( sampai pelet !erwarna putih

12.Menam!ahkan 1** l DNA reh%dration solution( mem!iarkan semalam

pada suhu 7C hingga DNA mengalami rehidrasi se$ara sempurna

1. Men%impan hasil isolasi DNA untuk praktikum selan&utn%a

! PCR

1. Ran$ang primer sesuai ke!utuhan. entukan m dari masing-masing

primer untuk menentukan suhu annealing

). Ran$ang siklus %ang akan digunakan( program alat sesuai ran$angan

terse!ut. Ran$angan program untuk praktikum ini adalah


6/11

d. Menuangkan ke dalam $etakan lalu mem!iarkan pada suhu kamar

sampai mengeras. #el %ang telah &adi dapat disimpan dalam !uffer

A" sampai digunakan

). Prosedur elektroforesis

a. Men%iapkan tanki elektroforesis( mengisi dengan !uffer A" %ang

telah mengandung "tBr

!. Memasukkan gel ke dalam larutan terse!ut( menarik $om! dari

sumur gel

$. Men$ampur sampel DNA %ang akan dielektroforesis dengan

loading !uffer dan DNA ladder lalu dimasukkan ke sumur-sumur

gel

d. Menutup tanki dan men%am!ungkan dengan power suppl%( pastikan

arah gel tidak ter!alik. Menentukan arus %ang digunakan sekitar

1)*

e. Melakukan proses elektroforesis sampai penanda la&u migrasi

samapi di !agian !awah gel.

f. Mematikan arus listrik( mengangkat gel lalu meletakkan pada

wadah plastik

g. Melihat hasil elektroforesis di !awah paparan sinar @ lalu di!uat

dokumentasin%a

h. Menentukan ukuran DNA sampel dan &umlahn%a

IV! #ASIL DAN PEMA#ASAN

A! #as&%


7/11

! Pem-a.asa(

Proses pertama %ang dilakukan adalah mengisolasi DNA genom dari

sapi. Pada mamalia( DNA !erada pada sel darah putih sehingga untuk

mengisolasin%a dapat dilakukan dengan sentrifugasi ke$epatan rendah( tanpa

harus melakukan penghan$uran fisik. ?angkah selan&utn%a ialah melisiskan sel

darah merah dengan penghan$uran dinding sel dan lapisan pem!ungkus DNA

%aitu dengan pem!erian cell lysis solutionke dalamn%a. emudian dilakukan

sentrifugasi untuk memisahkan DNA dengan de!ris sel. Prosedur sentrifugasi

harus dilakukan dalam keadaan seim!ang( &arak lu!ang antara tempat menaruh

eppendorf satu dengan lainn%a harus sama. 6etelah didapatkan pellet sel darah

putih dari sentrifugasi( langkah selan&utn%a ialah menam!ahkan nuclei lysis

solution untuk melisis inti sel darah putih. 6etelah itu ditam!ahkan protein

precipitation solution untuk mengendapkan protein serta sisa-sisa sel %ang

tidak terpakai. 6entrifugasi kem!ali dan tam!ahkan isopropanol hingga

ter!entuk !enang-!enang putih DNA dan tam!ahkan &uga etanol 4*9.

Isopropanol dan etanol 4*9 ini !erfungsi untuk menarik molekul air dari DNA

sehingga DNA dapat mengendap. ?angkah terakhir %aitu menam!ahkanDNA

rehydration solution pada ta!ung untuk proses rehidrasi pada DNA dan

inku!asikan semalam pada suhu 7C agar proses terse!ut !er&alan sempurna.

6elan&utn%a dilakukan PCR untuk mengamplifikasi DNA. Pada praktikum

ini( %ang diamplifikasi ialah intron III dan I dari hormon pertum!uhan sapi.

eknik PCR ini melalui tiga tahap %aitu denaturasi( annealing primer( dan

ekstensi.

eknik PCR ini diawali dengan penam!ahkan sepasang primer %ang

!erfungsi untuk memper!an%ak sekuens pada DNA template. edua primer

terse!ut ialah #


8/11

dapat dilihat dengan proses elektroforesis. Pada praktikum kali ini( &enis

elektroforesis %ang digunakan ialah elektroforesis Gona %aitu menggunakan

media penun&ang %aitu agrose. "lektroforesis %ang dilakukan ialah sistem

horiGontal.

Proses elektroforesis diawali dengan pem!uatan gel se!agai median%a

%aitu agarose dilarutkan ke dalam %ang telah di!uat se!elumn%a %ang terdiri

dari ris Base( asam asetat gla$ial( dan "DA. "DA merupakan salah satu

komposisi pem!entukan gel dan !uffer %ang !erfungsi se!agai salah satu alat

!antu untuk mengalirkan DNA sampel pada !uffer. Pem!erian ethidium

!romida '"tBr, %aitu pewarna %ang dapat men%isip atau interkalasi diantara

!asa DNA pada dua utas DNA %ang !erlainan sehingga pada saat di!awah

paparan sinar @ dapat !erpendar.

6ampel DNA %ang akan dielektroforesis di$ampur dengan loading !uffer(

%ang terdiri dari sukrosa se!agai pem!erat agar sampel dapat tenggelam ke

dasar gel dan tidak mela%ang ke luar dan pewarna %ang menandai kema&uan

proses elektroforesis dan menentukan kapan saatn%a harus menghentikan

proses %aitu Bromophenol !lue '7 k!p,( %lene $%anol '1** !p,( dan =range #

'8* !p,( dan kemudian diletakkan pada parafilm se!elum ditaruh di sumur-

sumur gel. Proses ini &uga menggunakan DNA ladder se!agai marker DNA.


9/11

inginkan dalam &umlah !an%ak meskipun !erasal dari DNA %ang

&umlahn%a sedikit sekali

$. "lektroforesis merupakan teknik pemisahan sen%awa %ang !ermuatan

dengan meletakkan pada suatu medan listrik sehingga ter&adi separasi

material %ang di!edakan !erdasarkan muatan dan ukuran molekul.

DAFTAR PUSTAKA

Dais( ?eonard # et al. 1227.Basic method in Molecular Biology 2nd edition.

Conne$ti$ut: Appleton H ?ange

Al!erts( Bru$e et al. 1227. Biologi molecular Sel edisi ke-2. akarta: #ramedia

=ld( R.0. et al. )**.Prinsip-prinsip Manipulasi Gen. akarta: @I Press


10/11

LAMPIRAN

Perhitungan

% a/ J !

log 1** 7(1a J !

log +** 1(>a J !

------------------------------- -

log 15+ )(a

- *(44> )(a

a - *(>

log 1** 7(1a J !

) 7(1 . F *(> J !

) 7(1 . F *(> J !

) F 1(>8> J !

! (>8>

% a/ J !

% ()a J !


11/11

% () . F *(> J (>8>

% F 1(*>1+ J (>8>

% )(*7)

Antilog )(*7) )*1(7 !p

% a/ J !

% (88a J !

% (88 . F *(> J (>8>

% F 1(1222 J (>8>

% )(1>82

Antilog )(1>82 18(7 !p

laprak pcr4

Documents