17. prinsip pemeriksaan imunologi
Post on 16-Dec-2015
366 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
-
Prinsip imunologi pada pemeriksaan
laboratorium klinik
Dewi K Paramita
Deparment of Histology and Cell Biology Faculty of Medicine UGM
-
Prinsip imunologi pada pemeriksaanlaboratorium klinik
1. Prinsip pengenalan antigen oleh antibodi padabeberapa teknik pemeriksaan imunologi
2.Berbagai macam labeling dan deteksi padapemeriksaan dengan teknik imunologi
3. Contoh deteksi dengan imunohistokimia danimmunofluorescence assay
-
Teknik Imunologi (immunoassay)
Metode deteksi antigen / protein dalam sel, jaringan atauprotein terlarut oleh antibodi sebagai reagen spesifik(interaksi antigen-antibodi) yang divisualisasi denganmarker yang dilabel pada antibodi, misalnya pewarnafluorescent, enzim atau partikel emas, dll.
-
Prinsip teknik imunologi
Deteksi antigen/protein:antigen dikenali olehantibodi (Ab) spesifiksebagai probe
Molekul antibodi tidaknampak divisualisasidengan label
-
Antibodi
Daerah pengenalan spesifikterhadap antigen
Species specific
-
Sumber antigen/protein yang akan dideteksi
Sel
Jaringan
Protein terlarut (dalam darah blood, serum, cairantubuh)
-
Macam teknik pemeriksaan imunologi & sumber antigen
Sumber antigen Teknik imunodeteksi
Jaringan Imunohistochemistry (IHC)
Protein terlarut ELISA
Immunoblotting
immunoprecipitation
Sel FACS
IFA
-
Komponen penting pada teknikimunologi
antigen
Antibodi primer
Antibodi sekunder (jika perlu)
Label : Enzim, fluorescence, dll
Larutan pewarna (kromogen) and substrat
-
Metode dasar pada teknik imunologi
Direct
Indirect
Sandwich
-
Direct method (metode langsung)
Label pada antibodiprimer
Keuntungan:
Cepat
Spesifik
Kerugian:
Perlu antobodi primer dalam jumlah banyak
antigen
-
Indirect method (metode tidak langsung)
Label pada antibodi sekunder
Keuntungan
Lebih sensitif
Antibodi sekunder dapatdigunakan untuk bermacam-macam immunoassay (jikaantibodi primer dari spesiesyang sama)
Kerugian:
Reaksi silang antibodi sekunderdengan Ig endogenous padaspesimen
antigen
-
Capture atau Sandwich (ELISA)
Untuk mendeteksi substansiyang jumlahnya sangat kecil, contoh: sitokin
Antibodi primer spesifik yang mengenali antigen dilekatkanpada plate
-
Faktor penting pada teknik imunologi
Pengenceran antibodi (konsentrasi antibodi)
Inkubasi antibodi
Waktu
Suhu
Enzim & substrat, fluorochrom & filter
Kontrol positif
Kontrol negatif
-
Label pada immunoassay
Label
Radioaktif
Coloidal gold
Virus particle
Ferritin
Fluorescent
Enzyme
-
Label pada immunoassay
Immunoassay Label
Westernblotting Enzim (HRP atau alkalinephosphatase)
ELISA Enzim, biotin/streptavidine
Immunofluorescence Fluorescence dyes
Immunohistochemistry Enzim, biotin/streptavidine
Flowcytometri Fluorescence, dyes, tandem dyes
-
Pemilihan deteksi antibodi:direct atau indirect
-
Pemilihan deteksi antibodi:direct atau indirect
Direct:label pada antibodi primer
Aplikasi : flow cytometri
Keuntungan:
Lebih spesifikbackground staining lebihsedikit
Indirect: Label pada antibodi sekunder
Aplikasi : imunostaining
Keuntungan:
Lebih sensitif amplifikasi sinyalsignifikan
Aplikasi lebih felksibel label dapat bermacam-macam
Label dapat berupa fluorescence, biotin, atau enzim yang dikonjugasi pada antibodisekunder.
Kerugian:
Background lebih tingginonspecific binding dari antibodiprimer dan sekunder
-
Keuntungan & kerugianDirect v.s. Indirect
-
Bagian dari antibodi yang di label
Gugus amin primer (-NH2) pada residulisin di daerah N terminus.
Gugus sulfuhydril (-SH) pada residusistein terbentuk secara selektif padaikatan bisulfid di daerah hinge region
Residu karbohidrat yang mengandung cis-diol dapat dioksidasi (-CHO) menjadialdehid aktif terlokalisasi padadaerah Fc banyak ditemukan padaantibodi poliklonal
-
Pemilihan tipe sinyal untuk deteksi:substrat kolorimetrik atau fluorescence
-
Labeling dengan enzim
Keuntungan : shelf life yang panjang Sensitivitas tinggi Visualisasi langsung tidak membutuhkan alat yang canggih (contoh alat:
spektrofotometer) Dibanding label radioaktif tidak berbahaya Label enzim yang kecil dapat melewati membranmemungkinkan untuk
deteksi intraseluler Visualisasi enzim dengan substrat dapat bertahan lama hingga bertahun-
tahun Kerugian :
Melibatkan multiple assay steps Kadang menggunakan sustrat yang berbahaya Memungkinakan adanya gangguan dari enzim endogenus Enzim memberikan resolusi yang buruk pada
Rekomendasi aplikasi : imunohistokimia, imunoblot dan immunoassay kuantitatif dankualitatif.
-
Labeling dengan enzim
-
Labeling dengan enzim:HRP v.s AP
HRP AP
Ukuran 40 kDa 140 kDa
Harga Relatif murah Relatif mahal
Stabilitas(penyimpanan)
Stabil pada suhu< 0C
Tidak stabil padasuhu < 0C
Macam substrat Banyak Sedikit/terbatas
Kinetika Cepat lambat
pH 5-7 8-10
Horseradish peroxidase (HRP) v.s Alkaline phosphatase (AP)
-
Labeling dengan biotin
Biotin adalah vitamin dengan berat 244 dalton
Banyak ditemukan di jaringan dan darah
Mempunyai afinitas yang besar dengan protein avidin, streptavidin ikatan terjadi cepat dan tidakterganggu dengan perubahan pH extrem, pelarutorganik dan agen denaturasi lain.
Molekul kecil dapat dikonjugasi dengan banyakprotein tanpa mengganggu aktivitas protein tersebut
-
Labeling dengan biotin:IHC Avidin-biotin method
ABC method LSAB method
-
Labeling dengan fluorescent
Molekul antibodi dapatdilabel dengan berbagaimacam probe flourecent
Setiap probe fluorescent mempunyai spektrumsinyal eksitasi dan emisi
Contoh labeling dengan fluoresceinisothiocyanate (FITC)
-
Fluorescenct probes
The maximum excitation and emission wavelength of
commonly used fluorescent probes
-
Contoh metode imunohistokimia danimmunofluorescence assay
EBNA1-IHC (OT1x Mab)
LMP1-IHC (OT21C Mab)
VCA-p18-IHC (OT15E Mab)
-
Contoh Prosedur imunohistokimiaLABELED STREPTAVIDIN-BIOTIN Method
I. Deparafinisation
Xylene (2 x 10 mins)
Ethanol absolute (2 x 5 mins)
95% ethanol (2 x 5 mins)
II. H2O2/ methanol (15 mins)
RINSE with DISTILLED WATER
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
III. Antigen Retrieval
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
IV. Blocking solution (10 min)
(Normal non-immune serum)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
V. IHC staining proper
Primary Antibody (variable)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
Biotinylated Link Antibody (30 mins)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
Streptavidine-Peroxidase (30 mins)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
DAB/AEC - Chromogens (5-10 mins)
Rinse with water
Hematoxyline
Rinse with water (dan/ atau dehidrasi)
Mounting
-
Meminimalisir background staining
Bloking aktivitas endogenous peroxidase
peroxidase dan pseudo-peroxidase pada jaringan normal dan tumor
-
Contoh Prosedur imunohistokimiaLABELED STREPTAVIDIN-BIOTIN Method
I. Deparafinisation
Xylene (2 x 10 mins)
Ethanol absolute (2 x 5 mins)
95% ethanol (2 x 5 mins)
II. H2O2/ methanol (15 mins)
RINSE with DISTILLED WATER
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
III. Antigen Retrieval
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
IV. Blocking solution (10 min)
(Normal non-immune serum)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
V. IHC staining proper
Primary Antibody (variable)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
Biotinylated Link Antibody (30 mins)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
Streptavidine-Peroxidase (30 mins)
Tris buffer wash (2 x 10 mins)
DAB/AEC - Chromogens (5-10 mins)
Rinse with water
Hematoxyline
Rinse with water (dan/ atau dehidrasi)
Mounting
-
Meminimalisir background staining
Bloking non-specific background staining
Paling sering terjadi: Protein melekat pada kolagen & jaringan ikat diatasi denga pemberian non-immune serum
Sebab lain : pengenceran antibodi yang tidak tepat(terlalu pekat), langkah pencucian yang tidak tepat, langkah deparafinisasi yang tidak tepat.
U
-
Immunoassay with fluorescence labeled
Immunofluorescence assay (IFA): teknik imunostainingdengan label fluorescence pengamatan denganmikroskop fluorescence
Floocytometri
-
Immunofluorescence Assay
Labeled antibody with a fluorescence visible marker: i.e. Fluorescein isothianate
(FITC)
Disadvantage: Limited to frozen sections
Requires special microscopy
Poor morphologic resolution
Fluorescence is ephemeral, result have to be photographed
-
TERI MA KASIH
deardesay@yahoo.com
top related